金魚藻過氧化物酶降解雙酚A的特性

董桃杏,張國森,楊 劭 (1.華中師范大學生命科學學院,湖北 武漢 40079；2.湖北第二師范學院化學與生命科學學院,湖北 武漢 40205；.河南大學基礎醫(yī)學院,河南 開封 475004)

雙酚 A(BPA)是一種重要的有機化工原料,被用于多種精細化工產品[1-2].BPA具有雌激素活性,對生物和人體細胞具有生物學毒性,是一種典型的環(huán)境激素類污染物[3].在BPA的生產、加工和使用過程中,大量的 BPA 被釋放到環(huán)境中,隨地表徑流輸入,導致水體成為BPA的主要蓄積庫.據(jù)報道BPA 在世界上很多水環(huán)境中都有發(fā)現(xiàn),被檢測出來的濃度范圍0.33～900ng/L[4-8].水環(huán)境中BPA產生的人類健康和生態(tài)風險已經(jīng)引起廣泛關注[9-13],并成為歐盟水框架指令中首要控制的污染物之一[14].

生物降解是水環(huán)境 BPA 消除的主要途徑.許多微生物能夠利用環(huán)境中天然的芳香族化合物作為底物,從而高效降解BPA.Oshiman等[15]從受污染的土壤中篩選到的 Sphingomonas bisphenolicum strain AO1 能夠以 BPA為唯一碳源和能源迅速礦化 BPA.真菌類比如木質素真菌(Lignolitic fungi)也具有高效降解 BPA的能力,并且其降解產物完全沒有雌激素活性[16-17].對生物降解 BPA的機制進行研究發(fā)現(xiàn),POD發(fā)揮著重要的作用.據(jù)報道真菌中降解BPA的關鍵酶主要包括木質素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)以及多功能過氧化物酶(VP)[18].植物POD也在BPA降解過程中扮演著重要角色.如辣根POD可以降解61%的BPA[19].在腐殖酸催化情況下,辣根POD在2min內就將BPA完全降解[20].Reis等[21]也認為POD是水生植物降解BPA的主要酶.

本文前期進行過大量的植物篩選,通過比選常見水生植物如金魚藻、輪葉黑藻、伊樂藻、狐尾藻等對 BPA的降解能力,發(fā)現(xiàn)金魚藻降解效率最高而富集率最低,分別為98.9%和 0.1%,而其他幾種水生植物降解率則為59.2%～90.3%,富集率為0.97%～3.5%[22].另外金魚藻對BPA的單位降解效率最高可以達到 0.204mg/(g·d),遠遠高于其他陸生植物和水生植物[23-25].通過相關實驗發(fā)現(xiàn)H2O2是降解過程的必須條件,推測POD是金魚藻降解BPA的關鍵酶[26].由于水生植物是濕地生態(tài)系統(tǒng)的主要生物類群,其對污染物的降解在濕地污染生態(tài)學中具有重要科學意義.雖然有關陸生植物對 BPA的降解效率和降解酶已有報道,但沉水植物降解 BPA的特性和機制尚無深入研究.因此,本文在前期研究的基礎上,選擇降解BPA效率最高的金魚藻,探討金魚藻純化POD的酶學特點以及對 BPA的降解性能,旨在揭示沉水植物高效降解水環(huán)境中BPA污染物的機制,及POD在此降解過程中發(fā)揮的重要作用,為水環(huán)境中 BPA的植物修復提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金魚藻(Ceratophyllum demersum L.)采自湖北武漢東湖.

受試斑馬魚為成年雄性魚,購于中科院武漢水生生物研究所,在 50cm×30cm×40cm的水族箱中馴養(yǎng)1個月,每天光照12h,水溫為(28±1)℃,每天早晚各喂食1次,馴養(yǎng)結束后選擇大小一致的斑馬魚進行實驗.

BPA標準品(純度 97%)購自美國 Acros Organics公司,用色譜級甲醇(TEDIA,美國)配置成20mmol/L的母液待用, 4℃保存.乙腈(色譜純)購自美國 TEDIA公司.高效液相色譜儀為SHIMADZU LC20AT(日本).

1.2 金魚藻無菌苗的制備與培養(yǎng)

參照Zhou等[27]的方法,將采集來的野生苗材料消毒預處理后,轉入含有1/2MS (pH5.5)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng),待萌發(fā)新芽后擴繁培養(yǎng),取培養(yǎng) 4代后的無菌苗用于實驗.

