熱處理對豌豆分離蛋白結(jié)合典型牛肉香氣物質(zhì)的影響及相互作用機制

徐思佳，畢 爽，張文濤，潘 鑫，勞 菲，沈 群，吳繼紅,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果蔬加工重點實驗室，食品非熱加工北京市重點實驗室，北京 100083；2.北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

在“雙碳”目標的指導(dǎo)下，科學膳食和健康中國的理念深入人心，人們對于植物性食品的需求不斷增加。豌豆具有蛋白質(zhì)含量高（233～267 g/kg）和脂肪含量低（15～20 g/kg）的特點，目前作為植物肉生產(chǎn)原料而被廣泛關(guān)注與應(yīng)用。植物肉中的肉香通常需要外添香精、水解動物或植物蛋白液、產(chǎn)生肉香的前體物質(zhì)。天然的肉香由肌肉組織在受熱中產(chǎn)生，低閾值的含硫、含氧、含氮雜環(huán)化合物及不飽和醛是肉香味的關(guān)鍵香氣成分，對肉香味貢獻較大，本研究所選擇的香氣物質(zhì)2-甲基吡嗪、2-甲基-3-巰基呋喃、(,)-2,4-癸二烯醛和5-羥乙基-4-甲基噻唑均是熟牛肉的關(guān)鍵風味物質(zhì)。蛋白質(zhì)不會直接影響風味，但可與揮發(fā)性風味物質(zhì)發(fā)生可逆或不可逆結(jié)合，從而影響香氣協(xié)調(diào)性。因此，在植物肉制品中模擬真實的肉類風味或產(chǎn)生特定的肉類風味，必須考察蛋白質(zhì)對揮發(fā)性風味物質(zhì)的結(jié)合情況。

現(xiàn)有研究主要集中在天然豌豆蛋白與揮發(fā)性風味物質(zhì)的相互作用，Wang Kun等發(fā)現(xiàn)豌豆分離蛋白結(jié)合醛類揮發(fā)性風味物質(zhì)的能力強于其與酮類物質(zhì)的結(jié)合，本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)天然豌豆蛋白與3 種豌豆關(guān)鍵香氣物質(zhì)（()-2-戊烯-1-醇、正己醛和()-2-辛烯醛）之間通過氫鍵和疏水相互作用結(jié)合，但是這些研究沒有考慮到實際加工對風味的影響。熱處理是蛋白質(zhì)食品加工的必要工藝，影響揮發(fā)性風味物質(zhì)在蛋白質(zhì)中的保留和釋放。此外，目前對于植物源蛋白的研究多集中在其與呈果香的短鏈醛、酮、酯類羰基化合物的結(jié)合情況，而與呈肉香的含氮、含硫雜環(huán)化合物和不飽和醛的研究有限。

本實驗以豌豆分離蛋白和4 種典型牛肉風味物質(zhì)（2-甲基吡嗪、2-甲基-3-巰基呋喃、(,)-2,4-癸二烯醛和5-羥乙基-4-甲基噻唑）為研究對象，探究熱處理對豌豆分離蛋白與典型牛肉香氣物質(zhì)結(jié)合情況的影響，分析香氣結(jié)合率變化與香氣物質(zhì)性質(zhì)、豌豆蛋白性質(zhì)的關(guān)聯(lián)性，明確相互作用機理，以期對植物肉生產(chǎn)熱加工過程中的風味調(diào)控與修飾提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆（L.），2021年收獲的‘中豌’系列品種，購于山西東方亮生命科技股份有限公司。

2-甲基吡嗪（純度≥99%）、2-甲基-3-巰基呋喃（純度≥95%）、(,)-2,4-癸二烯醛（純度≥89%）、8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS，純度≥97%） Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；5-羥乙基-4-甲基噻唑（純度＞98%） 梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其他化學試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）儀、DB-WAX氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent有限公司；固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS，2 cm） Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；CNW 18 mm螺紋口20 mL棕色圓底頂空樣品瓶 上海安譜實驗科技股份有限公司；Carry-50熒光分光光度計 美國Varian公司；ZEN 3700粒度分析儀 英國Malvern儀器有限公司；RET BASIC S025加熱磁力攪拌器 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司（IKA中國）；JJ-1増力電動攪拌器 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆分離蛋白的提取

