銅對(duì)蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞過(guò)程抗生素抗性基因的影響

田雪力,李仲瀚,楊鳳霞,韓秉君,張克強(qiáng) (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所,天津 300191)

近年來(lái),養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展產(chǎn)生大量的畜禽糞便,導(dǎo)致環(huán)境壓力驟增.2018年全國(guó)牛糞年產(chǎn)量1.82億 t[1].我國(guó)每年畜禽糞污綜合利用率不足 60%[2],如何做好畜禽糞污的無(wú)害化處理與資源化利用,提高糞污綜合利用率成為亟待解決的問(wèn)題.另一方面,牛糞不僅含有豐富的有機(jī)質(zhì)[3],而且含水量大、保水性強(qiáng)、透氣性好、發(fā)熱量低,是蚯蚓養(yǎng)殖較理想的基料.

為了促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量,重金屬常被用做添加劑被廣泛添加在畜禽飼料中[4],其中只有少部分被吸收利用,大部分重金屬以糞便的形式排出[5].與此同時(shí),畜禽糞便中也檢出豐富抗生素抗性基因(ARGs).研究發(fā)現(xiàn),磺胺類、四環(huán)素類抗性基因在牛場(chǎng)中被普遍檢出[6-7].谷艷茹等[8]除了有上述發(fā)現(xiàn)外,在糞便中檢出了blaOXA-1、blaTEM-1和blaampC等與人類健康密切相關(guān)的 β-內(nèi)酰胺類 ARGs.研究還發(fā)現(xiàn)糞便中ARGs的豐度與其含有的抗生素以及砷、銅等重金屬濃度顯著相關(guān),且砷、銅等重金屬和抗生素的復(fù)合污染可以增加環(huán)境中 ARGs的豐度[9].另外,在重金屬污染地區(qū)發(fā)現(xiàn)微生物不僅對(duì)重金屬產(chǎn)生抗性,并且還能對(duì)多種抗生素產(chǎn)生抗藥性,且ARGs水平隨重金屬污染水平增加而增加[10].Stepanauskas等[11]在微宇宙實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水中ARGs及耐藥菌的檢出頻率隨重金屬暴露濃度的升高而升高.目前國(guó)內(nèi)外缺少重金屬對(duì)蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞過(guò)程中ARGs影響的研究.在重金屬存在的情況下蚯蚓轉(zhuǎn)化引起ARGs的變化尚不完全明確.

本研究選取牛糞中殘留量最高的重金屬Cu為研究對(duì)象,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),追蹤考察不同濃度Cu脅迫下蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞過(guò)程中ARGs的消長(zhǎng)變化.通過(guò)測(cè)定不同Cu濃度處理組及其不同轉(zhuǎn)化時(shí)段樣品中 ARGs的豐度,并分析蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞過(guò)程中不同環(huán)境因子(TN、TP、含水率、TOC、pH值等)的變化規(guī)律及其對(duì) ARGs的貢獻(xiàn),旨在揭示蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞過(guò)程中重金屬影響 ARGs的潛在機(jī)制,為采取適合措施以減輕蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中ARGs的傳播提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蚯蚓為赤子愛(ài)勝蚓(Eisenia fetida),為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),單體重 0.50g左右.試驗(yàn)前將蚯蚓在牛糞環(huán)境下馴化30d,實(shí)驗(yàn)時(shí)挑選健康、帶有明顯生殖環(huán)帶的蚯蚓,用無(wú)菌水清洗表面后放置于裝有濕潤(rùn)濾紙的干凈燒杯中,暗環(huán)境下保持 24h,使其排出體內(nèi)糞便.