1.3 金魚藻POD粗酶的提取及酶活力測定

金魚藻 POD粗酶的提取按照周艷虹等[28]的方法進行改進,具體過程為:稱取0.2g 鮮重的金魚藻無菌苗放入預冷的研缽中,置于冰上,加入3mL預冷的50mmol/L pH 7.8的磷酸鹽緩沖液,充分研磨均勻后轉入10mL 離心管內,用3mL緩沖液將研缽潤洗2次,一并轉入離心管內,4℃ 12000r/min離心 10min,上清即為POD粗酶液.

POD活力測定參考Kochba等[29]的做法.具體過程為:100μL粗酶上清液加入到2900μL的反應體系中,每隔20s測定470nm下的OD值,以OD470變化0.01為1個酶活力單位,計算POD活力.反應體系由5μmol/L 愈創(chuàng)木酚,12μmol/L H2O2,200μmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液組成.

酶相對活性測定是以溫度30℃,pH 6以及H2O2濃度為1mmol/L條件下酶活為100%,其他處理條件下測定的酶活與之相比計算所得.

1.4 金魚藻POD的純化和純度測定

取粗酶上清,經(jīng)硫酸銨分級沉淀,取60%～90%沉淀部分,用提取緩沖液溶解后 4℃透析過夜.使用AKTA 蛋白純化系統(tǒng)(PRIFER100,美國 GE)對透析后的粗酶溶液進行純化,共 2步純化.第一步用陰離子交換柱進行純化,收集280nm波長下的峰,并進行過氧化物酶活測定,同時測定蛋白濃度,計算比酶活力與回收率.第二步用葡聚糖凝膠 G75將上述收集到的具有酶活力的峰進行純化,收集 280nm波長下的峰,并進行過氧化物酶活測定,將具有過氧化物酶活力的峰進行冷凍干燥濃縮,測定蛋白濃度,計算比酶活力與回收率.將純化后的蛋白進行 SDS-PAGE和Native-PAGE電泳分析[30].

金魚藻POD的純度可用Rz值表示[31]

式中:OD403為血紅素輔基的吸光值;OD280為樣品中總蛋白吸光值;一般認為Rz＞2時,酶的純度較高.

1.5 不同理化條件對金魚藻POD活力的影響

分析不同溫度、pH值、H2O2濃度等條件金魚藻POD活力的影響,反應體系與上述相同.將100μL濃度為50U/mL的純化POD與反應體系混合均勻,在不同溫度、pH值、H2O2濃度條件下處理后測定金魚藻 POD活力.其中溫度梯度為10,20,30,40,50,60,70,80,90℃; pH值梯度為3,4,5,6,7,8,9; H2O2濃度梯度分別為0.2,0.5,1,5,10,20mmol/L.

1.6 金魚藻POD降解BPA的特性分析

在降解體系中加入各不同處理,混合均勻后置于溫度為30°C、光照為50μmol/(m2·s)的條件下進行反應,比較溫度對降解率影響的實驗則將混合液放在對應溫度梯度下.降解體系由濃度為0.02mmol/L的BPA及1mmol/L的H2O2和無菌蒸餾水組成,純化金魚藻 POD體積為100μL,總體積為20mL;每個處理設置 3個平行,對照組加入等量酶提取緩沖液代替純化酶液,每隔15min測定反應體系中BPA的濃度.其中POD濃度處理為5,10,25和50U/mL 4個梯度;另外幾個條件實驗中 POD濃度均設置為50U/mL,其中 H2O2濃度為0.5,1,5,10,20mmol/L;溫度為10,20,30,40,50,60,70,80,90°C;pH值為3,4,5,6,7,8,9.

動力學參數(shù)測定:取 50U/mL的純化金魚藻POD酶投入到含有4×10-5～0.02mmol/L的BPA反應體系中,每隔15min測定反應體系中BPA的濃度,測定米氏常數(shù) Km和最大反應速度 Vmax并做雙倒數(shù)圖.

1.7 BPA濃度的測定

BPA的濃度采用高效液相色譜法進行測定.培養(yǎng)液中的 BPA濃度測定方法為:先將培養(yǎng)液經(jīng)過0.22μm 濾膜過濾后用于進樣檢測.高效液相色譜柱為C18反相柱(250mm×4.6mm×5μm).測定條件為流動相乙腈:超純水(含0.3%三氟乙酸)=65:35(體積比),檢測波長為紫外278nm,流速1mL/min.

1.8 斑馬魚的毒性

通過測定斑馬魚在不同實驗條件下馴養(yǎng)后血液中卵黃原蛋白(VTG)含量,來反應金魚藻 POD 降解BPA后的產物對其毒性影響.共設置3個斑馬魚暴露處理組,A組:終濃度為0.02mmol/L的BPA溶液;B組:經(jīng)金魚藻 POD完全降解A組溶液后的產物;C組:等體積甲醇代替 BPA.實驗用水為曝氣48h后的自來水,總體系為3L,BPA母液用量為3mL.每個處理組6只斑馬魚,每2只斑馬魚的血清混合作為一個平行樣,共3個平行.毒性試驗持續(xù)5d.