參考Cui Leqi等方法并稍作調(diào)整，豌豆磨粉后過60 目篩，以1∶10（/）的比例加入超純水，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，采用電動攪拌器攪拌1 h后10 000×離心15 min，收集上清液并使用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，攪拌1 h后10 000×離心15 min，棄去上清液并用超純水洗滌沉淀2 次，然后用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，將樣品轉(zhuǎn)移至透析袋（7 kDa）中，4 ℃下透析48 h，每6 h更換一次超純水，將透析后的樣品冷凍干燥得到豌豆分離蛋白。經(jīng)凱氏定氮法測定，提取物中蛋白質(zhì)相對含量為（90.15±1.20）%。

1.3.2 SPME-GC-MS法測定香氣結(jié)合率

使用KHPO-KHPO緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.6）配制質(zhì)量濃度10 mg/mL豌豆分離蛋白溶液，磁力攪拌12 h使蛋白充分溶解。以甲醇（色譜級）為溶劑配制0.01 mol/L香氣儲備液，每次實驗前，使用上述磷酸鉀緩沖液稀釋，使得2-甲基吡嗪、2-甲基-3-巰基呋喃、(,)-2,4-癸二烯醛的質(zhì)量濃度為40 mg/L，5-羥乙基-4-甲基噻唑的質(zhì)量濃度為220 mg/L。在20 mL頂空瓶中，加入1 mL豌豆分離蛋白溶液、0.5 mL香氣稀釋液和0.5 mL磷酸鉀緩沖液，混合后立即旋緊螺旋蓋。然后在各熱處理條件下處理樣品，其中探究熱處理溫度影響的實驗條件為80、90、100、120 ℃下熱處理10 min；探究熱處理時間影響的實驗條件為100 ℃下熱處理5、10、15、20 min；同時設(shè)置對照組不進行熱處理。熱處理結(jié)束后立即將頂空瓶放入冰水中降溫，然后在25 ℃下恒溫振搖12 h使之達到平衡狀態(tài)，采用GC-MS測定頂空香氣峰面積。

參考宋澤等的方法并稍作調(diào)整。頂空固相微萃取條件：頂空瓶于50 ℃平衡10 min并振蕩，平衡結(jié)束后SPME萃取頭插入頂空部分吸附30 min，然后在250 ℃解吸附5 min。GC條件：載氣為高純度氦氣（99.999%），流速1.0 mL/min，從頂空吸取1 mL氣體進入GC進樣口，不分流，進樣口溫度250 ℃，程序升溫條件為起始溫度40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升溫至220 ℃，在220 ℃保持2 min。MS條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV，離子源、輔助熱處理器溫度和四極桿溫度分別為230、250 ℃和150 ℃。在全離子掃描模式下確定2-甲基吡嗪的特征/為94、67、26、39和40，2-甲基-3-巰基呋喃的特征/為114、113、85、45和43，(,)-2,4-癸二烯醛的特征/為81、41、67、83和55，5-羥乙基-4-甲基噻唑的特征/為112、113、45、143和85，在選擇離子掃描模式下定量。豌豆分離蛋白與香氣物質(zhì)結(jié)合率計算如式（1）所示。香氣物質(zhì)自身的屬性參數(shù)查閱于https://www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx。

1.3.3 表面疏水性測定

采用ANS法測定蛋白表面疏水性。用KHPO-KHPO緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.6）分別配制質(zhì)量濃度0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mg/mL的豌豆分離蛋白溶液，熱處理后各取4 mL分別加入20 μL 8 mmol/L ANS溶液，在25 ℃避光靜置5 min后測定熒光強度，熒光測定條件為激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm，發(fā)射光譜范圍為430～520 nm，狹縫為1 nm，分度為0.5 nm。以蛋白質(zhì)量濃度為自變量、熒光強度為因變量進行線性擬合，斜率即為表面疏水性。

