一個(gè)天麻共生蜜環(huán)菌菌株的培養(yǎng)基篩選

楊文權(quán)，劉 玲，吳 娜，張躍進(jìn)，孫建華，張小燕

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西漢王略陽(yáng)中藥科技有限公司，陜西 略陽(yáng) 724300；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

蜜環(huán)菌(Armillariamellea)是屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)傘菌目(Agaricales)泡頭菌科(Physalacriaceae)蜜環(huán)菌屬(Armillaria)非常重要的真菌[1]。因其含有多種倍半萜類化合物、多糖、氨基酸及各種微量元素等，具有免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用和重要的食用、藥用價(jià)值[2-4]。同時(shí)，蜜環(huán)菌又是名貴中藥材天麻(Gastrodiaelata)的共生菌，而天麻沒(méi)有根莖葉，只有開花時(shí)花莖才抽出地面，其余時(shí)間都在地下，營(yíng)養(yǎng)來(lái)源全憑共生的蜜環(huán)菌供給，因此，蜜環(huán)菌是天麻生長(zhǎng)中唯一的外來(lái)營(yíng)養(yǎng)源，是天麻栽培中不可缺少的材料[5-6]。

蜜環(huán)菌菌種在生產(chǎn)中分為三個(gè)級(jí)別，一級(jí)母種用于保存和運(yùn)輸，二級(jí)原種用于擴(kuò)大繁殖，三級(jí)栽培種用于生產(chǎn)栽培[7]。其中，一級(jí)母種培養(yǎng)基可以確保蜜環(huán)菌得以良好保藏和運(yùn)輸，三級(jí)栽培種培養(yǎng)基可以確保生產(chǎn)出優(yōu)良、健壯的蜜環(huán)菌，服務(wù)天麻生產(chǎn)，因此，在蜜環(huán)菌生產(chǎn)中非常重要。蜜環(huán)菌生長(zhǎng)過(guò)程中需要不同的營(yíng)養(yǎng)源，主要包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等[8]，已有研究表明，雖然蜜環(huán)菌可利用多種營(yíng)養(yǎng)源，但對(duì)最有效利用的營(yíng)養(yǎng)源有選擇[9]，因此，不同配方的母種和栽培種培養(yǎng)基上，蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)情況不同。在適宜的培養(yǎng)基上，蜜環(huán)菌萌發(fā)速度快，菌索白嫩、粗壯，分枝多，生物量大，不僅可以縮短蜜環(huán)菌培養(yǎng)時(shí)間，降低蜜環(huán)菌生產(chǎn)成本，而且培養(yǎng)的蜜環(huán)菌健壯，在天麻栽培過(guò)程中可快速形成菌索侵染菌棒，與天麻建立共生關(guān)系后，盡早為天麻提供營(yíng)養(yǎng)，提高天麻產(chǎn)量和質(zhì)量[10-11]。雖然蜜環(huán)菌母種和栽培種培養(yǎng)基配方已有很多研究，但由于菌株不同，研究結(jié)果差異較大，在實(shí)際中無(wú)法通用[9,12]。為此，本試驗(yàn)擬以寧強(qiáng)真菌研究所分離的1株蜜環(huán)菌MC4為對(duì)象，研究其最佳的一級(jí)母種和三級(jí)栽培種培養(yǎng)基，給該蜜環(huán)菌的商品化及蜜環(huán)菌的育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試蜜環(huán)菌菌株編號(hào)MC4，由寧強(qiáng)真菌研究所分離提供，經(jīng)rDNA-ITS序列分析鑒定為蜜環(huán)菌(Armillariamellea)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化 將MC4母種從冰箱取出，室溫黑暗放置24 h，接種到PDA平板中央，于25 ℃黑暗下培養(yǎng)，待菌索長(zhǎng)滿平板備用。

1.2.2 蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)基配方

(1)不同碳源培養(yǎng)基

1 L培養(yǎng)基，加碳源(紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米粉、麥芽浸粉)20 g，蛋白胨10 g，MgSO41 g，KH2PO42 g、瓊脂15 g。

(2)不同氮源培養(yǎng)基

1L培養(yǎng)基，加氮源(蛋白胨、酵母粉、大豆粉、牛肉膏)10 g，葡萄糖 20 g，MgSO41 g，KH2PO42 g，瓊脂15 g。

(3)不同無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基

1L培養(yǎng)基，加無(wú)機(jī)鹽(MnSO4、KH2PO4、FeSO4、MgSO4)2 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g。

