動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取對滇黃精多糖結(jié)構(gòu)和活性的影響

何雪梅，岳 健，邱福榮，唐雅園，蘇 娟，趙艷娟，管世超，孫 健,*

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；3.云南山里紅生物科技有限公司，云南 昆明 650200）

滇黃精（Coll. et Hemsl.）系百合科滇黃精屬植物，又名雞頭滇黃精、老虎姜、黃雞菜、雞爪參等，其根莖是我國傳統(tǒng)的藥食兩用材料，具有滋腎潤肺、補(bǔ)脾益氣的功效。多糖是滇黃精中的主要功效成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明滇黃精多糖具有降血糖、降血脂、提高免疫力、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等功效，可廣泛應(yīng)用于藥品、保健品、食品和化妝品中，具有廣闊的應(yīng)用前景。熱水浸提法、酸堿提取法、酶解提取法是傳統(tǒng)的滇黃精多糖提取技術(shù)，具有提取方法簡單的優(yōu)點(diǎn)和提取率低的缺點(diǎn)。隨著技術(shù)的進(jìn)步，研究發(fā)現(xiàn)提取前的破壁處理可提高多糖得率，因此在傳統(tǒng)提取技術(shù)的基礎(chǔ)上，新型提取技術(shù)如超聲波輔助提取、微波輔助提取、閃式提取、高壓輔助提取等及復(fù)合提取技術(shù)得到發(fā)展。破壁前處理輔助新型提取技術(shù)在提取效率、得率和提高滇黃精多糖活性方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。

動(dòng)態(tài)超高壓微射流（dynamic high-pressure microfluidization，DHPM）技術(shù)是一種新興的功能成分提取技術(shù)，目前已應(yīng)用于多糖提取與改性，該技術(shù)通過瞬時(shí)強(qiáng)烈剪切、高速碰撞、瞬間壓力釋放等作用促進(jìn)細(xì)胞壁破裂，提高多糖提取率；同時(shí)通過剪切作用打斷多糖的分子鏈，改變分子的聚集狀態(tài)，造成多糖結(jié)構(gòu)的變化，從而影響其理化性質(zhì)和生物活性。綜上所述，DHPM是一種多糖提取的有效新技術(shù)，但目前鮮見利用DHPM提取滇黃精多糖的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用DHPM輔助提取滇黃精多糖，優(yōu)化其提取工藝條件，并分析其對滇黃精多糖結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生物活性的影響，為滇黃精多糖的開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滇黃精（Coll. et Hemsl.）2020年1月采自云南普洱，清洗后切片，于50 ℃低溫烘干，粉碎過60 目篩備用。

-葡萄糖苷酶（總酶活力100 U、總質(zhì)量9.19 mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、酪氨酸酶（總酶活力1 000 U、總質(zhì)量1 mg）、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和單糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；阿卡波糖 北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司；熊果苷 廣州珠峰進(jìn)出口貿(mào)易有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）、對硝基苯---葡萄糖苷（-nitrophenyl---glucopyranoside，PNPG） 北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、濃硫酸、乙醇等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

M-110EH型微射流均質(zhì)機(jī) 美國Microfluidics公司；GYB40-10S小型均質(zhì)機(jī) 上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；FT-IR650傅里葉變換紅外光譜儀 天津港東科技發(fā)展股份有限公司；1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；HAAKE Mars-III旋轉(zhuǎn)流變儀 美國賽默飛世爾公司；101-3電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；752N紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHZ-82水浴恒溫振蕩器 金壇市恒豐儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 滇黃精粗多糖的提取

1.3.1.1 熱水浸提法提取滇黃精多糖

稱取50 g滇黃精樣品，加入1 500 mL去離子水，于100 ℃下浸提2 h，濾布過濾后收集上清液，55 ℃減壓濃縮至300 mL，加入4 倍體積的95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液，4 ℃冰箱內(nèi)醇沉過夜，5 000 r/min離心15 min后，收集沉淀即為熱水浸提滇黃精粗多糖，記為WPKP。

