山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏幼鼠腸道功能的影響

劉 飛，郝婧宇，趙子夫，司徒文佑,3，段素芳,3,*，霍貴成，哈 惠

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，伊利母嬰營養(yǎng)研究院，北京 100022）

聯(lián)合國兒童基金會在《2019年世界兒童狀況》報告中提出，目前在全球出現(xiàn)的兒童營養(yǎng)不良主要有3 大形態(tài)：營養(yǎng)不足、隱性饑餓和超重。全球超過7億的5 歲以下兒童中約1/3正處于營養(yǎng)不足或超重狀態(tài)，至少半數(shù)因維生素和其他必需營養(yǎng)素的攝入不足而遭受隱性饑餓的困擾。營養(yǎng)不良主要由低質(zhì)量的兒童膳食引起，約2/3的兒童日常飲食未達到保障健康生長發(fā)育膳食多樣性的最低推薦。因此，用微量營養(yǎng)素強化輔助食品與主糧可作為一項對抗兒童、年輕人與婦女隱性饑餓的有效干預(yù)措施。

中國兒童隱性饑餓的營養(yǎng)不良問題普遍存在，與食欲和能量代謝密切相關(guān)的維生素如VB、VB、VB和VA，中國4～13 歲兒童的攝入不足率分別約為27%、78%、77%和48%，維生素的缺乏易導(dǎo)致食欲低下、消化不良或中醫(yī)概念上的脾虛癥狀。山楂具有健脾開胃、消食化滯的功效，山楂中的有機酸是消食導(dǎo)滯的主要活性成分。麥芽也具有消食、健脾和開胃的助消化作用?！吨腥A人民共和國藥典（2020年版）》中規(guī)定，當用于行氣消食、健脾開胃即促進消化時，山楂用量為9～12 g、麥芽用量為10～15 g。目前許多研究結(jié)果表明膳食纖維具有多種生理保健功能，與人體健康密切相關(guān)，可通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝間接調(diào)控腸胃功能。缺乏膳食纖維會引發(fā)多種疾病，如大腸炎、結(jié)直腸癌、過敏、自身免疫疾病及肥胖，膳食纖維過量又會影響身體健康。我國成人（19～50 歲）膳食纖維建議攝入量為25～30 g/d，14 歲以下兒童按照10 g/4 185.85 kJ計算，學(xué)齡前期兒童膳食纖維適宜攝入量為12～14 g/d。低聚木糖和聚葡萄糖都屬于水溶性膳食纖維，可以很方便地被添加到多種食品中，其在小腸中不能被消化或吸收，幾乎完好無損地到達結(jié)腸并在大腸中被發(fā)酵，導(dǎo)致糞便變軟且體積增加，同時促進腸道運動，縮短腸道內(nèi)容物通過腸道的時間。低聚木糖和聚葡萄糖在宿主大腸內(nèi)的發(fā)酵可優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致有益菌群豐度增加、腐敗菌群減少和短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）產(chǎn)量增加。研究發(fā)現(xiàn)，進食0.7 g/d低聚木糖3 周后腸內(nèi)雙歧桿菌相對豐度可由8.5%增至20.2%，若進食劑量增加至1.4 g/d，則雙歧桿菌相對豐度可由9.3%增至37.4%。低聚木糖和聚葡萄糖還能夠改善宿主腸道組織形態(tài)，增加小腸絨毛高度，提高小腸絨毛高度與隱窩深度比值，從而有助于宿主營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進腸道健康。有研究表明健康成人進食4～12 g/d聚葡萄糖28 d后，腸道內(nèi)SCFA含量、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度會增加，同時能改進腸道功能。

針對兒童微量營養(yǎng)成分隱性饑餓問題，有必要評估某些具有健脾功效的藥食成分及膳食纖維對機體腸道功能的調(diào)控作用。目前，鮮有山楂和麥芽對維生素缺乏幼鼠腸蠕動性的影響，及山楂、麥芽和低聚糖復(fù)合物通過調(diào)控維生素缺乏宿主腸道微生態(tài)的平衡來改善其腸道吸收功能的相關(guān)報道。因此，本研究以斷奶鼠為模型動物，旨在評估在維生素缺乏狀態(tài)下，山楂、麥芽及其與低聚糖復(fù)合物對斷奶鼠腸道功能的作用，重點研究各種受試物組合干預(yù)對幼鼠生長性能、腸道組織形態(tài)和吸收功能、糞便中關(guān)鍵微生物組成和SCFA含量的影響，為新型功能食品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

3 周斷奶SPF級雄性ICR小鼠（合格證編號1100111911061447，體質(zhì)量12～14 g）、3 周斷奶SPF級雄性SD大鼠（合格證編號1100111911061449，體質(zhì)量40～60 g）均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。本研究中動物實驗方案由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物倫理委員會批準（NEAU20200113）。