1.2.3 蜜環(huán)菌栽培種培養(yǎng)基配方

(1)Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基

櫟木木屑50%，棉籽殼30%，麩皮18%，石膏1%，生石灰0.5%，蔗糖0.4%,KH2PO40.1%，料水比1∶1.4 kg·L-1，裝入5 cm×30 cm×5 cm聚丙烯袋，每袋250 g。

(2)Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基

櫟木枝條40%，水60%。其中，櫟木枝條210 g，水315 mL，裝入650 ml細(xì)口組培瓶。

(3)Ⅲ號(hào)培養(yǎng)基

櫟木枝條50%，麩皮20%，木屑20%，玉米面7%，石膏1%，白糖2%，料水比1∶1.4 kg·L-1，裝入5 cm×30 cm×5 cm聚丙烯袋，每袋250 g。

(4)Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基

櫟木枝條40%，馬鈴薯汁60%，其中馬鈴薯汁由去皮馬鈴薯200 g·L-1煮沸制成。其中，櫟木枝條210 g，馬鈴薯汁315 ml，裝入650 ml細(xì)口組培瓶。

1.2.3 培養(yǎng)基的制備 12種母種培養(yǎng)基分別按配方配制，裝入18 mm×200 mm的試管，每管裝35 ml，橡膠塞封口，121 ℃滅菌20 min，取出后自然冷卻凝固，待用。4種栽培種培養(yǎng)基封口后121 ℃滅菌4 h，備用。

1.2.4 接種 母種培養(yǎng)基每試管接活化菌株1塊(0.5 cm直徑菌塊)，栽培種每袋(瓶)接種活化菌株4塊，每處理3個(gè)重復(fù)，25 ℃，黑暗培養(yǎng)。

1.3 測(cè)試指標(biāo)

1.3.1 蜜環(huán)菌的吃料深度 蜜環(huán)菌深入試管、袋子或瓶中培養(yǎng)基的深度，每3 d測(cè)1次。

1.3.2 蜜環(huán)菌的生物量 培養(yǎng)45 d后，將試管中的培養(yǎng)基和蜜環(huán)菌菌索一起倒出，蜜環(huán)菌菌索與培養(yǎng)基分離后用蒸餾水沖洗，60 ℃烘箱烘12 h，稱重。

1.3.3 菌索的直徑 從袋子或瓶子外面，隨機(jī)挑選10個(gè)菌索，測(cè)量其直徑。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)用Excel 2016進(jìn)行初步處理，用SPSS18.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同母種培養(yǎng)基對(duì)蜜環(huán)菌MC4的影響

2.1.1 不同碳源對(duì)蜜環(huán)菌MC4生長(zhǎng)的影響 由圖1可以看出，蜜環(huán)菌MC4在以紅薯淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲萌發(fā)最早，第9 d開始萌發(fā)，在馬鈴薯淀粉培養(yǎng)基上菌絲萌發(fā)最晚，15 d以后才開始萌發(fā)。以麥芽浸粉為碳源的培養(yǎng)基菌絲萌發(fā)的最初一段時(shí)間生長(zhǎng)迅速，在21 d時(shí)，吃料深度已達(dá)8.533 cm。在4種不同碳源培養(yǎng)基中，玉米粉培養(yǎng)基上蜜環(huán)菌的菌索生長(zhǎng)速度最慢，36 d時(shí)，吃料深度只有3.833 cm，顯著低于(P<0.05)在其它3個(gè)碳源培養(yǎng)基上的吃料深度。培養(yǎng)36 d時(shí)，以紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉及麥芽浸粉為碳源的3個(gè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的蜜環(huán)菌的吃料深度無(wú)顯著差異(P>0.05)，均在12 cm左右(圖1)。

圖1 不同碳源的蜜環(huán)菌生長(zhǎng)

在4種碳源培養(yǎng)基上，蜜環(huán)菌MC4的生物量差異較大，其中馬鈴薯淀粉為碳源的培養(yǎng)基上，菌株生物量最大，干重為0.191 g，顯著高于(P<0.05)其它3種碳源培養(yǎng)基上的生物量；以玉米粉為碳源的培養(yǎng)基上，菌株MC4的生物量最少，只有0.050 g，顯著低于(P<0.05)其它3個(gè)培養(yǎng)基上的生物量；4種碳源培養(yǎng)基上菌株生物量由大到小為：馬鈴薯淀粉>麥芽浸粉>紅薯淀粉>玉米粉(圖2)。