1.3.4 粒徑和ζ電位測定

豌豆分離蛋白溶液熱處理后用KHPO-KHPO緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.6）稀釋至質(zhì)量濃度1 mg/mL，然后通過粒度分析儀測定粒徑和ζ電位。相對折射率取1.330。

1.3.5 熒光光譜測定

參考Shen Hui等方法并稍作調(diào)整，配制待測溶液，使豌豆分離蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，2-甲基吡嗪濃度為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mmol/L，用KHPO-KHPO緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.6）補充體積至5 mL。以不加熱為對照組，熱處理組在100 ℃下加熱10 min，然后分別在25、30、37 ℃下以100 r/min恒溫振蕩2 h，使蛋白與2-甲基吡嗪充分相互作用，2 h后立即測定熒光強度。熒光測定條件為激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長330 nm，發(fā)射光譜范圍為300～450 nm，狹縫為2 nm，分度為0.5 nm。使用Stern-Volmer方程（式（2））分析熒光數(shù)據(jù)。

式中：和分別表示不存在和存在2-甲基吡嗪（猝滅劑）時的熒光強度；[]為2-甲基吡嗪濃度/（mol/L）；為Stern-Volmer猝滅常數(shù)/（L/mol）。

采用Stern-Volmer方程的變形公式（式（3））進一步計算有效猝滅常數(shù)/（L/mol）。

式中：為可猝滅熒光的常數(shù)。

由于/Δ與1/[]呈線性關(guān)系，所以可以通過斜率和截距計算得到。當溫度變化很小時，焓變Δ可視為常數(shù)，Δ和熵變Δ分別通過Van’t Hoff方程（式（4））的斜率和截距計算得到。

式中：為氣體常數(shù)（8.314 kJ/（mol·K））；為平衡溫度/K，即恒溫振蕩溫度。

吉布斯自由能Δ/（kJ/mol）根據(jù)式（5）計算。

1.3.6 SPME-GC-MS測定豌豆分離蛋白與2-甲基吡嗪的結(jié)合常數(shù)

在20 mL頂空瓶中，豌豆分離蛋白質(zhì)量濃度5 mg/mL，2-甲基吡嗪濃度為0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/L，用KHPO-KHPO緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.6）補充體積至2 mL。以不加熱為對照組，熱處理組在100 ℃下加熱10 min，SPME-GC-MS檢測條件參考1.3.2節(jié)。采用Scatchard模型描述平衡條件下?lián)]發(fā)性風味化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù)按式（6）、（7）計算。

式中：為單位物質(zhì)的量蛋白結(jié)合揮發(fā)性風味化合物的物質(zhì)的量；[]為樣品溶液中總揮發(fā)性風味物質(zhì)濃度/（mol/L）；為豌豆蛋白濃度/（mol/L）；為結(jié)合位點數(shù)；為結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；[]為溶液中揮發(fā)性風味化合物的游離濃度/（mol/L）；為描述單個結(jié)合位點和風味配體間協(xié)同特性的Hill系數(shù)，當＝1時公式（6）為Klotz方程，在Klotz方程中常用值衡量整體結(jié)合親和力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗設(shè)置3 個平行，結(jié)果以平均值±標準差表示，利用SPSS v.26.0軟件進行單因素方差分析（＜0.05）、協(xié)方差分析和Spearman相關(guān)性分析，利用Origin 2022軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對豌豆分離蛋白與香氣物質(zhì)結(jié)合率的影響