1.3.1.2 DHPM輔助提取滇黃精多糖

參考秦令祥等的方法并作適當(dāng)修改，精確稱取50 g滇黃精分散于1 500 mL去離子水中，先采用小型均質(zhì)機(jī)均質(zhì)5 min（壓力為30 MPa），再經(jīng)過微射流均質(zhì)機(jī)處理（100、120、140、160、180 MPa）2 次后熱水浸提1 h，濾布過濾后收集上清液，55 ℃減壓濃縮至300 mL，加入4 倍體積的95%乙醇溶液，4 ℃下醇沉過夜，5 000 r/min離心15 min后，取沉淀冷凍干燥，得到不同均質(zhì)壓力DHPM輔助提取滇黃精多糖，分別記為DPKP-100、DPKP-120、DPKP-140、DPKP-160、DPKP-180。

1.3.2 滇黃精多糖得率和基本成分測定

1.3.2.1 滇黃精多糖得率的測定

滇黃精中多糖含量采用苯酚-硫酸法測定，多糖得率按照公式（1）計(jì)算。

1.3.2.2 滇黃精多糖純化組分水分、灰分、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

滇黃精多糖純化組分水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》；灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》；蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》。

1.3.3 滇黃精多糖的分離純化

以得率為評價(jià)指標(biāo)，根據(jù)1.3.1.2節(jié)優(yōu)化的提取壓力（140 MPa）制備WPKP、DPKP，用去離子水配制成100 mg/mL的粗多糖液，經(jīng)Sevag法除蛋白，對脫蛋白的多糖溶液濃縮后進(jìn)行DEAE-52柱層析，依次用去離子水和0.l、0.2、0.3、0.4 mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫液由自動(dòng)收集器收集，控制流速為1.0 mL/min，每7 min收集1 管。多糖含量利用苯酚-硫酸法進(jìn)行追蹤檢測，根據(jù)490 nm波長處OD值峰形收集洗脫液，所收集洗脫液濃縮后經(jīng)3 500 Da透析袋透析，透析所得樣品冷凍干燥。

1.3.4 滇黃精多糖分子質(zhì)量的測定

滇黃精多糖分子質(zhì)量采用高效凝膠色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法測定。將純化后的滇黃精多糖樣品用去離子水配制成2.0 mg/mL的溶液，過0.22 μm膜備用。HPGPC的測定條件：色譜柱為PL aquagel-OH Mixed（300 mm×7.5 mm，8 μm）；檢測器為2414示差折光檢測器；流動(dòng)相為超純水；流速為0.6 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為50 μL。以不同分子質(zhì)量的葡聚糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，多糖的分子質(zhì)量（平均分子質(zhì)量、重均分子質(zhì)量和數(shù)均分子質(zhì)量）由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出。

1.3.5 滇黃精多糖黏度的測定

純化后的滇黃精多糖用去離子水配制成2 mg/mL的多糖溶液。采用旋轉(zhuǎn)流變儀測定多糖黏度，測定條件如下：樣品臺(tái)溫度為37 ℃；C60號(hào)轉(zhuǎn)子；剪切速率為30.0 s；每秒讀數(shù)1 次；測定時(shí)間為60 s。測定進(jìn)行3 次平行，取平均值。

1.3.6 滇黃精多糖的紅外光譜分析

稱取1.3.3節(jié)2 種純化后的滇黃精多糖樣品（各2 mg），與200 mg溴化鉀混勻壓制成片，空白對照采用溴化鉀粉末壓片制成（去除溴化鉀在紅外光譜下的吸收）。分別置于傅里葉變換紅外光譜儀，在500～4 000 cm波數(shù)范圍內(nèi)掃描。

1.3.7 滇黃精多糖的單糖組成測定

采用PMP柱前衍生-高效液相色譜法測定不同方法提取滇黃精多糖的單糖組成。取純化后的滇黃精多糖樣品10 mg加入至2 mL 2 mol/L的三氟乙酸溶液中，130 ℃水解2 h，即得多糖的水解液。樣品水解液、單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)PMP衍生后，過0.22 μm膜進(jìn)行色譜分析。

高效液相色譜條件為：色譜柱：EC-C分離柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；檢測器及波長：250 nm紫外檢測器；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為（乙腈）∶（pH 6.9 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS））＝15∶85，流動(dòng)相B為（乙腈）∶（pH 6.9 20 mmol/L PBS）＝40∶60；梯度洗脫條件：0～12 min 90% B，12～20 min 75% B，20～22 min 90% B；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.5 mL/min。

