應(yīng)用SHIME 模型研究腸道微生物對13 種農(nóng)產(chǎn)品中腐霉利生物可給性的影響

魏 東，馮文喆，鄧雅靜，肖金京，操海群，施艷紅*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036；2. 安徽省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，合肥 230036)

農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留對人體健康的危害越來越受到廣泛關(guān)注，農(nóng)藥殘留膳食暴露評估是農(nóng)產(chǎn)品安全性評價的關(guān)鍵[1-2]。目前評估農(nóng)藥殘留對人體健康風(fēng)險的殘留分布數(shù)據(jù)主要是初級農(nóng)產(chǎn)品中殘留量或膳食攝入的食物中農(nóng)藥殘留量，忽略了人體膳食攝入食物后，可以危害人體健康的農(nóng)藥殘留僅是其可以從食物中釋放至消化液的部分[3]。生物可給性（Bioaccessibility，即食物中農(nóng)藥殘留在體內(nèi)消化過程中可被釋放至胃腸液的比值）是準確評估農(nóng)藥殘留實際暴露量的重要因素，目前已廣泛應(yīng)用于重金屬、真菌毒素以及多氯聯(lián)苯（PCBs）[4]、多環(huán)芳烴（PAHs）[5]等有機污染物健康風(fēng)險評估。

作為人體消化代謝的重要“器官”，腸道菌群在食物消化、藥物代謝及吸收等方面具有重要的作用[5]。近年來，國內(nèi)外不少學(xué)者關(guān)注了環(huán)境污染物對腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)重金屬和農(nóng)藥殘留的膳食暴露顯著影響人體腸道菌群的結(jié)構(gòu)與功能，進而誘導(dǎo)機體代謝、吸收和免疫等功能的失調(diào)。但是，對于腸道菌群影響環(huán)境污染物生物可給性的研究報道較少，且多集中于對有機污染物和重金屬，如Sun 等發(fā)現(xiàn)腸道微生物可顯著降低稻米中As（砷）的生物可給性[6]。Laird 等報道了腸道微生物對不同食物中Hg的生物可給性具有雙重作用，導(dǎo)致Hg（汞）在不同食物中生物可給性差異顯著[7]。Alava 等研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物對不同稻米中As 的生物可給性差異顯著（精米2%、印度香米12%、半煮熟米22%）[8]。農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留作為一類有機化合物，經(jīng)膳食攝入進入人體消化道，在腸道菌群的作用下，必然發(fā)生代謝與轉(zhuǎn)化，影響其生物可給性及對人體健康的風(fēng)險。目前，有關(guān)腸道菌群影響農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留生物可給性的文獻報道甚少，值得深入開展研究。鑒于此，作者以葡萄等13 種農(nóng)產(chǎn)品中常見的腐霉利為對象，應(yīng)用SHIME（simulator of the human intestinal microbial ecosystem）體外胃腸方法，研究腸道菌群對不同農(nóng)產(chǎn)品中供試農(nóng)藥生物可給性的影響，以期探明影響農(nóng)藥殘留生物可給性的主要腸道菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 農(nóng)藥標準品 腐霉利（Procymidone），純度98.3%，購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，Agilent 7890B-5977a，購于美國安捷倫科技公司；精密電子天平，AL104，購于梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；無菌操作臺，SW-CJ-1D，購于上海博訊科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供試農(nóng)產(chǎn)品樣品的制備 將經(jīng)殘留分析確定不含供試農(nóng)藥的葡萄、大豆、香蕉、青椒、玉米、蟹味菇、紫薯、花生、洋蔥、韭菜、柑橘、黃瓜和胡蘿卜13 種農(nóng)產(chǎn)品，清洗、均質(zhì)后，于-50 ℃下冷凍干燥72 h，碾碎成粉末過80 目篩。試驗前，加入適量的標準農(nóng)藥，制備成添加有供試農(nóng)藥的農(nóng)產(chǎn)品樣品，充分混勻，待有機溶劑揮發(fā)后備用。

1.2.2 腸道菌群的獲取與培養(yǎng) 人體糞便是目前眾多學(xué)者獲得腸道菌群的途徑[9]。因此，本試驗采集6名28 歲健康男性（過去一年未食用過抗生素類藥物）的新鮮糞便，用0.1 mol·L-1滅菌PBS（pH 7.0）配成20%的糞便懸浮液，充分混勻后用直徑為2 mm

的金屬篩過濾，除去大的食物顆粒。將獲得的菌懸液用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于37 ℃下避光厭氧培養(yǎng)24 h 后，接種于SHIME 模型的腸階段，每日通入氮氣15 min以保證厭氧環(huán)境，培養(yǎng)3～4 周使腸道菌群達到穩(wěn)定期后備用。通過對多組腸道菌群進行16S rDNA 測序，選取了腸道菌群豐度和結(jié)構(gòu)差異最為顯著的A 和B作為供試菌群。