山楂粉 黃山華綠園生物科技有限公司；AIN-93G純合飼料、特配飼料 南通特洛菲飼料有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸 德國Sigma公司；麥芽粉 上海金山德樂食品配料有限公司；低聚木糖、聚葡萄糖 山東百龍創(chuàng)園生物科技股份有限公司；復(fù)方地芬諾酯 河南鼎昌藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890氣相色譜儀、5977B質(zhì)譜儀、DB-FFAP色譜柱（15 m×250 μm，0.25 μm） 美國Agilent公司；E600光學(xué)倒置顯微鏡 日本尼康公司；680型酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組與飼養(yǎng)

參考《保健食品功能評價方法（2020年版）（征求意見稿）》中“十六、有助于消化功能檢驗方法”中的要求采用小鼠進行小腸運動實驗，其余指標的檢測均采用大鼠進行實驗。

各處理組干預(yù)物的添加量按照檢驗方法中的要求，“以人體推薦量（折算為每千克體質(zhì)量的劑量）的10 倍（小鼠）或5 倍（大鼠）為其中的一個劑量組”。根據(jù)藥典中的推薦量確定本實驗中體質(zhì)量70 kg成人山楂和麥芽的低劑量組使用量均為10 g/d?！吨袊鵂I養(yǎng)科學(xué)全書》中推薦的學(xué)齡前兒童每日膳食纖維攝入量為12～14 g/d，同時食物中營養(yǎng)素的添加量一般以膳食營養(yǎng)素推薦攝入量的1/3～1/2為宜，因此確定本實驗中膳食纖維的總用量為4 g，然后根據(jù)文獻進一步確定低劑量組低聚木糖和聚葡萄糖的使用量分別為0.7 g/d和3.3 g/d。根據(jù)文獻[16]可知，4～5 歲兒童的體質(zhì)量中位數(shù)為19 kg，由此分別計算出低劑量組中低聚木糖和聚葡萄糖的添加量?；趹?yīng)用特性考慮，確定高劑量組山楂和麥芽的添加量為低劑量組的5 倍。為研究添加超過每日推薦劑量的膳食纖維是否能夠進一步改善腸道功能，將高劑量組低聚木糖和聚葡萄糖添加量增加至低劑量組的4 倍，該劑量接近低聚木糖和聚葡萄糖批準使用劑量上限。

所有動物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)動物房中，溫度22 ℃，相對濕度10%～60%，光照周期為12 h。60 只3 周斷奶大鼠自由采食，自由飲水，AIN-93G純合日糧適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按照體質(zhì)量隨機分成6 組，每組10 只大鼠，每2 只養(yǎng)于一籠，正式實驗期為5 周，具體處理及分組見表1。稱量大鼠初始體質(zhì)量、實驗結(jié)束時空腹體質(zhì)量，計算整個實驗結(jié)束時大鼠的體質(zhì)量增量，記錄攝食量，觀察鼠狀態(tài)，食物利用率計算如式（1）所示。

表1 大鼠、小鼠實驗處理與分組Table 1 Feeding and grouping of experimental rats and mice

采取特配飼料喂飼方式給予實驗動物干預(yù)物。根據(jù)以往經(jīng)驗，以每周末大鼠和小鼠的體質(zhì)量及攝食量作為依據(jù)，計算飼料中干預(yù)物添加量，分別配制整個周期大鼠和小鼠所用飼料。采用GB 5009.84—2016《食品安全國家標準 食品中維生素B的測定》、GB 5009.85—2016《食品安全國家標準 食品中維生素B的測定》、GB 5009.154—2016《食品安全國家標準 食品中維生素B的測定》和GB 5009.82—2016《食品安全國家標準 食品中維生素A、D、E的測定》中的第一法分別檢測山楂和麥芽中VB、VB、VB含量和VA含量，結(jié)果表明本實驗所采用山楂中不含VB、VB、VB和VA，麥芽中VB、VB、VB含量和VA含量分別為2.92、2.68、9.76 mg/kg和0 mg/kg。按照大鼠最高劑量添加組（3.5 g/（kg·d））計算，山楂和麥芽中VB、VB含量和VB含量分別僅占K組和M組相應(yīng)維生素含量差值的0.3%、0.2%和0.6%，因此干預(yù)物山楂和麥芽中殘留的維生素對維生素缺乏模型幼鼠的影響可以忽略不計。