注：不同小寫字母表示差異顯著，下同。

2.1.2 不同氮源對(duì)蜜環(huán)菌MC4生長(zhǎng)的影響 以大豆為氮源的培養(yǎng)基上，蜜環(huán)菌MC4菌絲萌發(fā)最晚，12 d以后才開始萌發(fā)。萌發(fā)后，在酵母粉培養(yǎng)基中，MC4的菌索生長(zhǎng)最快，36 d時(shí)吃料深度為12.550 cm，顯著高于(P<0.05)在其它3種培養(yǎng)基中的吃料深度(圖3)。在牛肉膏培養(yǎng)基中，MC4的生長(zhǎng)速度也較快，36 d時(shí)吃料深度為10.125 cm。在蛋白胨和大豆粉培養(yǎng)基中，MC4的生長(zhǎng)速度較慢，36 d時(shí)吃料深度分別只有6.659 cm和6.400 cm，顯著低于(P<0.05)酵母粉和牛肉膏培養(yǎng)基中的吃料深度。

圖3 不同氮源的蜜環(huán)菌生長(zhǎng)

氮源顯著影響蜜環(huán)菌的生物量，從圖4可以看出，在4種不同氮源培養(yǎng)基中，酵母粉培養(yǎng)基中的生物量最大，為0.481 g，顯著高于(P<0.05)其它3種培養(yǎng)基中的生物量。

圖4 不同氮源的蜜環(huán)菌生物量

大豆粉培養(yǎng)基中的生物量最低，只有0.119 g，顯著低于(P<0.05)其它培養(yǎng)基中的生物量。4種培養(yǎng)基中菌株的生物量由大到小依次為：酵母粉>牛肉膏>蛋白胨>大豆粉。

2.1.3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)蜜環(huán)菌MC4生長(zhǎng)的影響 4種不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)蜜環(huán)菌MC4的生長(zhǎng)影響顯著(圖5)，在FeSO4培養(yǎng)基中，MC4的菌絲不萌發(fā)，隨時(shí)間推移，培養(yǎng)基逐漸變褐變黑。在KH2PO4培養(yǎng)基中菌絲萌發(fā)最早，培養(yǎng)第9 d時(shí)開始萌發(fā)，而在MnSO4培養(yǎng)基中的萌發(fā)最晚，18 d以后菌絲才開始萌發(fā)。培養(yǎng)36 d時(shí)，KH2PO4培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度最快，吃料深度為5.700 cm，顯著高于(P<0.05)在MgSO4和MnSO4培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度，其中，在MnSO4培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度最慢，只有1.740 cm。

圖5 不同無(wú)機(jī)鹽下蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)

從圖6可以看出，培養(yǎng)基中添加不同無(wú)機(jī)鹽后，蜜環(huán)菌MC4的生物量差異較大。由于添加FeSO4后，MC4沒(méi)有生長(zhǎng)，因此生物量為零。而在添加KH2PO4的培養(yǎng)基中，MC4的生物量最大，為0.182 g，顯著高于(P<0.05)添加MgSO4和MnSO4培養(yǎng)基中的生物量。

圖6 不同無(wú)機(jī)鹽下蜜環(huán)菌的生物量

2.2 不同栽培種培養(yǎng)基對(duì)蜜環(huán)菌MC4的影響

2.2.1 不同栽培種培養(yǎng)基對(duì)蜜環(huán)菌MC4生長(zhǎng)的影響 從圖7可以看出，MC4在Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)最先萌發(fā)，但前14 d均生長(zhǎng)緩慢，14～20 d內(nèi)生長(zhǎng)迅速，后基本保持平穩(wěn)速度生長(zhǎng)，44 d時(shí)長(zhǎng)滿菌瓶。在Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基中，MC4生長(zhǎng)速度較快，33 d時(shí)已經(jīng)長(zhǎng)滿。在Ⅲ號(hào)培養(yǎng)基中，MC4萌發(fā)最晚，12 d后菌絲才開始萌發(fā)，36 d時(shí)長(zhǎng)滿整個(gè)菌袋。在Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基中，前18 d長(zhǎng)勢(shì)緩慢，后加速生長(zhǎng)，48 d時(shí)吃料深度達(dá)10.833 cm，54 d時(shí)基本長(zhǎng)滿。

圖7 不同三級(jí)栽培種培養(yǎng)基的蜜環(huán)菌生長(zhǎng)

2.2.2 蜜環(huán)菌MC4在不同栽培種培養(yǎng)基上的形態(tài)特征 從表1可以看出，在Ⅰ號(hào)和Ⅲ號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，MC4的菌絲萌發(fā)較慢，接近10 d左右，菌索形成時(shí)間也較長(zhǎng)，需要15 d左右。而在Ⅱ號(hào)和Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌絲不僅萌發(fā)時(shí)間較短，而且菌索形成時(shí)間也較快。但是，Ⅲ號(hào)和Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基上形成的菌索較粗，直徑均為0.45 cm，且均較Ⅰ號(hào)和Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基上的菌索茂密。因此，菌株在Ⅳ號(hào)三級(jí)培養(yǎng)基中不僅萌發(fā)時(shí)間短，生長(zhǎng)速度快，且菌索粗壯，分枝茂密。