1.3.8 滇黃精多糖1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力測定

采用體外DPPH自由基清除能力評價(jià)多糖的抗氧化能力，2 mL 0.2 mmol/L的DPPH工作液與2 mL不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）滇黃精多糖溶液充分混勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定反應(yīng)體系吸光度。以VC為陽性對照，按照公式（2）計(jì)算樣品的DPPH自由基清除率。

式中：為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH工作液的吸光度；為2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇的吸光度；為2 mL DPPH工作液+2 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.9 滇黃精多糖降血糖活性測定

以-葡萄糖苷酶抑制活性表征降血糖活性。葡萄糖苷酶抑制能力測定參照施吉祥等的方法并作適當(dāng)修改，反應(yīng)體系為：0.05 mL 8 U/mL-葡萄糖苷酶、2 mL 0.05 mol/L的磷酸鈉緩沖溶液（pH 6.8）和0.1 mL不同質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL）多糖樣品溶液，混勻后于37 ℃下水浴10 min，加入0.05 mL 8 mmol/L PNPG溶液，混勻后于37 ℃恒溫處理10 min，最后加入2 mL 0.1 mol/L NaCO溶液終止反應(yīng)，于405 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水調(diào)零，重復(fù)3 次，取平均值。陽性對照為阿卡波糖，按照公式（3）計(jì)算樣品的-葡萄糖苷酶活性抑制率。

式中：為不加待測樣品反應(yīng)后的吸光度；為加入待測樣品反應(yīng)后的吸光度；為待測樣品的吸光度。

1.3.10 滇黃精多糖酪氨酸酶活性抑制率測定

參考Huang Lixin等方法并修改。50 μL不同質(zhì)量濃度滇黃精多糖溶液中分別加入50 μL 100 U/mL酪氨酸酶溶液、90 μL PBS（pH 6.8），混勻后于37 ℃下孵育5 min，然后加入60 μL 2.5 mmol/L的-酪氨酸溶液，37 ℃下反應(yīng)10 min，于490 nm波長處測定吸光。陽性對照為熊果苷，樣品對酪氨酸酶活性的抑制率按照公式（4）計(jì)算。

式中：為樣品組反應(yīng)體系吸光度；為樣品背景組（PBS代替酪氨酸酶溶液）反應(yīng)體系吸光度；為空白組（蒸餾水代替樣品）反應(yīng)體系吸光度；為空白背景組（蒸餾水代替樣品、PBS代替酪氨酸酶溶液）反應(yīng)體系吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Origin 8.5軟件分析數(shù)據(jù)及作圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析，以＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHPM對滇黃精多糖提取得率的影響

比較DHPM輔助提取與熱水浸提對滇黃精粗多糖提取得率的影響，結(jié)果如圖1所示。DHPM壓力對多糖提取得率有顯著影響，隨著壓力的增大，多糖得率總體顯著提高。140 MPa壓力下提取所得多糖得率最高，達(dá)18.21%，是WPKP多糖得率（11.14%）的1.63 倍。DHPM技術(shù)通過強(qiáng)烈剪切和高速撞擊等作用使滇黃精顆粒在水中分散得更均勻，同時(shí)加速滇黃精細(xì)胞壁的破碎，使細(xì)胞的通透性增大，溶劑更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，有利于提高滇黃精多糖的得率；瞬時(shí)壓力作用促進(jìn)了傳質(zhì)過程，溶劑可在極短的時(shí)間內(nèi)滲透細(xì)胞壁，使多糖快速溶出，進(jìn)而提高提取效率。增大微射流壓力提高了多糖得率，是由于高壓下細(xì)胞破碎程度高有利于多糖溶出，當(dāng)壓力超過140 MPa后，滇黃精顆粒已充分破碎，并不會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)多糖溶出，繼續(xù)增大微射流壓力（160 MPa和180 MPa）導(dǎo)致體系黏度增大，過濾不完全，造成多糖得率測定誤差增大，且得率稍有降低。綜上，DHPM輔助提取滇黃精多糖得率顯著高于熱水浸提，提取壓力以140 MPa為宜，后續(xù)利用140 MPa提取樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同提取方法所得滇黃精粗多糖得率Fig. 1 Yield of crude Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.polysaccharides obtained by different extraction methods