斑馬魚血液中卵黃原蛋白(VTG)含量測定:斑馬魚血液采集參考 Babaei等[32]的方法離心取血獲得血清.血清中的VTG含量使用斑馬魚卵黃蛋白原ELISA檢測試劑盒(南京金益柏)進行測定,具體方法參考使用說明.

1.9 數(shù)據(jù)分析

分別采用SPSS 16.0和Origin pro 8.0;不同條件處理對POD活性影響及對BPA去除率的差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA,Duncan tests);數(shù)據(jù)正態(tài)分布和均一性檢驗分別采用Kolmogorov—Smirnov test和 Levene’s test.差異顯著表示為P＜0.05.

2 結果與分析

2.1 金魚藻POD的純化

由圖1可知,在280nm紫外條件下,通過陰離子交換層析共發(fā)現(xiàn)2個蛋白峰P1和P2(圖1(a)),收集檢測后發(fā)現(xiàn)P1具有較高的POD酶活力,純化倍數(shù)為5.47倍.將該峰進一步通過葡聚糖凝膠 G-75分離,發(fā)現(xiàn)有2個蛋白峰,其中P4具有POD酶活力,即為純化的金魚藻 POD(圖1(b)),純化倍數(shù)為8.13倍,測定 Rz值為2.88,回收率達到 61.57%(表1).經(jīng)電泳分析發(fā)現(xiàn)只有一條帶,證明本純化方法較為有效.

圖1 金魚藻POD陰離子交換層析和葡聚糖凝膠 G-75過濾結果Fig.1 Ion exchange chromatography and sephadexG-75column gel filtration of POD from C.demersum

2.2 不同條件下金魚藻POD酶活特性

由圖2可見,在10℃時POD相對酶活力為55%,隨著溫度升高,POD 相對酶活力逐漸增加,40～70℃時,POD的相對酶活力均大于100%(P＜0.05),在70℃時相對酶活力最大,達到117%,說明溫度升高顯著提高了POD的酶活性,而在80℃時POD的相對酶活力仍有78.52%,表明金魚藻POD具有較寬溫度耐受范圍,在較高的溫度下仍能保持較高活性(圖2(a)).大豆POD被公認為熱穩(wěn)定性遠高于辣根POD以及其他類似POD,在70℃時仍可保持較高的活力,85℃下加熱40min仍保留50%酶活力[33-35],與大豆POD相比,金魚藻POD能承受較高溫度且保持較高活性,是一種熱穩(wěn)定性非常高的POD.

pH值對POD相對酶活性的影響也具有與溫度相似趨勢.在pH值為3時,POD相對酶活力較低,為36.1%,pH值在 5～7之間具有較高的相對酶活力,而其最適合的 pH值為5,POD相對酶活性最高,為107.5%,當pH值增至8時,該酶相對活力仍然維持在52.7%,表明金魚藻 POD具有較高的酸堿穩(wěn)定性(圖2(b)).金魚藻POD在pH值為5～7時具有較高相對活性,這一特性與大多數(shù)POD相似,如純化后的銀杏葉POD最適pH值為5[36],菠蘿蜜POD最適pH值則為6.5[37].

H2O2濃度方面,隨著H2O2濃度的升高,POD的相對酶活力呈升高后降低的趨勢,在 H2O2濃度為0.2mmol/L時,POD的相對酶活力僅為36.5%,當H2O2濃度增加至 5mmol/L時,POD的相對酶活力最高(P＜0.05),達119.22%,隨后POD相對酶活力逐漸下降(圖2(c)).H2O2是POD酶的底物之一,本研究中發(fā)現(xiàn)其最適濃度為5mmol/L.H2O2過量并不會提高酶活性,可能是因為生成更多的中間產物,從而對酶活性產生抑制作用,或者是過量的H2O2直接導致酶失活[38].