1.3.2 小鼠腸運動實驗

70 只3 周斷奶小鼠飼養(yǎng)條件同大鼠，純合日糧適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將其隨機分成7 組（每組10 只，5 只一籠），進入為期4 周的正式實驗，具體處理及分組見表1。第29天進行腸運動實驗檢測，實驗開始前小鼠禁食16 h，自由飲水。檢測當天各組正常灌胃，灌胃30 min后K組灌胃同體積蒸餾水，其余各組均灌胃復(fù)方地芬諾酯（質(zhì)量分數(shù)0.025%）。灌胃復(fù)方地芬諾酯30 min后，各組灌胃墨汁（含質(zhì)量分數(shù)5%活性炭粉、質(zhì)量分數(shù)10%阿拉伯樹膠），25 min后頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔，剪取幽門至回盲部的腸管。將小腸拉成直線，測量腸管長度作為小腸總長度，從幽門至炭末前沿的距離作為墨汁推進長度，按式（2）計算墨汁推進率。

1.3.3 大鼠糞便收集和剖檢取樣

大鼠干預(yù)實驗進行34 d后，采集所有大鼠糞便，裝于無菌凍存管中，液氮速凍后在-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)SCFA含量（乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸）和腸道菌群高通量測序分析。隨后禁食24 h，自由飲水，采用乙醚麻醉后斷頸處死大鼠，使用體積分數(shù)75%乙醇溶液擦拭大鼠腹部，使用消毒后的手術(shù)剪打開大鼠腹腔，迅速分離空腸、回腸用于組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.4 大鼠腸道組織形態(tài)學(xué)指標觀察

取空腸及回腸各1 cm浸泡于質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛中，隨后進行石蠟包埋和制備切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE)染色后采用軟件Image-Pro Plus 6.0進行形態(tài)觀察，比較不同處理組大鼠小腸組織的形態(tài)差異，包括腸絨毛高度、黏膜隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度（villus height/crypt depth，V/C）值、腸絨毛光滑度和排列整齊度。

1.3.5 大鼠糞便中SCFA含量的測定

參照本實驗室前期研究方法，利用氣相色譜-質(zhì)譜法，通過內(nèi)標法分析樣品中SCFA含量。采用安捷倫DB-FFAP毛細管柱（15 m×250 μm，0.25 μm），進樣量1 μL，分流比5∶1；載氣氦氣，隔墊吹掃流速3 mL/min，柱流速1 mL/min。柱箱升溫程序：初始溫度80 ℃，保持1 min；以10 ℃/min的速率升至180 ℃，保持1 min；然后以20 ℃/min的速率升至240 ℃，保持5 min。前進樣口溫度、傳輸線溫度、離子源和四極桿的溫度分別為240、240、230 ℃和150 ℃。電離電壓-70 eV，在溶劑延遲2.5 min后，以掃描/模擬模式獲得質(zhì)量范圍為/33～150的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.3.6 大鼠腸道菌群分析

大鼠糞便送至深圳華大基因股份有限公司，采用Illumina MiSeq測序平臺，通過檢測腸道菌群16S rRNA V3～V4高變區(qū)域基因序列分析大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)。獲得原始測序數(shù)據(jù)后，首先進行序列過濾和拼接，得到有效數(shù)據(jù)，使用USEARCH軟件進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，從同一OTU中挑選出豐度最高的一條序列作為OTU代表序列。應(yīng)用QIIME軟件將該代表序列與Silva 132數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得物種注釋信息，并進行Alpha多樣性分析，獲得樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息。利用LEfSe（linear discriminant analysis effect size）分析對分組樣品的物種組成進行差異顯著性檢驗，隨后采用PICRUSt軟件預(yù)測微生物功能，并利用STAMP軟件比較組間的功能差異。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

除特別注明外，實驗結(jié)果以平均值±標準差表示。采用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，首先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較差異性，數(shù)據(jù)先進行方差齊次檢驗，方差齊時采用Duncan’s法對數(shù)據(jù)進行多重比較分析，方差不齊時采用Games-Howell進行數(shù)據(jù)之間的比較分析；對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis秩和檢驗；＜0.05為差異顯著。采用Origin 8.5軟件和R語言繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏幼鼠狀態(tài)的影響

實驗過程中，T4組大、小鼠均有多只動物出現(xiàn)稀便、軟便及脫毛癥狀，其中小鼠在干預(yù)第2天即出現(xiàn)稀便，在第18天全部恢復(fù)正常。大鼠在干預(yù)第8天出現(xiàn)軟便癥狀，干預(yù)第29天稀便和軟便大鼠數(shù)開始增多，至第35天10 只大鼠均出現(xiàn)稀便和軟便癥狀，4 只大鼠耳后脫毛。其余各處理組無上述癥狀。糞便狀態(tài)可反映動物的消化功能，稀便和軟便癥狀可能是由于維生素缺乏導(dǎo)致大鼠食欲低下，消化不良。徐瑤研究發(fā)現(xiàn)，食積模型大鼠會出現(xiàn)皮毛無光澤、大便色黃黏膩不成形的現(xiàn)象。而脫毛癥狀的出現(xiàn)表明攝入過量的低聚糖可能加劇了維生素缺乏的癥狀。