2.1.1 熱處理溫度

熱處理溫度對豌豆分離蛋白與牛肉香氣物質(zhì)結(jié)合率的影響如圖1所示，在常溫下，2-甲基-3-巰基呋喃和(,)-2,4-癸二烯醛與豌豆分離蛋白的結(jié)合率大于98%，能充分地與豌豆分離蛋白結(jié)合，并且熱處理對結(jié)合率的影響不大，這種現(xiàn)象可能是由于香氣物質(zhì)與豌豆分離蛋白發(fā)生強相互作用，這與香氣物質(zhì)的官能團有關(guān)。然而對于2-甲基吡嗪和5-羥乙基-4-甲基噻唑，溫度升高對結(jié)合率的影響表現(xiàn)出相反的趨勢。2-甲基吡嗪在常溫時與豌豆分離蛋白的結(jié)合率為（17.58±0.58）%，提高溫度導(dǎo)致結(jié)合率小幅升高，100 ℃的結(jié)合率相比常溫增加了約7%；而5-羥乙基-4-甲基噻唑在常溫時與豌豆分離蛋白的結(jié)合率為（80.34±7.68）%，且結(jié)合率隨著溫度升高而降低，在100 ℃的結(jié)合率相比常溫降低了約26%。對于2-甲基吡嗪，蛋白質(zhì)可能由于熱變性暴露更多的結(jié)合位點，因此結(jié)合率升高。而對于5-羥乙基-4-甲基噻唑，溫度升高會增加香氣物質(zhì)的活性系數(shù)，有利于解吸附，使逸散到頂空的香氣物質(zhì)含量更高，這是溫度直接影響的結(jié)果。因此，揮發(fā)性風味化合物的保留或釋放取決于熱處理過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和香氣化合物逸散的競爭結(jié)果。

圖1 熱處理溫度對豌豆分離蛋白與牛肉香氣物質(zhì)結(jié)合率的影響Fig. 1 Effect of heat treatment temperature on the binding rates of pea protein isolate to beef aroma substances

在120 ℃下處理10 min后，豌豆分離蛋白與2-甲基吡嗪的結(jié)合率相比常溫大幅提高了約32%，與5-羥乙基-4-甲基噻唑的結(jié)合率略低于常溫下的結(jié)合率，但是高于80～100 ℃的結(jié)合率，表明120 ℃處理能夠促進豌豆分離蛋白結(jié)合牛肉香氣物質(zhì)。在加工過程中，香氣物質(zhì)與蛋白基質(zhì)緊密結(jié)合得以保留，而在咀嚼時從食物中釋放，增強香氣物質(zhì)與蛋白基質(zhì)的可逆結(jié)合有利于減少加工過程中的風味損失。

2.1.2 熱處理時間

熱處理時間對豌豆分離蛋白與牛肉香氣物質(zhì)結(jié)合率的影響如圖2所示。熱處理時間對2-甲基-3-巰基呋喃和(,)-2,4-癸二烯醛與豌豆分離蛋白的結(jié)合率影響不大，這是由于這兩種香氣物質(zhì)與蛋白發(fā)生了強相互作用。2-甲基吡嗪與豌豆分離蛋白的結(jié)合率隨著熱處理時間的延長而升高，在100 ℃加熱10 min后結(jié)合率為（25.35±1.26）%，經(jīng)過15 min熱處理后相比常溫時的結(jié)合率增加了約12%，這可能是由于熱處理過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露的疏水基團對2-甲基吡嗪具有親和力，而熱處理20 min與熱處理15 min沒有顯著差異（＞0.05），說明結(jié)合已經(jīng)達到平衡。Damodaran和Wang Kun等研究了揮發(fā)性風味物質(zhì)與大豆蛋白和豌豆蛋白結(jié)合的熱力學，發(fā)現(xiàn)這種相互作用在熱力學上是有利的和自發(fā)的。

圖2 熱處理時間對豌豆分離蛋白與牛肉香氣物質(zhì)結(jié)合率的影響Fig. 2 Effect of heat treatment time on the binding rates of pea protein isolate to beef aroma substances