表1 蜜環(huán)菌在不同三級(jí)栽培種培養(yǎng)基上的形態(tài)特征

3 結(jié)論與討論

微生物生長(zhǎng)需要碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[13]，碳源可提供菌體細(xì)胞的碳架和生命活動(dòng)所需的能量，氮源是構(gòu)成菌體蛋白質(zhì)、核酸的不可或缺的原料，而無(wú)機(jī)鹽可作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑等，參與代謝反應(yīng)[14-15]。以往的研究表明，蜜環(huán)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求并不嚴(yán)格，馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、玉米粉、麥麩、葡萄糖、蔗糖等均是其優(yōu)質(zhì)的碳源，菜籽餅、蠶蛹粉、蛋白胨、酵母浸粉、尿素等均是其常用的氮源[9，16-18]，而KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2等是常用的無(wú)機(jī)鹽[8,17]。但是，由于不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加比例及不同菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用差異，因此直接影響蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)狀況。如彭述敏對(duì)2株分離自昭通的蜜環(huán)菌的研究表明，葡萄糖為其最佳的碳源，酵母膏和蛋白胨為最佳的氮源，最適無(wú)機(jī)元素為K2SO4和KH2PO4[8]。李再新的研究表明，葡萄糖和酵母粉為蜜環(huán)菌培養(yǎng)最佳的碳、氮源[19]。程顯好通過(guò)1株蜜環(huán)菌對(duì)15種碳源和6種氮源的研究表明，碳源因素對(duì)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)的影響大于氮源因素，在以甘露糖為碳源的培養(yǎng)基上生物量最高，但在不同氮源條件下，蜜環(huán)菌都能很好的生長(zhǎng)，形態(tài)無(wú)顯著差異[20]。

本試驗(yàn)結(jié)果也表明，以馬鈴薯淀粉為碳源、以酵母粉為氮源、以KH2PO4為無(wú)機(jī)鹽的一級(jí)母種培養(yǎng)基上，蜜環(huán)菌MC4的生長(zhǎng)速度及生物量顯著高于其它培養(yǎng)基。這可能是因?yàn)橄啾锐R鈴薯淀粉、紅薯淀粉和麥芽浸粉，玉米粉的養(yǎng)分較少，所以不利于蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)，因此生長(zhǎng)速度和生物量均較低，而蜜環(huán)菌雖然在紅薯淀粉和麥芽浸粉培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度與馬鈴薯淀粉接近，但由于菌索分枝少、較細(xì)，因此生物量顯著低于馬鈴薯淀粉培養(yǎng)基。與彭述敏[8]、閆軍[21]試驗(yàn)所得蛋白胨是蜜環(huán)菌最佳氮源不同，本試驗(yàn)在以蛋白胨、酵母粉、大豆粉、牛肉膏為不同氮源的研究中發(fā)現(xiàn)，MC4在酵母粉培養(yǎng)基上的生物量最高，在大豆粉和蛋白胨中不僅吃料深度最淺，生物量也低。由此可知，不同菌株對(duì)氮源有不同喜好，以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基更適合菌株MC4的生長(zhǎng)。在添加不同無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，蜜環(huán)菌MC4在添加了FeSO4的培養(yǎng)基中沒(méi)有生長(zhǎng)，無(wú)菌絲和菌索萌發(fā)，可能是因?yàn)镕eSO4濃度過(guò)高，抑制了蜜環(huán)菌的萌發(fā)和生長(zhǎng)[22-23]。與彭述敏[8]結(jié)果一致，MC4在添加KH2PO4的培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)最好，吃料深度最深，生物量顯著高于其他處理。而在生產(chǎn)三級(jí)栽培種培養(yǎng)基時(shí)，不僅要考慮蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)速度，縮短培養(yǎng)時(shí)間，還要考慮生產(chǎn)成本和工藝的復(fù)雜性[24]。本試驗(yàn)研究表明，在以櫟木枝條40%+馬鈴薯汁60%配制的Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基上，不僅菌株萌發(fā)最早，生長(zhǎng)最快，菌索最粗，而且生產(chǎn)成本低，工藝簡(jiǎn)單，易于操作，因此列為首選栽培種培養(yǎng)基。