2.2 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠體質(zhì)量的影響

如圖1所示，所有處理組大鼠初始體質(zhì)量均為90～100 g，無顯著差異（＞0.05），經(jīng)5 周4 種促進消化干預(yù)物飼喂實驗后，K、M、T1、T2、T3組和T4組大鼠的最終體質(zhì)量均值分別為368.62、275.91、282.10、301.93、292.72 g和291.16 g，體質(zhì)量增量均值分別為270.68、177.86、184.30、204.13、195.63 g和193.25 g。所有飼喂維生素缺乏飼料處理組大鼠的最終體質(zhì)量和體質(zhì)量增量均顯著低于飼喂維生素含量正常飼料的K組（＜0.05）。與K組相比，M組大鼠的體質(zhì)量增量降低了34.29%。與M組相比，T2處理組大鼠的體質(zhì)量增量增加了14.77%，顯著提高了大鼠的體質(zhì)量增量（＜0.05）。結(jié)果表明維生素缺乏會顯著延緩成長期動物的生長發(fā)育，導(dǎo)致體質(zhì)量降低，而飼喂高劑量山楂和麥芽能夠顯著緩解維生素缺乏引起的體質(zhì)量降低。山楂中的有機酸主要包括檸檬酸和蘋果酸等水溶性有機酸，具有助消化、健胃消食的作用，本研究采用的山楂粉中有機酸（以檸檬酸計）相對含量為6.4%。麥芽有消食行氣、健脾開胃的功效，是臨床上常見的一味消食藥。徐瑤研究發(fā)現(xiàn)山楂和麥芽具有改善食積癥狀的功能，能夠促進食積模型大鼠的體質(zhì)量增長。因此，T2組大鼠的體質(zhì)量增量顯著增加，可能是由于山楂和麥芽的促消化作用緩解了維生素缺乏對大鼠生長發(fā)育的抑制作用。

圖1 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠體質(zhì)量的影響Fig. 1 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on body mass in vitamin-deficient rats

2.3 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠攝食量和食物利用率的影響

如圖2所示，K組大鼠攝食量顯著高于所有其他處理組（＜0.05），維生素缺乏會顯著降低大鼠攝食量，其中M組大鼠攝食量較K組降低了17.78%，T2組大鼠飼喂高劑量山楂和麥芽能夠提高攝食量，與M組相比提高了7.84%。在自由采食等能量日糧情況下，攝食量反映了動物的食欲和健康狀況。消化不良會導(dǎo)致食欲減退、攝食量減少，進而使體質(zhì)量減輕，反之亦然。T2組大鼠攝食量和體質(zhì)量增量與M組相比均顯著增加（＜0.05），說明高劑量山楂和麥芽具有改善維生素缺乏大鼠食欲的作用。然而高劑量4 種復(fù)合物對維生素缺乏大鼠的攝食量和體質(zhì)量增量沒有顯著改善作用，結(jié)合T4組大鼠排稀便和脫毛現(xiàn)象分析，這可能是由于在攝入高劑量山楂和麥芽的同時攝入過多的膳食纖維，導(dǎo)致大鼠腸道微生物多樣性降低，破壞腸道菌群平衡，從而影響腸道吸收功能。

圖2 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠攝食量的影響Fig. 2 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on food intake in vitamin-deficient rats

食物利用率可判斷動物體質(zhì)量降低是由于進食減少，還是受試物的影響。由圖3可知，維生素缺乏會顯著降低大鼠的食物利用率（＜0.05），與K組相比，M組大鼠食物利用率降低了19.24%。T3組大鼠較M組的食物利用率顯著增加了11.58%（＜0.05），但仍顯著低于飼喂正常飼料的K組（＜0.05），這可能是由于低劑量的低聚木糖改善了腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進了營養(yǎng)物質(zhì)吸收，從而提高了食物利用率。

圖3 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠食物利用率的影響Fig. 3 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on feed utilization rate in vitamin-deficient rats