供試牛糞采自本實(shí)驗(yàn)站自養(yǎng)泌乳奶牛,經(jīng)混勻后自然堆肥15d.其基本理化性質(zhì)為:pH值為7.8、含水率為81.3%、總氮為2.24%、總磷為1.42%.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)體系以牛糞為主料,添加少量養(yǎng)殖基質(zhì)供蚯蚓生存,共設(shè)5個(gè)處理,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù).其中,CK為無(wú)蚯蚓對(duì)照組;CF(未添加 Cu+蚯蚓)、T1(低濃度100mg/kg Cu脅迫+蚯蚓)、T2(中濃度500mg/kg Cu脅迫+蚯蚓)、T3(高濃度1000mg/kg Cu脅迫+蚯蚓)為處理組.重金屬選取奶牛養(yǎng)殖過(guò)程中飼料常用添加劑且生物毒性較強(qiáng)的Cu進(jìn)行試驗(yàn),根據(jù)牛糞中重金屬Cu的實(shí)際殘留量范圍(5～1257mg/kg)設(shè)置3個(gè)濃度梯度.

按照分組要求將牛糞用重金屬Cu處理,具體方法:用無(wú)菌蒸餾水將牛糞調(diào)整至含水量 70%左右,向不同試驗(yàn)處理組加入不同量的重金屬 CuSO4,使得兩者在牛糞基質(zhì)中添加濃度梯度分別為100,500,1000mg/kg,混勻后分別裝入塑料養(yǎng)殖盒(盒底直徑11cm,盒口直徑 15cm,盒高 7.5cm)中,并做好標(biāo)記,每盒裝200g;而空白組即為未添加重金屬Cu作為對(duì)照;然后取30 條蚯蚓均勻地放置在每盒的牛糞基料上,盒子四周用鋁箔紙做避光處理,并用 3 層紗布封蓋,保證透氣并防止蚯蚓逃跑,同時(shí)為保持水分和濕度,通過(guò)計(jì)重方式每隔2d噴灑一次無(wú)菌水.培養(yǎng)過(guò)程中,于第1,7,14,28,35,42,49d進(jìn)行破壞性取樣,收集蚯蚓與培養(yǎng)基質(zhì).

1.3 分析指標(biāo)與測(cè)定方法

1.3.1 理化指標(biāo) 樣品測(cè)定理化指標(biāo)和方法詳見(jiàn)表1[12].

表1 樣品測(cè)定指標(biāo)與方法Table 1 Indicators and methods of sample determination

1.3.2 DNA提取 采用Fast DNA SPIN Kit for soil試劑盒(MP Biomedicals, LLC, Santa Ana, CA, 美國(guó))按操作手冊(cè)對(duì)0.5g糞便進(jìn)行DNA提取,采用超微量紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) Nano Drop 2000 (Thermo Fisher, USA) 和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA質(zhì)量.提取與檢測(cè)完成后,將 DNA 樣品放置于-20℃冰箱中暫存.

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 本研究對(duì) 8類 24個(gè)ARGs進(jìn)行 qPCR檢測(cè),即磺胺類抗生素抗性基因sul-ARGs (sul1、sul2)、四環(huán)素類抗生素抗性基因tet-ARGs (tetO、tetQ、tetW、tetL、tetX)、喹諾酮類抗生素抗性基因qnr-ARGs (qnrS、qnrB、oqxB)、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性基因 erm-ARGs (ermB、ermC),鏈霉素類抗生素抗性基因 str-ARGs (strA、strB、aadA)、β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因bla-ARGs(blaGES-1、blaOXA-1、blaTEM-1、blaampC)、多粘菌素抗性基因(mcr-1)、氯霉素抗性基因(cfr、fexA).使用儀器7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR分析.根據(jù)提取DNA樣品的濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍,研究中將 DNA樣品用ddH2O進(jìn)行10倍稀釋.qPCR反應(yīng)體系為20.0μL,包括 10.0μL TB Green Premix Ex Taq(Tli RNase H Plus, Takara)、上下游引物各 0.4μL、0.4μL ROX Reference Dye II、6.8μL ddH2O 和 2.0μL DNA 模板.每個(gè) DNA模板設(shè)置 3個(gè)平行,無(wú)菌水為陰性對(duì)照,qPCR反應(yīng)程序和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照文獻(xiàn)[13].

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS V22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析,以 P＜0.05作為差異顯著水平.采用 R 軟件的pheatmap包制作熱圖,Origin 95繪制了柱狀圖和折線圖,RDA分析采用CANOCO 5軟件.數(shù)據(jù)的相對(duì)豐度(ARGs copies/16S rRNA gene copies)、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算均使用Microsoft Excel 2007.