圖2 不同條件對金魚藻POD酶活力的影響Fig.2 Effect of different conditions on the activity of POD from C.demersum

2.3 金魚藻POD降解BPA的特性

通過比較不同金魚藻POD活性下BPA降解率(圖3(a)),發(fā)現(xiàn)隨著POD酶活性的增加,BPA降解率也隨之提高,當POD濃度為5U/mL時BPA已降解44.64%,在濃度增加到10U/mL時BPA降解率達到99.67%,當POD濃度為25U/mL及以上時BPA已完全降解.由此可見,金魚藻POD降解BPA的最低濃度為10U/mL.從圖3(b)可以看出,當 H2O2的濃度從0.5mmol/L增加到5mmol/L時,BPA降解率顯著升高,由 33.1%增加至 99.8%,幾乎完全降解,當H2O2的濃度進一步增加時, BPA降解率開始下降,在 H2O2濃度為20mmol/L時BPA降解率減至52.6%.表明BPA降解的最適 H2O2濃度范圍是 1～5mmol/L.金魚藻POD降解BPA的溫度適應范圍較大.在溫度為10℃時,BPA降解率即超過90%,隨著溫度增加BPA降解率逐漸升高,在 30～50℃時 BPA 的降解率全部超過99.5%;當溫度超過60℃時,POD對BPA的降解率開始下降,在溫度增加至 80℃時降解率為40.6%,不過在 90℃高溫時仍然有 18.4%的 BPA 得到降解(圖3(c)).如圖3(d)所示,在pH值為3時,BPA有55.2%得到降解.隨著pH值增加,BPA降解率也隨之提高.在pH5～7范圍內,BPA 降解率維持在 97.6%～99.8%,當pH＞7時,BPA降解率有所下降,在pH值為9時BPA降解率維持在36.2%.由此表明金魚藻POD在降解BPA時pH值的作用范圍非常寬泛,而最適降解條件發(fā)生在酸性～中性范圍.

圖3 不同條件對金魚藻POD降解BPA的影響Fig.3 Effect of different conditions on degradation rate of BPA by POD from C.demersum

杜紅霞[39]探討了辣根過氧化物酶(HRP)對 BPA的降解性能,發(fā)現(xiàn) 0.5U/mL HRP在 120min內對0.2mmol/L BPA的降解效果最好,降解率為63%,該酶促反應的最適溫度為25℃,最適pH值為6, H2O2最適濃度為0.4mmol/L.馬鈴薯過氧化物酶在濃度為200U/mL,H2O2濃度為1.0mmol/L,溫度和pH值分別為25℃和6的條件下反應10min后,可將0.8mmol/L的BPA降解99%以上[40].從潤楠成熟葉片中分離得到的 POD在濃度大于 50U/mL,H2O2濃度為0.1mmol/L,溫度為10～60℃,pH4～7的條件下,經(jīng)過3h對 0.2mg/L的 BPA清除率可達到 95%以上[41].在25℃,pH值為4～8條件下,1.28U/L的蘿卜 POD和0.8mmol/L的H2O2與0.5mmol/L BPA反應3h后,BPA濃度減少超過85%[42].由前人研究結果可知,不同植物來源POD對BPA的降解特性有著較大差別,在不同條件下對BPA的清除效率也有所不同.大多數(shù)POD都是在常溫下才具有較好的降解效果,本研究發(fā)現(xiàn)金魚藻 POD在溫度較高的情況下也能發(fā)揮很好的降解作用,這可能歸因于金魚藻POD良好的熱穩(wěn)定性,此特性也是該酶優(yōu)于其他來源POD的一個重要方面.金魚藻POD寬泛的溫度以及pH值作用范圍使其在降解 BPA時可以保持較高的活性,加上該酶與 BPA有著較高的親和能力,因此在濃度較低,時間較短的條件下可以快速降解 BPA.這些結果表明相對于其他陸生植物和水生植物而言,具有優(yōu)良特性的金魚藻 POD可能是該植物體可以高效降解BPA的重要原因.

2.4 金魚藻POD降解BPA的動力學研究

如圖4所示,擬合直線相關系數(shù)達到 0.9992,可見金魚藻POD降解BPA的反應動力學符合米氏方程.根據(jù)方程斜率和截距可計算出該反應的米氏常數(shù) Km和最大反應速度 Vmax,分別為0.09mmol/L和9.71mmol/(L·h).Km是估計反應底物與酶結合情況的平衡常數(shù).Km值越低,酶與底物的親和力越高.金魚藻POD的Km值較低,說明金魚藻POD與BPA有著較高的親和能力,這也與其高效降解 BPA的結果一致.杜紅霞[39]對辣根POD降解BPA進行了反應動力學的研究,測得的米氏常數(shù)為0.093mmol/L,與本實驗結果相近,說明金魚藻POD降解BPA的動力學特征與辣根POD比較相似.