2.4 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏小鼠小腸腸道運動性的影響

由圖4可知，與M組相比，T1組和T3組維生素缺乏小鼠的腸道運動性沒有顯著變化（＞0.05），T2組和T4組維生素缺乏小鼠的墨汁推進率顯著提高了39.04%和21.10%（＜0.05）。T5組應(yīng)用復(fù)方地芬諾酯人為減慢小鼠的腸運動性，復(fù)方地芬諾酯能夠通過抑制腸道黏膜感受器，消除局部黏膜的蠕動反射，從而減弱腸道平滑肌的蠕動，導(dǎo)致腸道內(nèi)容物與腸黏膜接觸時間變長，腸道內(nèi)容物中的水分進一步被吸收而使糞便干燥，常被用于便秘小鼠模型的造模。因此，根據(jù)實驗結(jié)果可知，T2組和T4組干預(yù)物都能夠提高維生素缺乏小鼠腸道的運動性，與K組相比，T2組小鼠的墨汁推進率顯著增加17.77%（＜0.05）。溫小萍等研究表明，山楂水提物對大鼠胃、腸平滑肌的收縮具有顯著的刺激作用，且呈顯著劑量依賴性；雷靜等也發(fā)現(xiàn)中、高劑量的山楂水提取物使小鼠小腸推進率分別顯著提高了26.88%（＜0.05）和28.00%（＜0.01），這與本研究結(jié)果一致。

圖4 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏小鼠腸道運動性的影響Fig. 4 Effect of hawthorn, malt and dietary fibers on intestinal motility in vitamin-deficient mice

2.5 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠腸道消化吸收能力和組織形態(tài)學(xué)的影響

絨毛和隱窩是衡量小腸消化吸收的重要指標。絨毛高度影響小腸吸收面積，絨毛高度越高，營養(yǎng)物質(zhì)的吸收越好。隱窩深度反映細胞的生成率，隱窩越淺說明細胞成熟率越高，吸收能力越強。V/C值則綜合反映小腸的功能狀態(tài)，比值下降，表示消化吸收功能下降，常伴隨腹瀉的發(fā)生；比值上升，則表示消化吸收能力增強，腹瀉率下降。由圖5可知，雖然維生素缺乏對大鼠小腸隱窩深度沒有影響，但是會顯著降低空腸和回腸絨毛高度以及V/C值（＜0.05），其中空腸和回腸絨毛高度分別較K組降低了25.54%和38.52%，空腸和回腸V/C值分別較K組降低了37.30%和36.79%。而干預(yù)物會不同程度緩解維生素缺乏對空腸和回腸的不良影響，提高維生素缺乏大鼠的消化吸收功能。與M組相比，除T1組維生素缺乏大鼠的空腸絨毛高度沒有顯著變化外（＞0.05），其他處理組維生素缺乏大鼠的空腸絨毛高度均顯著增加（＜0.05），其中T2、T3組和T4組大鼠空腸絨毛高度分別增加了24.57%、39.04%和38.52%。與M組相比，T1組維生素缺乏大鼠的空腸隱窩深度顯著降低了28.72%（＜0.05），雖然其余干預(yù)物處理對大鼠空腸隱窩深度沒有顯著影響（＞0.05），但是最終所有干預(yù)物處理均顯著提高了大鼠空腸V/C值（＜0.05），與M組相比，T1、T2、T3組和T4組分別提高了65.42%、52.65%、47.35%和43.61%，從而改善了維生素缺乏大鼠的小腸吸收功能。所有干預(yù)物處理組的回腸絨毛高度均較M組維生素缺乏大鼠顯著提高（＜0.05），其中T1、T2、T3、T4組回腸絨毛高度分別增加了35.93%、51.34%、50.25%和57.55%；同時，各處理組回腸隱窩深度較M組分別顯著增加了24.17%、28.05%、28.43%和34.97%（＜0.05）。郜航研究發(fā)現(xiàn)低聚木糖能夠顯著提高生長期小鼠的小腸絨毛高度，降低小腸隱窩深度，從而提高小腸V/C值，說明低聚木糖增加了腸道吸收表面積，從而改善了小腸的消化吸收功能。而本研究中低聚木糖處理顯著增加小腸絨毛高度的同時并沒有顯著降低隱窩深度，但是低聚木糖顯著增加了空腸V/C值，從而改善了維生素缺乏大鼠的腸道消化吸收功能。

圖5 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠小腸絨毛高度（A）、隱窩深度（B）和V/C值（C）的影響Fig. 5 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on villus height (A),crypt depth (B) and villus height to crypt depth ratio (C) of jejunum and ileum in vitamin-deficient rats

由圖6、7可知，維生素缺乏會顯著降低小腸絨毛結(jié)構(gòu)的完整性、表面光滑度和排列整齊度。飼喂高劑量山楂和麥芽能明顯改善維生素缺乏大鼠空腸和回腸絨毛結(jié)構(gòu)的完整性，飼喂高劑量4 種復(fù)合物能明顯改善維生素缺乏大鼠空腸絨毛的表面光滑度，飼喂低劑量4 種復(fù)合物處理能明顯改善維生素缺乏大鼠回腸絨毛的排列整齊度。

圖6 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠空腸組織形態(tài)的影響（40×）Fig. 6 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on jejunal morphology of vitamin-deficient rats (40 ×)