豌豆分離蛋白與5-羥乙基-4-甲基噻唑的結(jié)合率在經(jīng)過5 min熱處理后相比常溫時下降了約44%，隨著熱處理時間繼續(xù)延長，結(jié)合率上升，在100 ℃加熱10 min后結(jié)合率為（54.41±4.14）%，在經(jīng)過20 min熱處理后，結(jié)合率上升到略高于常溫。推測大量5-羥乙基-4-甲基噻唑在受熱后更易于逸散到頂空，其逸散分子數(shù)量大于與蛋白結(jié)合分子數(shù)量；隨著熱處理持續(xù)進行，豌豆蛋白結(jié)構(gòu)展開，5-羥乙基-4-甲基噻唑與豌豆分離蛋白暴露的內(nèi)部基團結(jié)合，逸散與結(jié)合逐漸達到平衡。

2.2 香氣物質(zhì)性質(zhì)對結(jié)合率的影響

熱處理對豌豆分離蛋白與2-甲基-3-巰基呋喃和(,)-2,4-癸二烯醛結(jié)合的影響不大，這可能是由于這兩種香氣物質(zhì)能與蛋白質(zhì)的官能團發(fā)生反應(yīng)緊密結(jié)合，熱處理不會破壞這種結(jié)合。4 種典型牛肉香氣物質(zhì)的性質(zhì)如表1所示。

表1 4 種典型牛肉香氣物質(zhì)的性質(zhì)Table 1 Properties of four typical beef aroma substances

2-甲基-3-巰基呋喃含有巰基，可與蛋白質(zhì)發(fā)生強相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)-乳球蛋白與含巰基的丙硫醇、呋喃-2-甲硫醇和苯硫酚之間通過共價鍵結(jié)合，形成二硫和三硫加合物。(,)-2,4-癸二烯醛是不飽和醛，相比于飽和醛，不飽和醛所含的醛基可以與蛋白的官能團發(fā)生強相互作用，形成不可逆的共價鍵。烯烴醛可與蛋白質(zhì)的酰胺側(cè)鏈形成席夫堿，也可與游離半胱氨酸硫醇發(fā)生共軛加成，熱處理會促進這些反應(yīng)。由于共價結(jié)合是不可逆的，因此以上香氣物質(zhì)與蛋白質(zhì)的共價結(jié)合會導(dǎo)致香氣損失和食品保質(zhì)期縮短，只有香氣物質(zhì)通過非共價力與蛋白質(zhì)相互作用，才有利于在加工過程中蛋白基食物風味特征的保留。

常溫下，2-甲基吡嗪和5-羥乙基-4-甲基噻唑含有雜環(huán)，結(jié)構(gòu)緊密且剛性強，較大的空間位陰限制其與豌豆分離蛋白發(fā)生疏水相互作用，而具有柔性鏈結(jié)構(gòu)的(,)-2,4-癸二烯醛可以改變自身結(jié)構(gòu)從而更容易與位點結(jié)合。通過核磁共振和X射線衍射等精確方法也證明了具有緊密分子結(jié)構(gòu)的風味小分子物質(zhì)很難與蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水區(qū)域結(jié)合。

log表示油水分配系數(shù)或者疏水系數(shù)，log值越大，說明該物質(zhì)越親油，反之則說明該物質(zhì)越親水。豌豆分離蛋白與4 種牛肉香氣物質(zhì)的結(jié)合率與log值呈正相關(guān)，log值最小的2-甲基吡嗪表現(xiàn)與豌豆分離蛋白的結(jié)合率最低，隨著4 種牛肉香氣物質(zhì)log值的升高，結(jié)合率也升高，log值較大的2-甲基-3-巰基呋喃和(,)-2,4-癸二烯醛能夠與豌豆分離蛋白基本完全結(jié)合，這說明牛肉香氣物質(zhì)可能與豌豆分離蛋白的疏水性結(jié)合位點結(jié)合，表明相互作用本質(zhì)上是疏水的。研究發(fā)現(xiàn)，對于屬于同系物的揮發(fā)性風味物質(zhì)，碳鏈越長，其被蛋白質(zhì)保留的效果越強，這也說明香氣物質(zhì)的疏水性與其和蛋白的結(jié)合率呈正相關(guān)。