2.2 DEAE-52 Cellulose柱層析對滇黃精多糖的純化

圖2為140 MPa下制備的WPKP和DPKP經(jīng)DEAE-52柱層析得到的洗脫曲線。由圖2可知，以去離子水和不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L）的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，2 種多糖均呈現(xiàn)1 個(gè)主洗脫峰。DPKP的主洗脫峰出現(xiàn)在24～34 管，由0.1 mol/L NaCl溶液洗脫而得，命名為DPKP-1；WPKP的主洗脫峰出現(xiàn)在30～38 管，由0.1 mol/L NaCl溶液洗脫而得，命名為WPKP-1。收集DPKP-1和WPKP-1洗脫液進(jìn)行濃縮、透析和冷凍干燥。對DPKP-1和WPKP-1樣品進(jìn)行成分測定，結(jié)果如表1所示，DPKP-1和WPKP-1的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高達(dá)75.95%和69.86%，純度較高，其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，說明DEAE-52對滇黃精多糖的純化非常有效。

圖2 WPKP和DPKP的洗脫曲線Fig. 2 Elution curves of WPKP and DPKP

表1 純化后不同提取方法所得滇黃精多糖的成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Composition of Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.polysaccharides obtained by different extraction methods

2.3 DHPM對滇黃精多糖相對分子質(zhì)量和黏度的影響

DHPM輔助提取和熱水提取得到的滇黃精多糖DPKP-1和WPKP-1經(jīng)洗脫均得到1 個(gè)主峰，經(jīng)HPGPC法測定，2 種多糖的分子質(zhì)量如表2所示，DPKP-1的分子質(zhì)量較WPKP-1的分子質(zhì)量降低了27.90%，說明DHPM處理降低了多糖的分子質(zhì)量。此外，比較了2 種多糖的聚合物分散性指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）（重均分子質(zhì)量/數(shù)均分子質(zhì)量），該指標(biāo)反映了多糖分子質(zhì)量的分布寬度，PDI越大表示分子質(zhì)量分布范圍越廣，PDI越小表示分子質(zhì)量分布越窄、越集中。DPKP-1的PDI是WPKP-1的2.34 倍，說明DPKP-1分子質(zhì)量分布廣、大小不均一。上述結(jié)果表明，DHPM通過強(qiáng)烈的機(jī)械剪切作用打斷多糖長分子鏈，切斷多糖糖苷鍵，有效地降解糖鏈，使提取到的多糖分子質(zhì)量顯著降低，造成分子質(zhì)量大小不均一。多糖的分子質(zhì)量與其生物活性有密切聯(lián)系，經(jīng)各種方法降解獲得的低分子質(zhì)量多糖可顯著提高抗氧化性，故推測用DHPM輔助提取的多糖可能具有更高的抗氧化活性。

表2 不同提取方法所得滇黃精多糖的平均分子質(zhì)量與黏度Table 2 Average molecular mass and apparent viscosity of Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl. polysaccharides obtained by different extraction methods

DPKP-1分子質(zhì)量的降低也導(dǎo)致了其黏度的降低，DPKP-1的黏度較WPKP-1的黏度降低了29.04%。研究表明，黏度與生物活性有關(guān)聯(lián)，高黏度常限制了多糖的應(yīng)用。DHPM可顯著降低多糖的黏度，從而拓展滇黃精多糖利用的可能性。