圖7 山楂、麥芽及膳食纖維對大鼠回腸組織形態(tài)的影響（40×）Fig. 7 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on ileal morphology of vitamin-deficient rats (40 ×)

2.6 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠糞便中SCFA含量的影響

如表2所示，與K組相比，M組大鼠糞便中總SCFA含量顯著降低了43.87%（＜0.05），不同干預(yù)物處理對維生素缺乏狀態(tài)大鼠糞便中總SCFA含量影響各異；與M組比，T2組和T3組的總SCFA含量分別顯著提高了78.00%和44.91%（＜0.05），且與K組沒有顯著差異（＞0.05），特別是T2組與K組總SCFA含量幾乎相同。然而T4組總SCFA含量與M組相比降低了4.93%。膳食纖維的種類和添加劑量對后腸碳水化合物發(fā)酵功能有顯著影響，低聚木糖和聚葡萄糖在宿主大腸內(nèi)的發(fā)酵可導(dǎo)致SCFA產(chǎn)量增加。有研究表明，健康成年人進食4～12 g/d聚葡萄糖，糞便中總SCFA含量會呈劑量依賴性升高。然而，本研究中膳食纖維攝入過量不能增加維生素缺乏大鼠糞便中的總SCFA含量，反而會導(dǎo)致大鼠腸道菌群失調(diào)，這也與T4組大鼠在實驗期間的頻繁軟便和稀便的生理反應(yīng)相吻合。膳食纖維經(jīng)腸道菌群發(fā)酵后的主要代謝產(chǎn)物是SCFA，主要包括乙酸、丙酸、丁酸以及少量的異丁酸、戊酸、異戊酸。SCFA對宿主代謝、腸道穩(wěn)態(tài)、腸道屏障功能、膽固醇水平等均具有重要調(diào)節(jié)作用，其中乙酸、丙酸和丁酸是后腸最重要的SCFA，含量占總SCFA 80%以上，這3 種SCFA的含量比例會隨著宿主后腸菌群結(jié)構(gòu)和攝入的膳食纖維種類的不同而發(fā)生變化。本研究中與K組相比，M組大鼠糞便中乙酸含量顯著降低了37.63%（＜0.05），丙酸和丁酸含量沒有顯著變化（＞0.05）。與M組相比，T2組和T3組大鼠糞便中乙酸含量分別顯著提高了46.86%和43.74%（＜0.05）；同時T2組丁酸含量與M組相比顯著提高103.58%（＜0.05），甚至高于K組，但差異不顯著（＞0.05）。李國法研究發(fā)現(xiàn)，麥芽纖維經(jīng)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道內(nèi)特定菌群發(fā)酵后能顯著增加SCFAs含量，主要是乙酸、丙酸和丁酸，特別是丁酸既為結(jié)腸黏膜上皮細胞的修復(fù)提供了能量來源，也改善了腸道微生態(tài)環(huán)境，恢復(fù)了腸道菌群平衡，保護腸道黏膜屏障，對潰瘍性結(jié)腸炎起到有效治療作用。本研究結(jié)果表明不同來源和劑量的干預(yù)物對SCFA影響不同，高劑量山楂和麥芽處理及低劑量4 種復(fù)合物處理都能夠改善甚至逆轉(zhuǎn)維生素缺乏導(dǎo)致大鼠糞便中SCFA含量降低的不利趨勢，而高劑量4 種復(fù)合物處理不但沒有緩解作用，反而可能會加劇此不利趨勢。

表2 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠糞便中SCFA含量的影響Table 2 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on SCFA contents in feces of vitamin-deficient rats

2.7 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠腸道菌群的影響

2.7.1 大鼠腸道菌群多樣性

采用Chao1指數(shù)和Observed_species指數(shù)衡量-多樣性。如圖8所示，與M組相比，T4組的Chao1指數(shù)和Observed_species指數(shù)均顯著下降（＜0.05），而T1、T2組和T3組大鼠腸道微生物的-多樣性沒有顯著變化（＞0.05），這說明T4組大鼠腸道微生物多樣性降低。研究表明膳食纖維能夠促進腸道中益生菌的生長，從而調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持正常腸道菌群的穩(wěn)態(tài)。然而，過量攝入膳食纖維會對腸道菌群產(chǎn)生不良影響，有引起菌群失調(diào)的風(fēng)險。本實驗為研究添加超過每日推薦劑量的膳食纖維是否能夠進一步改善腸道功能，將T4組膳食纖維總攝入量設(shè)定為16 g/d，已超過學(xué)齡前期兒童每日膳食纖維適宜攝入量上限14 g/d。結(jié)果表明T4組大鼠腸道菌群多樣性顯著降低，過量攝入膳食纖維引起菌群失調(diào)，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)軟便和稀便。因此，膳食纖維攝入過多可能導(dǎo)致維生素缺乏宿主的腸道菌群多樣性降低，對宿主腸道健康造成不利影響。