2.3 豌豆分離蛋白熱變性對結(jié)合率的影響

2.3.1 表面疏水性

ANS可作為疏水性熒光探針，衡量所結(jié)合蛋白質(zhì)位點的極性變化，進一步推測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。如圖3A所示，隨著處理溫度升高到100 ℃，豌豆分離蛋白的表面疏水性增加到最大。表面疏水性的增加與蛋白質(zhì)去折疊有關(guān)，熱處理使得豌豆7S球蛋白展開，11S球蛋白亞基間二硫鍵斷裂，導(dǎo)致埋藏在內(nèi)部的非極性氨基酸側(cè)鏈暴露。然而，120 ℃熱處理和100 ℃延長熱處理時間（圖3B）均導(dǎo)致表面疏水性略有下降，表明疏水殘基不再暴露，傾向于聚集。

圖3 熱處理對豌豆分離蛋白表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of heat treatment on surface hydrophobicity of pea protein isolate

疏水基團暴露通常會增加與香氣物質(zhì)的結(jié)合，在本研究中最典型的是2-甲基吡嗪，在80～100 ℃加熱10 min和100 ℃加熱5～10 min的過程中，豌豆分離蛋白與2-甲基吡嗪的結(jié)合率隨著其表面疏水性的升高而升高。對于log值同樣較低的5-羥乙基-4-甲基噻唑，豌豆分離蛋白與其結(jié)合率與表面疏水性呈強負相關(guān)（＝-0.89），這說明經(jīng)過加熱，5-羥乙基-4-甲基噻唑的逸散效應(yīng)強于蛋白與其的結(jié)合作用，因此結(jié)合率降低。

2.3.2 粒徑和ζ電位

如圖4A、B所示，經(jīng)熱處理后，豌豆分離蛋白粒徑相比常溫時（對照組）顯著下降（＜0.05），且隨熱處理溫度升高，豌豆分離蛋白粒徑不斷降低，這表明熱處理誘導(dǎo)了蛋白四級結(jié)構(gòu)的解離；而隨熱處理時間的延長，豌豆分離蛋白粒徑無顯著變化。蛋白在溶液中穩(wěn)定時，其ζ電位絕對值不低于30 mV。如圖4C、D所示，隨著處理溫度升高和時間延長，ζ電位略微升高，但依然在-30 mV附近，說明體系相對穩(wěn)定，蛋白質(zhì)不會大量聚集。在低離子濃度和低離子強度下，游離亞基很難形成聚集體，同樣在本實驗緩沖液體系中離子強度較低，豌豆蛋白亞基之間相互作用陰止聚集。在80 ℃時豌豆11S球蛋白雖然沒有完全變性，但為了適應(yīng)溫度升高結(jié)構(gòu)變得更加緊密，當溫度繼續(xù)升高，熱變性豌豆7S球蛋白和伴豌豆球蛋白引起的空間位陰和靜電排斥均通過非共價鍵作用減少變性豌豆11S球蛋白的聚集。

圖4 熱處理對豌豆分離蛋白粒徑和ζ電位的影響Fig. 4 Effect of heat treatment on particle size and zeta potential of pea protein isolate

豌豆分離蛋白和2-甲基吡嗪的結(jié)合率與熱處理溫度（＝1.00）和熱處理時間（＝0.90）呈極強正相關(guān)，與粒徑呈極強負相關(guān)（＝-0.96）。當從常溫升高到100 ℃時，豌豆分離蛋白與2-甲基吡嗪的結(jié)合率上升，此過程中豌豆分離蛋白表面疏水性也上升，表明熱處理可能導(dǎo)致與2-甲基吡嗪的結(jié)合位點暴露。而對于5-羥乙基-4-甲基噻唑，在120 ℃和較長熱處理時間下豌豆分離蛋白表面疏水性和粒徑均降低，說明劇烈的熱處理導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，可能暴露出有利于結(jié)合5-羥乙基-4-甲基噻唑的位點。