2 結(jié)果與討論

2.1 蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞過(guò)程中 ARGs的賦存多樣性特征

在考察的24種ARGs亞型中,僅qnrS未檢出,其余 23種亞型在蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞的不同時(shí)間階段均有檢出,其檢出頻率范圍為2.90%～100%.總體來(lái)看,磺胺類(sul-ARGs)、四環(huán)素類(tet-ARGs)與鏈霉素類抗性基因(str-ARGs)存在較為普遍且污染水平較高,這可能與畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中因該類抗生素價(jià)格低廉且對(duì)多種細(xì)菌具有較好抑制效果而使用較為普遍有關(guān),從而導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化底物牛糞中相應(yīng)的 ARGs賦存較為豐富[14].值得注意的是,在蚯蚓轉(zhuǎn)化過(guò)程中,與人類健康密切相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn) β-內(nèi)酰胺類 ARGs(blaNDM-1、blaGES-1、blaOXA-1、blaTEM-1、blaampC)在基質(zhì)中的檢出率也較高(40.00%～100%);而喹諾酮類抗性基因(qnrS、qnrB、oqxB)的檢出率最低,平均為39.00%.上述結(jié)果表明,蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞過(guò)程中, ARGs存在普遍,具有種類多樣、多種耐藥機(jī)制并存的污染特點(diǎn);且大部分基因可跨越這個(gè)階段,依然以一定濃度而殘留在轉(zhuǎn)化產(chǎn)物蚓糞中,增加了蚓糞的后續(xù)利用風(fēng)險(xiǎn)[15-16].

如圖1所示,在CK中,除了qnr-ARGs及mcr-1,其他類ARGs均普遍存在.其中, tetW、tetX、sul1、sul2、strA、strB和aadA賦存水平相對(duì)較高,數(shù)量級(jí)高達(dá) 10-4～10-1copies/16S copies;而喹諾酮類 ARGs中qnrS和oqxB的相對(duì)豐度僅為10-8～10-7copies/16S copies.在不同濃度 Cu處理組的處理全過(guò)程,相對(duì)豐度較高的亞型為sul1、sul2,這可能是因?yàn)橹亟饘貱u驅(qū)動(dòng)了含有sul1和sul2的細(xì)菌宿主的選擇[17].在本研究中檢測(cè)的關(guān)于tet-ARGs中,豐度最高的基因亞型為酶修飾基因tetX,且隨著Cu濃度升高tetX豐度也升高,原因可能是添加的重金屬濃度不同導(dǎo)致蚯蚓腸道菌群存在差異[18].值得注意的是,與未添加蚯蚓的CK處理組相比,添加蚯蚓的處理組CF、T1、T2和T3中ARGs的賦存多樣性有所降低,此結(jié)果表明蚯蚓對(duì)部分 ARGs具有較好去除效果.此外,從相對(duì)豐度來(lái)看,添加蚯蚓CF與未添加蚯蚓組CK相比,添加蚯蚓有助于鏈霉素類抗性基因 strB的去除.然而,蚯蚓轉(zhuǎn)化后,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物蚓糞中依然存在多種ARGs.Ding等[19]對(duì)長(zhǎng)期施用雞糞及污泥的土壤蚯蚓腸道中的 ARGs進(jìn)行研究中也發(fā)現(xiàn),飼喂雞糞和污泥后顯著增加了蚯蚓腸道中ARGs的豐度及多樣性,蚯蚓作為動(dòng)物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵,腸道 ARGs豐度和多樣性的增加說(shuō)明蚯蚓腸道是 ARGs的儲(chǔ)存庫(kù),這可能也是蚯蚓轉(zhuǎn)化污泥及畜禽糞便難以完全去除ARGs的原因之一.