圖8 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠腸道菌群α-多樣性的影響Fig. 8 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on α-diversity indexes of intestinal microorganisms in vitamin-deficient rats

2.7.2 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)屬水平的變化

在已鑒定的菌屬中取相對豐度含量排名前30 位的菌屬，比較各組大鼠腸道菌群的差異。如圖9所示，維生素缺乏會使大鼠腸道菌群中不同菌屬的相對豐度發(fā)生變化，如降低擬桿菌屬（）、布勞氏菌屬（）、毛螺菌科中的其他屬（Lachnospiraceae/Other）的豐度，增加、Ruminococcaceae/Other、Ruminococcaceae UCG-005、9的豐度。和毛螺菌科細菌都可以通過產(chǎn)生SCFA來促進宿主腸道健康。與M組相比，T2組和T3組都提高了和乳桿菌屬的豐度，T3組還提高了的豐度。因此，產(chǎn)SCFA相關(guān)菌屬豐度的增加可能是T2組和T3組總SCFA含量顯著較高的原因之一。此外，T3組和T4組都提高了、副擬桿菌屬（）和阿克曼氏菌屬（）的豐度，且豐度的增加幅度與劑量呈正相關(guān)。大多數(shù)擬桿菌和副擬桿菌都能夠降解膳食中多糖產(chǎn)生大量的SCFA，并在其細胞壁表面生成莢膜多糖，從而使其免受宿主和環(huán)境因素的不利影響，進而促進其在腸道中的競爭和適應(yīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)，與M組相比，相對豐度增加的T2組和T3組大鼠糞便中總SCFA含量顯著增加了78.00%和44.91%，但T4組的總SCFA含量降低了4.93%。結(jié)合大鼠腸道菌群-多樣性分析結(jié)果可知，過量攝入聚葡萄糖會使維生素缺乏大鼠腸道菌群中副擬桿菌過度生長，降低了腸道菌群的-多樣性，導(dǎo)致菌群失調(diào)，反而不能增加宿主腸道中總SCFA含量。

圖9 山楂、麥芽及膳食纖維對維生素缺乏大鼠糞便菌群菌屬水平的影響Fig. 9 Effects of hawthorn, malt and dietary fibers on fecal microfloral composition at the genus level in vitamin-deficient rats

2.7.3 大鼠腸道菌群重要系統(tǒng)發(fā)育差異分析

采用LEfSe對所有處理組腸道菌群從門到屬系統(tǒng)發(fā)育水平上進行兩兩比較，基于上述實驗結(jié)果，主要分析T2組與M組間菌群構(gòu)成的顯著差異。圖10A顯示了不同組中豐度差異顯著的物種，柱狀圖長度代表差異物種的影響大小，并通過將差異映射到已知層級結(jié)構(gòu)的分類樹上得到進化分支圖，如圖10B所示。篩選＜0.05、線性辨別分析（linear discriminant analysis，LDA）值大于3的菌群比較，相對于M組，T2組大鼠糞便中桿菌綱乳桿菌屬（）、疣微菌門、Lachnospiraceae UCG_006的豐度顯著增加；變形菌門（Desulfovibrionaceae）豐度顯著降低。乳桿菌是腸道中常見的有益菌，劉永濤等發(fā)現(xiàn)麥芽纖維能通過顯著提高潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群中乳桿菌屬的豐度發(fā)揮良好的腸道菌群調(diào)控作用。毛螺菌科細菌可以通過產(chǎn)生SCFA促進宿主腸道健康，可通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)黏液厚度和維持腸道屏障完整性發(fā)揮益生作用。寧素云等研究發(fā)現(xiàn)毛螺菌屬及豐度在高劑量山楂粉組中顯著上升，這些菌屬可能是山楂粉改善高脂膳食模型小鼠腸道菌群構(gòu)成的標志物，這與本研究中高劑量山楂和麥芽對維生素缺乏大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改善作用的結(jié)果一致。變形菌門所有細菌均為革蘭氏陰性菌，大多數(shù)屬于腸道中的有害菌，如產(chǎn)內(nèi)毒素的促炎癥脫硫弧菌屬。因此，高劑量的山楂和麥芽粉能夠通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，在增加有益菌豐度的同時降低有害菌的豐度，從而促進維生素缺乏宿主的腸道健康。

圖10 大鼠腸道菌群LEfSe分析結(jié)果Fig. 10 LEfSe analysis of differences in intestinal microbiota of rats