2.4 DHPM對滇黃精多糖傅里葉變換紅外光譜的影響

紅外光譜因靈敏度高、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)常用于分析分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵，是研究多糖結(jié)構(gòu)的重要方法之一。圖3為DPKP-1和WPKP-1的傅里葉變換紅外光譜圖，兩者的紅外光譜非常相似，都具有糖類化合物的特征吸收峰。3 600～3 200 cm的寬峰是—OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，這個(gè)區(qū)域的吸收峰是糖類的特征峰。3 376 .75 cm（DPKP-1）和3 378.35 cm（WPKP-1）處的寬吸收峰是糖分子O—H的伸縮振動(dòng)吸收峰，是糖類的特征峰。在2 927.41 cm（DPKP-1）和2 925.74 cm（WPKP-1）處的吸收峰歸因于C—H伸縮振動(dòng)（CH、CH、CH）。在1 644.98 cm（DPKP-1）和1 645.25 cm（WPKP-1）處的較強(qiáng)吸收峰可能歸因于多糖中—OH的彎曲振動(dòng)。在1 421.28、1 132.01 cm（DPKP-1）和1 420.13、1 134.57cm（WPKP-1）處的吸收峰歸因于C—O伸縮振動(dòng)。在1 328.71、1 261.22 cm（DPKP-1）和1 328.96、1 263.77cm（WPKP-1）處的吸收峰歸因于O—H變角振動(dòng)。在929.25 cm（DPKP-1）和930.68 cm（WPKP-1）處的吸收峰歸因于吡喃環(huán)的非對稱環(huán)伸縮振動(dòng)，說明兩種多糖均含吡喃環(huán)。綜上可知，DPKP-1和WPKP-1的紅外光譜相似，說明DHPM輔助提取未對滇黃精多糖的主要結(jié)構(gòu)造成影響，這與寇玉的研究結(jié)果相似。

圖3 DPKP-1和WPKP-1的傅里葉變換紅外光譜Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of DPKP-1 and WPKP-1

2.5 DHPM對滇黃精多糖單糖組成的影響

圖4為DPKP-1和WPKP-1的單糖組成高效液相色譜圖，可見2 種多糖均為中性多糖，主要由9 種單糖組成，9 種單糖的出峰順序相同，但每種單糖的含量不同。2 種多糖的單糖組成如表2所示，DPKP-1以甘露糖、半乳糖、葡萄糖為主，總物質(zhì)的量百分比為83.23%，WPKP-1以甘露糖、氨基半乳糖、半乳糖和葡萄糖為主，總物質(zhì)的量百分比為81.21%。2 種多糖中木糖、巖藻糖的含量均很少。DHPM輔助提取提高了滇黃精多糖中甘露糖的含量，為熱水提取滇黃精多糖的2.11 倍，降低了半乳糖和氨基半乳糖含量，分別約是熱水提取的57%和18%。由此可見，DHPM處理改變了多糖的結(jié)構(gòu)，可能會(huì)導(dǎo)致多糖活性的差異。

圖4 DPKP-1和WPKP-1單糖組成的HPLC圖Fig. 4 HPLC profiles of monosaccharide composition of DPKP-1 and WPKP-1

表2 不同提取方法所得滇黃精多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl. polysaccharides obtained by different extraction methods

2.6 DHPM對滇黃精多糖DPPH自由基清除能力的影響

DPKP-1和WPKP-1對DPPH自由基的清除能力如圖5所示，2 種滇黃精多糖均有一定的DPPH自由基清除能力，但清除能力遠(yuǎn)低于VC。DPKP-1的DPPH自由基清除能力明顯優(yōu)于WPKP-1。多糖結(jié)構(gòu)、連接方式、分子質(zhì)量以及多糖的化學(xué)組成等因素均可影響多糖抗氧化活性，以往的研究認(rèn)為分子質(zhì)量較小的多糖具有較高的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)中抗氧化活性分析結(jié)果與分子質(zhì)量分析結(jié)果相互印證，也與以往的文獻(xiàn)報(bào)道相符。高壓處理可降低石斛多糖的分子質(zhì)量并提高其體內(nèi)外抗氧化活性；DHPM處理可改變木霉多糖形態(tài)、提高其抗氧化活性；DHPM處理未改變杜仲雄花多糖結(jié)構(gòu)，但降低了其分子質(zhì)量，提高了其抗氧化能力。綜上可知，DHPM輔助法可能通過降低滇黃精多糖分子質(zhì)量、改變其單糖組成，從而提高滇黃精多糖的抗氧化活性。

圖5 DPKP-1和WPKP-1的DPPH自由基清除能力Fig. 5 DPPH radical scavenging capacity of DPKP-1 and WPKP-1