圖1 蚯蚓轉(zhuǎn)化過(guò)程中不同時(shí)間階段ARGs豐度的變化Fig.1 Changes in the abundance of ARGs at different time stages during earthworm conversion

由圖2可見(jiàn),不同Cu濃度處理下ARGs總豐度呈現(xiàn)出 CF＜CK＜T3＜T1＜T2 的趨勢(shì),整體相對(duì)豐度水平在0.43～2.78的范圍內(nèi).與CK處理相比,加入蚯蚓后(CF組)ARGs的總豐度從0.53降低至0.43.但加入低濃度和中濃度的Cu可顯著提高樣品中ARGs的總豐度水平(P＜0.05),且中濃度處理組T2中的ARGs豐度水平增加最高,總豐度可達(dá) 2.78,其次為低濃度處理組T1處理,ARGs總豐度亦達(dá)1.43.在一定范圍內(nèi),隨著Cu濃度的增加,ARGs總豐度也增加,此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了重金屬可以通過(guò)協(xié)同選擇和交叉選擇增加ARGs的豐度[12].Cu濃度最高的T3處理組中ARGs的總豐度低于T1和T2組,這主要是因?yàn)榈汀⒅袧舛鹊腃u對(duì)ARGs篩選與傳播的促進(jìn)作用致使T1和T2組ARGs豐度增加[20],而高濃度Cu對(duì)微生物活性的抑制作用又限制了T3處理組中ARGs的增殖[21].從ARGs的類別來(lái)看,不同Cu濃度處理下樣品中的優(yōu)勢(shì)基因主要為sul1、sul2和tetX,各處理中ARGs水平最高的亞型均為sul2 (0.02～1.96),占總豐度的 35.87%～83.55%.此外,雖然與人類健康密切相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)bla-ARGs在總豐度中占比較低,但其中的 blaOXA-1、blaTEM-1和 blaampC亞型檢出率極高,分布廣泛,也應(yīng)引起重視.

圖2 不同Cu濃度處理下基質(zhì)中ARGs的總相對(duì)豐度Fig.2 Total relative abundance of ARGs in the substrates with different levels of Cu

2.2 蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞過(guò)程中不同作用類型 ARGs的消長(zhǎng)變化規(guī)律

圖3 不同種類ARGs在不同時(shí)間階段的變化Fig.3 Changes of different types of ARGs at different time stages

在所檢測(cè)的8類ARGs中,sul-ARGs的豐度最高,bla-ARGs的豐度最低.同類ARGs在不同處理組中的消長(zhǎng)趨勢(shì)存在差異,如 sul-ARGs,在對(duì)照組CK的相對(duì)豐度在第 7d達(dá)到最大值,然后降低并趨于穩(wěn)定;在CF和T3處理組sul-ARGs的相對(duì)豐度在蚯蚓轉(zhuǎn)化過(guò)程中的變化趨勢(shì)與CK對(duì)照組基本一致;但 T1和 T2處理組中sul-ARGs的相對(duì)豐度在第14d達(dá)到最大值,峰值出現(xiàn)時(shí)間后移,且 T2在第 7d和14d sul-ARGs的相對(duì)豐度顯著(P＜0.05)高于CK和CF的峰值.對(duì)于tet-ARGs,在CK、T1和T3處理組均在第14d達(dá)到峰值,隨后趨于平穩(wěn).而T2組峰值則出現(xiàn)在第7d,第14d出現(xiàn)豐度下降,隨后趨于平穩(wěn).與sul-ARGs和tet-ARGs不同,str-ARGs 在CK、T1、T2和T3的最大值均出現(xiàn)在第14d,且在所選定的8類抗性基因中,蚯蚓轉(zhuǎn)化對(duì)str-ARGs的去除效果最好,且中濃度Cu處理組T2對(duì)str-ARGs去除效果最佳.

低濃度和高濃度的Cu(T1、T3)處理提高了蚯蚓轉(zhuǎn)化不同階段中大部分的 ARGs的豐度,如 tet-ARGs、erm-ARGs和str-ARGs.這表明糞污中重金屬Cu的殘留會(huì)導(dǎo)致蚯蚓轉(zhuǎn)化過(guò)程中多類ARGs的富集.錢(qián)勛[22]研究了畜禽糞便中殘留的重金屬Cu和Zn對(duì)好氧堆肥過(guò)程中 ARGs的影響,發(fā)現(xiàn)模擬的 2個(gè) Cu濃度(200和 500mg/L)均增加了包括四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類中5種ARGs亞型的豐度.Li等[23]發(fā)現(xiàn) 2000mg/LCu顯著提高了堆肥過(guò)程中微生物對(duì)泰勒菌素和萬(wàn)古霉素的抗性.而在中濃度 Cu處理組 T2中,sul-ARGs、tet-ARGs和 str-ARGs的豐度在蚯蚓轉(zhuǎn)化后均較初始值降低,此結(jié)果可能是因?yàn)樵摑舛鹊腃u通過(guò)促進(jìn)蚯蚓的生長(zhǎng),提高了蚯蚓的處理效率,進(jìn)而降低了牛糞中的 ARGs,此種猜測(cè)有待進(jìn)一步證實(shí).