2.4 豌豆分離蛋白與2-甲基吡嗪的相互作用機制

吡嗪類化合物是對燉煮牛肉香氣有重要貢獻的雜環(huán)類化合物，同時也是美拉德反應(yīng)的主要產(chǎn)物，在常溫下其與豌豆分離蛋白的結(jié)合率較低，經(jīng)過加熱后有所提高，這說明2-甲基吡嗪與豌豆分離蛋白之間可能存在弱相互作用，因此選擇2-甲基吡嗪作為模型香氣物質(zhì)，研究香氣物質(zhì)與豌豆分離蛋白相互作用機制。

2.4.1 Stern-Volmer方程分析熒光猝滅和相互作用類型

豌豆分離蛋白在330 nm附近有一個強烈的熒光發(fā)射峰，2-甲基吡嗪可以作為猝滅劑在不同濃度下逐漸降低豌豆分離蛋白的熒光，從而反映蛋白質(zhì)構(gòu)象改變引起的微環(huán)境變化或者分子結(jié)合情況。使用Stern-Volmer方程分析熒光數(shù)據(jù)，可以判斷蛋白質(zhì)與小分子間的熒光猝滅機制（＞0.98）。通常，動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅可以通過對溫度的依賴性區(qū)分。如表2所示，隨著升高而降低，說明2-甲基吡嗪對天然豌豆分離蛋白和熱變性豌豆分離蛋白的熒光猝滅類型均為靜態(tài)猝滅。

為了解熱處理前后豌豆分離蛋白與2-甲基吡嗪的相互作用力，通過Stern-Volmer方程變形公式（＞0.99）和Van’t Hoff方程（＞0.93）線性擬合計算熱力學參數(shù)。如表2所示，Δ＜0說明相互作用過程是自發(fā)的，熱處理前后的Δ＜0且Δ＜0，說明2-甲基吡嗪與天然豌豆分離蛋白和熱變性豌豆分離蛋白相互作用均為范德華力和氫鍵，并且為焓驅(qū)動反應(yīng)。

表2 熱處理前后2-甲基吡嗪與豌豆分離蛋白相互作用的Stern-Volmer常數(shù)和熱力學參數(shù)Table 2 Stern-volmer constants and thermodynamic parameters of interaction between 2-methylpyrazine and pea protein isolate before and after heat treatment

2.4.2 Klotz方程分析結(jié)合參數(shù)

如圖5所示，熱處理前后2-甲基吡嗪與豌豆分離蛋白的結(jié)合規(guī)律符合Klotz方程，這種線性關(guān)系表明2-甲基吡嗪可獨立地與豌豆分離蛋白結(jié)合，并且配體和蛋白質(zhì)之間是非共價相互作用。如表3所示，豌豆分離蛋白經(jīng)熱處理后，與2-甲基吡嗪的結(jié)合位點數(shù)從20.46±15.69升高到23.78±15.12，Suppavorasatit等發(fā)現(xiàn)不同溫度下麥芽酚與大豆分離蛋白的結(jié)合位點數(shù)不同，說明結(jié)合位點數(shù)與蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。熱處理后豌豆分離蛋白與2-甲基吡嗪結(jié)合常數(shù)從（638.63±490.36）L/mol升高到（961.97±612.93）L/mol，這與熱處理后2-甲基吡嗪結(jié)合率升高的結(jié)果一致。單獨使用或不能代表揮發(fā)性風味物質(zhì)與蛋白質(zhì)的整體結(jié)合力，值可以更準確地衡量整體結(jié)合親和力。經(jīng)過熱處理后，值從（13 065.25±546.63）L/mol升高到（22 876.70±985.48）L/mol，進一步說明加熱使豌豆分離蛋白結(jié)合2-甲基吡嗪的能力增強。