2.7 DHPM對滇黃精多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響

-葡萄糖苷酶活性是糖尿病控制和治療過程中的重要監(jiān)測指標(biāo)。圖6顯示了DHPM輔助提取與熱水提取滇黃精多糖的-葡萄糖苷酶抑制活性，DPKP-1、WPKP-1具有較強(qiáng)的-葡萄糖苷酶抑制活性，且兩者與-葡萄糖苷酶抑制活性呈量效關(guān)系。經(jīng)計(jì)算，DPKP-1對-葡萄糖苷酶的半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC）為4.07 mg/mL，WPKP-1對-葡萄糖苷酶的IC為5.83 mg/mL，說明DHPM對滇黃精多糖的-葡萄糖苷酶抑制活性有提升作用。多糖中單糖所包含的不同羥基基團(tuán)也是影響多糖-葡萄糖苷酶抑制活性的重要因素，多糖單糖組成分析結(jié)果顯示DPKP-1與WPKP-1的單糖組成有較大差異，這也可能是造成DPKP-1的-葡萄糖苷酶抑制活性高于WPKP-1的原因之一。DHPM產(chǎn)生的高速?zèng)_擊力對多糖具有重組作用，糖鍵斷開和基團(tuán)暴露的變化導(dǎo)致多糖的組分發(fā)生了變化。此外，DHPM還能一定程度地拉伸多糖分子，可能引起單糖的組成和分子聚集狀態(tài)變化，從而改變多糖分子間的空間結(jié)構(gòu)與分子間作用力。

圖6 DPKP-1和WPKP-1的α-葡萄糖苷酶活性抑制率Fig. 6 α-Glycosidase activity inhibitory rate of DPKP-1 and WPKP-1

2.8 DHPM對滇黃精多糖抑制酪氨酸酶活性的影響

酪氨酸酶是黑色素生物合成中限速效應(yīng)的關(guān)鍵酶，是一種活性中心含有Cu的多功能氧化酶，產(chǎn)品的美白功能可由酪氨酸酶活性抑制率來評價(jià)。DHPM輔助提取與熱水提取滇黃精多糖的酪氨酸酶抑制活性如圖7所示，經(jīng)計(jì)算，DPKP-1對酪氨酸酶的IC為2.53 mg/mL，WPKP-1對酪氨酸酶的IC為2.87 mg/mL，但兩者均高于熊果苷的IC（0.13 mg/mL），說明DPKP-1、WPKP-1雖具有較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性，但其抑制活性均低于熊果苷。DPKP-1、WPKP-1與酪氨酸酶抑制活性之間存在一定的量效關(guān)系，在0～0.2 mg/mL和4.2～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，WPKP-1的酪氨酸酶抑制活性略高于DPKP-1，在0.2～4.2 mg/mL范圍內(nèi)，WPKP-1的酪氨酸酶抑制活性略低于DPKP-1。因此，不論從兩者對酪氨酸酶抑制活性的半抑制濃度，還是從兩者與酪氨酸酶抑制活性之間的量效關(guān)系來分析，DPKP-1與WPKP-1對酪氨酸酶的抑制活性差異不大，表明DHPM對滇黃精多糖抑制酪氨酸酶活性無明顯影響，這可能與滇黃精多糖抑制酪氨酸酶活性的作用機(jī)理有關(guān)。

圖7 DPKP-1和WPKP-1的酪氨酸酶活性抑制率Fig. 7 Tyrosinase activity inhibitory rate of DPKP-1 and WPKP-1

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過比較DHPM提取技術(shù)和常規(guī)熱水浸提對所得滇黃精多糖結(jié)構(gòu)和活性的影響，發(fā)現(xiàn)相對于常規(guī)的熱水浸提，DHPM輔助提取技術(shù)顯著提高了滇黃精多糖的得率，改變了滇黃精多糖的單糖組成，降低了多糖的分子質(zhì)量和黏度，提高了滇黃精多糖的DPPH自由基清除能力和-糖苷酶抑制活性，但對滇黃精多糖的主要結(jié)構(gòu)和酪氨酸酶抑制活性無顯著性變化。綜上所述，DHPM輔助提取技術(shù)在提高滇黃精多糖得率、增強(qiáng)其抗氧化和降血糖活性方面均有明顯的優(yōu)勢，表明DHPM是一種非常具有應(yīng)用價(jià)值和推廣前景的滇黃精多糖提取方法。