2.3 不同Cu濃度脅迫下蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞前后ARGs的差異分析

由圖4可見(jiàn),經(jīng)過(guò) 49d的蚯蚓轉(zhuǎn)化后,產(chǎn)物中大多數(shù)ARGs有降低現(xiàn)象,而部分亞型如sul2、strA和blaGES-1的含量水平經(jīng)蚯蚓轉(zhuǎn)化后卻在所有處理中豐度均出現(xiàn)升高.但亞型blaampC和qnrB在不同處理中變化不同: blaampC中CF處理升高,其余處理降低.說(shuō)明加入蚯蚓導(dǎo)致其升高,但是加入重金屬Cu后對(duì)其有去除作用,且差異顯著(P＜0.05).基因qnrB在T1和T2處理中升高,其余處理中降低.tetX的豐度在對(duì)照組CF中未顯著降低,可能是因?yàn)樵摶蛑饕嬖谟诟锾m氏陰性菌中[22],較難去除,但由于試驗(yàn)組中高濃度 Cu 對(duì)革蘭氏陰性菌具有抑制作用[24],從而導(dǎo)致tetX的豐度在添加Cu濃度最高的處理組T3中的增長(zhǎng)得到了一定程度的控制.

圖4 蚯蚓轉(zhuǎn)化前后ARGs的變化Fig.4 ARGs of earthworms before and after conversion

tetL為外排泵基因,存在于細(xì)菌細(xì)胞膜上,可外排抗生素等毒性物質(zhì),添加重金屬 Cu對(duì)tetL的去除在CK、CF、T1和T3組中有抑制作用.這是因?yàn)榧?xì)菌暴露于Cu存在的環(huán)境中時(shí),生物膜將會(huì)被誘導(dǎo)生長(zhǎng),同時(shí)導(dǎo)致存在于細(xì)菌細(xì)胞膜上的外排泵基因增多[25].蚯蚓轉(zhuǎn)化前牛糞中未檢出 oqxB基因,但蚯蚓轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)oqxB基因,這可能是由于蚯蚓腸道中存在oqxB基因,后經(jīng)過(guò)腹轉(zhuǎn)化進(jìn)入蚓糞樣品.后續(xù)研究可以針對(duì)蚯蚓腸道進(jìn)行研究.

2.4 蚯蚓轉(zhuǎn)化過(guò)程中 ARGs的變化與環(huán)境因子的關(guān)系

為了探討造成蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞過(guò)程中ARGs變化的潛在因素,本研究通過(guò)冗余分析確定 ARGs與重金屬及環(huán)境因子之間的關(guān)系.研究發(fā)現(xiàn),對(duì)樣品中ARGs差異影響最大的因素是pH值含量,占貢獻(xiàn)率的55.10%.如圖5所示,含水率與基因tetM、tetW、tetL、tetQ、strA、aadA、strB、blaNDM-1、cfr、fexA、blaTEM-1、sul2、mcr-1和 blaGES-1成正相關(guān),含水率升高,上述基因豐度增加,故在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中可以在保證蚯蚓存活的條件下降低養(yǎng)殖基質(zhì)中的含水率以抑制 ARGs豐度增加.Cu與抗生素抗性基因blaOXA-1、blaampC、blaNDM-1、blaOXA-1、oqxB、qnrB、tetO、tetW、tetX、tetL、tetM、ermB、ermC和fexA呈正相關(guān)(P＜0.05).此外,大部分ARGs指向Cu處理所在的第三象限,說(shuō)明Cu的加入使得ARGs的相對(duì)豐度增加.Cu是影響ARGs豐度的重要因素,前人研究也得到了類似的結(jié)果[26].已有研究也表明重金屬可以通過(guò)協(xié)同選擇和交叉選擇增加ARGs的豐度[10].重金屬在環(huán)境中很難降解,可以對(duì)環(huán)境中的 ARGs產(chǎn)生持續(xù)性的選擇壓力.亦有研究報(bào)道土壤中攜帶ARGs的細(xì)菌可以通過(guò)植物組織氣孔或機(jī)械損傷轉(zhuǎn)移并存在于植物根內(nèi),隨著植物的生長(zhǎng) ARGs可以到達(dá)植物葉片[27-28],進(jìn)而進(jìn)入生物鏈[29].蚓糞含有多種重金屬和ARGs[1],如果直接施用于農(nóng)田,可能存在ARGs沿食物鏈擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn).