2.7.4 大鼠腸道菌群的功能預(yù)測

為研究T2組與M組腸道菌群潛在功能的差異，通過PICRUSt軟件基于物種組成預(yù)測T2組與M組中功能基因的構(gòu)成，并用STAMP軟件展示京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路中功能條目的豐度。PICRUSt軟件可以通過16S RNA測序獲得的物種構(gòu)成推測樣本中功能基因的構(gòu)成，從而分析不同樣本之間的功能差異，此方法對腸道微生物菌群的功能分析準確性接近95%，能很好地反映樣品中的功能基因構(gòu)成。

如圖11所示，在KEGG二級代謝通路輔酶和維生素代謝下屬的三級代謝通路中，相比于M組，T2組硫胺素代謝、核黃素代謝、泛醌和其他萜醌的生物合成、葉酸生物合成、過氧化物酶體通路上的基因豐度顯著增加。過氧化物酶體含有多種依賴黃素的氧化酶和過氧化氫酶，可在多種代謝過程中發(fā)揮作用，包括脂肪酸氧化、消除活性氧簇和抗炎反應(yīng)。葉酸參與生物體遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝，促進動物生長。因此，本研究結(jié)果表明高劑量山楂和麥芽可調(diào)控維生素缺乏大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加乳桿菌屬、Lachnospiraceae UCG_006和等有益菌的豐度，降低產(chǎn)內(nèi)毒素脫硫弧菌屬的豐度，促進輔酶和維生素的合成，特別是硫胺素、核黃素及葉酸的合成代謝，進而促進依賴黃素的過氧化物酶體合成。過氧化物酶體促進脂肪酸-氧化，將長鏈脂肪酸分解為SCFA，進而增加腸道中SCFA含量，特別是作為結(jié)腸上皮細胞重要能量來源的丁酸含量顯著提高。SCFA有助于維持腸道穩(wěn)態(tài)，腸道穩(wěn)態(tài)時腸細胞代謝趨于高耗氧的氧化磷酸化和脂肪酸氧化，由此形成的低氧環(huán)境又利于產(chǎn)丁酸的腸道專性厭氧菌的生長，它們的大量增殖能夠維持腸道菌群平衡，保護腸道屏障完整性和調(diào)節(jié)能量代謝，同時通過增加小腸絨毛高度以及V/C值，促進腸道健康，最終提高大鼠腸道的吸收能力，從而使得高劑量山楂和麥芽能夠顯著提高維生素缺乏大鼠的體質(zhì)量增量，緩解維生素缺乏對幼鼠生長發(fā)育的不利影響。

圖11 大鼠腸道菌群不同代謝通路差異分析Fig. 11 Analysis of differential metabolic pathways of intestinal microbiota in rats

3 結(jié) 論

本實驗研究了山楂和麥芽組合物，以及山楂、麥芽、低聚木糖和聚葡萄糖復(fù)合物對維生素缺乏幼鼠腸運動性、腸道菌群、腸道有益代謝產(chǎn)物、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面的影響。維生素缺乏會顯著降低幼鼠的攝食量和食物利用率、小腸V/C值及SCFA含量，進而顯著降低整個實驗周期幼鼠的體質(zhì)量增量。與M組相比，T2組與T3組都能促進產(chǎn)SCFA的Lachnospiraceae UCG_006和乳桿菌屬，以及產(chǎn)黏蛋白的生長，分別將腸道總SCFA含量提高了78.00%和44.91%；同時改善了腸道組織形態(tài)，分別將空腸V/C值提高了52.65%和47.35%，從而改善維生素缺乏幼鼠腸道吸收功能，促進機體生長發(fā)育，特別是T3組的食物利用率顯著提高了11.58%，T2組的體質(zhì)量增量顯著增加了14.77%。然而，過多攝入聚葡萄糖會使得過度生長，降低腸道菌群多樣性，引起菌群失調(diào)，反而使維生素缺乏幼鼠腸道總SCFA含量較M組降低了4.93%，對腸道結(jié)構(gòu)造成不利影響。目前，鮮有山楂、麥芽和低聚糖復(fù)合物通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)來改善維生素缺乏幼鼠腸道功能的相關(guān)報道，本研究可為改善維生素缺乏癥功能食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。雖然水溶性維生素幾乎無毒性，攝入量偏高一般不會引起中毒現(xiàn)象，但是脂溶性維生素攝入量過多易引起中毒現(xiàn)象。因此，針對處于生長發(fā)育期的學(xué)齡前兒童來說，可考慮在飲食中每天補充50 g的山楂和麥芽粉組合物或者10 g的山楂和麥芽粉組合物同0.7 g低聚木糖和3.3 g聚葡萄糖的復(fù)合物來緩解潛在的維生素缺乏導(dǎo)致的消化不良。