圖4 金魚藻POD降解BPA的雙倒數(shù)曲線Fig.4 Lineweaver-Burk plot for the degradation of BPA by POD from C.demersum

2.5 BPA降解產物的毒性分析

由圖5可知,不同處理對斑馬魚血液中VTG含量有著不同的影響.A組加入BPA后第1d斑馬魚就全部死亡,因此未檢測其體內的VTG含量;B組處理中斑馬魚接觸的是金魚藻純化POD與BPA完全反應之后的混合物,溶液中含有的主要是 BPA的降解產物,沒有BPA殘留,經(jīng)測定,斑馬魚體內VTG含量為0.18mg/L;C組斑馬魚生長在自來水中,其體內VTG含量為0.22mg/L.由此可見,與空白對照C組相比, B組中斑馬魚VTG含量并未顯著增加(P＜0.05),說明金魚藻 POD將 BPA完全降解后,消除了 BPA對斑馬魚產生的致死作用,其體內雌激素含量與正常水平非常接近,表明BPA被POD降解后其降解產物對斑馬魚也不具有雌激素效應.

BPA作為一種內分泌干擾物,主要是通過引起不利的生化和生理變化來改變細胞的組織結構和組織器官的功能,從而干擾生殖效率[43].生殖系統(tǒng)中顆粒細胞通過產生雌激素在卵巢生理中起著重要的作用,而 BPA 作用的靶標已被證明是卵巢顆粒細胞,它可以通過破壞卵巢類固醇生成以及增加血管內皮生長因子(VEGF)的量來干擾顆粒細胞功能,從而對生殖效率產生重要影響[44].VTG已被廣泛用作BPA對魚類內分泌干擾標志物[45].本研究將斑馬魚暴露在金魚藻POD與BPA完全反應后的水中,測定了斑馬魚血液中VTG含量,結果表明,此含量與對照相比并沒有顯著變化,說明BPA經(jīng)金魚藻POD處理后,其對斑馬魚的雌激素效應得到清除,由此可以推斷其降解產物不再具有內分泌干擾作用.Sakuyama等發(fā)現(xiàn)與 BPA共同培養(yǎng)的雄性青鳉魚(Oryzias latipes)血液中的VTG含量顯著增加,而經(jīng)辣根POD處理BPA后,青鳉魚未出現(xiàn)雌激素活性增加的現(xiàn)象,表明HRP能夠降解BPA,因此對青鳉魚不產生雌激素效應[46],本文結果與之相一致,后續(xù)研究將對金魚藻POD對BPA的代謝產物做進一步的分析和鑒定.

沉水植物是湖濱帶河濱帶淺水水體常見水生植被,適應性強,分布廣,生物量大,是淺水水體污染物植物修復的主要工具類型[47].而BPA是一種全球性的污染物[48],水環(huán)境則是 BPA的主要富集區(qū)[49-50].因此研究水生植物對水環(huán)境中BPA的清除有著重要的生態(tài)學意義和實際應用價值.目前關于BPA降解的文章都是針對陸生植物,且研究思路主要是直接利用植物的純化POD處理水中BPA污染物,并非探討植物體對 BPA 的生物降解機制,從生態(tài)系統(tǒng)角度出發(fā)的研究報道很少,而清楚了解水生植物降解BPA污染物的機理和機制可以為實際水體植物修復工作的推廣和應用提供重要的理論依據(jù).本文前期通過植物篩選發(fā)現(xiàn),相較于其他幾種水生植物,金魚藻具有更高效降解 BPA 的能力,在此過程中 POD可能起著關鍵作用[26].本研究表明,金魚藻 POD比其他來源同類酶具有更優(yōu)越的特性,比如活性很高,溫度和 pH值作用范圍更寬泛等,這些結果可以為金魚藻對BPA的降解能力遠遠超過其他陸生植物和水生植物提供酶學依據(jù)和理論支持.另外還發(fā)現(xiàn)BPA經(jīng)金魚藻POD降解后代謝產物對斑馬魚也不產生雌激素效應.

3 結論

3.1 金魚藻POD具有較廣譜的溫度和pH范圍.在溫度為70℃,pH值為7,H2O2濃度為5mmol/L時POD酶活力最大.

3.2 金魚藻POD對水中BPA有較高的降解效率,且具有較寬的作用范圍.金魚藻POD降解BPA的最佳條件為:活力10U/mL及以上,H2O2濃度1～5mmol/L,溫度 30℃, pH 值 5～7.在此條件下,15min內對0.02mmol/L BPA的降解率可達到99.67%～100%.金魚藻 POD對 BPA的降解動力學米氏常數(shù) Km為0.09mmol/L,最大反應速度為9.71mmol/(L·h).

3.3 經(jīng)金魚藻POD降解后,BPA對斑馬魚的雌激素效應得到清除,其降解產物也不再具有內分泌干擾作用.