圖5 熱處理前后2-甲基吡嗪與豌豆分離蛋白相互作用的Klotz雙倒數(shù)圖Fig. 5 Klotz double reciprocal plot of interaction between 2-methylpyrazine and pea protein isolate before and after heat treatment

表3 熱處理前后2-甲基吡嗪與豌豆分離蛋白的結(jié)合參數(shù)Table 3 Binding parameters of 2-methylpyrazine to pea protein isolate before and after heat treatment

揮發(fā)性風味物質(zhì)與豆類蛋白的結(jié)合位點可能位于亞基的界面之間或者疏水表面，其中位于亞基界面的結(jié)合位點數(shù)少且結(jié)合常數(shù)較大。Guo Jun等測得大豆分離蛋白與香氣物質(zhì)的高親和力一級結(jié)合位點數(shù)范圍為1～2、結(jié)合常數(shù)范圍為14 000～20 000 L/mol，而低親和力的二級結(jié)合位點數(shù)范圍為1～11、結(jié)合常數(shù)范圍為100～1 500 L/mol，對比可知，2-甲基吡嗪與豌豆分離蛋白的結(jié)合位點數(shù)較多且結(jié)合常數(shù)較小，推測2-甲基吡嗪與豌豆分離蛋白的結(jié)合位點位于疏水表面。加熱使豌豆分離蛋白結(jié)構(gòu)去折疊，并且未發(fā)生聚集，蛋白質(zhì)表面暴露出更多疏水性基團，同時加熱后使豌豆分離蛋白與2-甲基吡嗪的結(jié)合率升高，因此推測加熱后2-甲基吡嗪的結(jié)合位點也位于豌豆分離蛋白疏水表面。此外，由于2-甲基吡嗪具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此空間位陰較大，難以進入蛋白內(nèi)部的疏水空腔，因此更易結(jié)合在疏水表面。

3 結(jié) 論

本實驗采用GC-MS、熒光光譜等方法分析熱處理對豌豆分離蛋白結(jié)合典型牛肉香氣物質(zhì)的影響，探究了結(jié)合率與香氣物質(zhì)和蛋白性質(zhì)的相關(guān)性，明確了豌豆分離蛋白和2-甲基吡嗪的相互作用機理。研究發(fā)現(xiàn)，疏水系數(shù)（log）較大的2-甲基-3-巰基呋喃和(,)-2,4-癸二烯醛與豌豆分離蛋白的結(jié)合率在常溫和熱處理后均大于98%，結(jié)合率不受加熱影響。常溫下5-羥乙基-4-甲基噻唑（（80.34±7.68）%）和2-甲基吡嗪（（17.58±0.58）%）與豌豆分離蛋白的結(jié)合率低于前2 種香氣物質(zhì)，隨著溫度升高，空間位陰較大的5-羥乙基-4-甲基噻唑的結(jié)合率降低，而低log的2-甲基吡嗪的結(jié)合率升高，經(jīng)過120 ℃加熱和延長加熱時間后，這2 種香氣物質(zhì)與豌豆分離蛋白的結(jié)合均增強。天然和熱變性豌豆分離蛋白和2-甲基吡嗪的相互作用力均為氫鍵和范德華力，熒光猝滅機制為靜態(tài)猝滅，為焓驅(qū)動反應(yīng)，2-甲基吡嗪在豌豆分離蛋白的結(jié)合位點位于蛋白疏水表面。熱處理使蛋白內(nèi)部疏水基團暴露，四級結(jié)構(gòu)解離，并且在低離子濃度和低離子強度下不再聚集，導(dǎo)致位于疏水表面的2-甲基吡嗪結(jié)合位點暴露增加，促進豌豆分離蛋白結(jié)合2-甲基吡嗪。本研究結(jié)果對更好地理解熱處理下豌豆蛋白基植物肉中牛肉香氣物質(zhì)結(jié)合的變化及指導(dǎo)工藝開發(fā)具有重要意義。