圖5 蚯蚓轉(zhuǎn)化過(guò)程中ARGs的消長(zhǎng)與環(huán)境因子之間的關(guān)系Fig.5 Relationship between changes in ARGs and physicochemical properties during earthworm conversion

牛糞樣品中的TN和TP水平也是造成樣品間差異的部分原因,這表明動(dòng)物的飼料結(jié)構(gòu)可能會(huì)影響牛糞樣品的 ARGs[30].pH值變化可能會(huì)抑制微生物的自我復(fù)制過(guò)程,從而對(duì) ARGs的傳播產(chǎn)生影響,這與前人研究相一致[31].綜上,蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞雖然在一定程度上降低了牛糞中 ARGs的多樣性和豐度,但在處理后的蚓糞中仍有ARGs,其中包括高風(fēng)險(xiǎn)的bla-ARGs,它們?cè)隍球攫B(yǎng)殖環(huán)境、農(nóng)田環(huán)境甚至食物鏈的殘留和流動(dòng)不容忽視.

3 結(jié)論

3.1 ARGs遍布蚯蚓轉(zhuǎn)化全過(guò)程,且污染最為嚴(yán)重的是 sul-ARGs(sul1 和 sul2,10-3～100),其次是 tet-ARGs(tetX、tetW和tetO,10-4～100)和str-ARGs(strA、strB 和 aadA,10-1～10-3),令人擔(dān)心的是,一些與人類健康密切相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)ARGs (如blaampC、blaOXA-1和blaTEM-1)在蚯蚓轉(zhuǎn)化過(guò)程中亦普遍存在.

3.2 蚯蚓轉(zhuǎn)化可加速牛糞中 ARGs的削減,與未加入蚯蚓的 CK處理相比,加入蚯蚓的 CF處理中ARGs的平均總豐度由 5.28×10-1copies/16S copies削減至 4.33×10-1copies/16S copies,且發(fā)現(xiàn)蚯蚓轉(zhuǎn)化對(duì)str-ARGs的去除效果較佳,中濃度Cu處理組的效果最優(yōu).

3.3 不同Cu濃度脅迫下,不同類型ARGs在蚯蚓轉(zhuǎn)化過(guò)程中的消長(zhǎng)規(guī)律存在差異,且糞污中 Cu 的殘留可導(dǎo)致蚯蚓轉(zhuǎn)化過(guò)程中多類 ARGs的富集,其累積總豐度整體呈現(xiàn)出 CF(未添加 Cu)＜T3(高濃度,1000mg/kg)＜T1(低 濃 度 ,100mg/kg)＜T2(中 濃 度 ,500mg/kg)的趨勢(shì).

3.4 蚯蚓轉(zhuǎn)化牛糞過(guò)程中,牛糞基質(zhì)理化因子的變化對(duì) ARGs的消長(zhǎng)起到了直接或間接的作用,其中pH值是影響ARGs增殖擴(kuò)散的主要因子,通過(guò)明確該過(guò)程中ARGs變化的影響因素對(duì)于進(jìn)一步優(yōu)化牛糞-蚯蚓養(yǎng)殖環(huán)境、削減 ARGs豐度、抑制 ARGs的傳播有重要作用.