1.2.3 農(nóng)藥殘留生物可給性體外測定方法 將25 mL 腸液與5 mL 培養(yǎng)穩(wěn)定的腸道菌群懸浮液混勻，添加1 g 含供試農(nóng)藥殘留的農(nóng)產(chǎn)品樣品，迅速通入氮氣10 ～ 15 min 以保障充分厭氧環(huán)境，置于37 ℃、180 r·min-1的恒溫振蕩儀，模擬體外模擬胃腸消化蠕動；分別于2、4、8、12、16 和24 h 定時取樣，進行農(nóng)藥殘留量分析測定。并設(shè)置空白對照組，在不含腸道菌群的腸液（30 mL）中添加相同量的含供試農(nóng)藥殘留農(nóng)產(chǎn)品樣品。按照如下公式計算供試農(nóng)藥殘留的生物可給性：

式中：BA為農(nóng)產(chǎn)品中腐霉利在模擬腸液中的生物可給性；C1為腐霉利在模擬腸液中的濃度，mg·L-1；V1為模擬腸液的體積，L；C為農(nóng)產(chǎn)品中腐霉利的濃度，mg·kg-1；M為加入到反應(yīng)體系中農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量，kg。

1.2.4 主要菌群對供試農(nóng)藥殘留生物可給性的影響分別選取大腸桿菌和乳酸桿菌2 種腸道優(yōu)勢菌為對象，分別用 MRS（man rogosa sharpe）及 LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基以3%的接種量活化3 次后，取單一菌落接種至50 mL 已滅菌的培養(yǎng)液，厭氧培養(yǎng)24 h 后備用。按1.2.3 操作，將其與含供試農(nóng)藥殘留的農(nóng)產(chǎn)品樣品于37 ℃厭氧條件下振蕩溫浴4、8、12、16、24 和36 h 后，定時取樣，并進行農(nóng)藥殘留量分析測定。

1.2.5 膳食成分對腸道菌群影響農(nóng)藥殘留生物可給性 選取菊粉、白藜蘆醇、蛋白質(zhì)和植物油為代表性膳食成分，分別將其添加到含供試腸道菌群的腸液（30 mL）中，添加量為0.1 g，迅速通入氮氣保證充分的厭氧環(huán)境，并按照按1.2.3 操作，將其與含供試農(nóng)藥殘留的農(nóng)產(chǎn)品樣品于37 ℃厭氧條件下振蕩溫浴，定時取樣，進行農(nóng)藥殘留量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同農(nóng)產(chǎn)品中腐霉利生物可給性的測定

葡萄等13 種農(nóng)產(chǎn)品中腐霉利生物可給性的測定結(jié)果表明（圖1）：腐霉利在花生、大豆和葡萄中的生物可給性相對較低，分別為30.3%、31.4%和35.6%；而在蟹味菇、辣椒和洋蔥中的生物可給性較高，分別為93.0%、94.0%和97.2%。其在不同農(nóng)產(chǎn)品中生物可給性的差異可能與食物膳食成分有關(guān)。

圖1 13 種農(nóng)產(chǎn)品中腐霉利生物可給性評價Figure 1 Bioaccessibility of procymidone in 13 kinds of agri cultural products

2.2 腸道菌群對不同農(nóng)產(chǎn)品中腐霉利生物可給性的影響作用

選取生物可給性相對較低的葡萄、紫薯、大豆和花生為代表，研究腸道菌群對供試農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留生物可給性影響。結(jié)果（圖2）表明，腸道菌群對4 種農(nóng)產(chǎn)品中腐霉利生物可給性的影響存在時間效應(yīng)，相較于對照組，腸道菌群作用下的農(nóng)產(chǎn)品生物可給性隨消化時間呈降低趨勢，其中以葡萄和大豆最為顯著，培養(yǎng)24 h 后，腸道菌群可使葡萄和大豆中腐霉利生物可給性在24 h 時降低32.2%和46.4%。相較兩組腸道菌群的影響作用，A 組腸道菌群在體外培養(yǎng)8 h 內(nèi)對大豆和花生中腐霉利的生物可給性影響較為明顯。

圖2 腸道菌群對葡萄（a）、紫薯（b）、大豆（c）和花生（d）中腐霉利的生物可給性的影響Figure 2 Effects of gut microbiota on the bioaccessibility of procymidone in grape (a), inpuranol (b) soybean (c) and peanut (d)

2.3 膳食成分對腸道菌群影響農(nóng)藥殘留生物可給性的作用規(guī)律

選取菊粉、白藜蘆醇、蛋白質(zhì)和植物油為代表性膳食成分，研究其對腸道菌群影響供試農(nóng)藥殘留生物可給性的作用規(guī)律。結(jié)果（圖3）表明，蛋白質(zhì)和白藜蘆醇對腐霉利生物可給性影響相對較小，相較于其他3 種膳食成分，菊粉可顯著增強腸道菌群對葡萄中供試農(nóng)藥生物可給性的影響，在其作用下可使葡萄中腐霉利生物可給性降低37.6%?？梢娋辗凼怯绊懩c道菌群降低葡萄中供試農(nóng)藥生物可給性的最主要的膳食成分。

圖3 菊粉（a）、白藜蘆醇（b）、蛋白質(zhì)（c）和植物油（d）對腸道菌群影響腐霉利生物可給性的作用規(guī)律Figure 3 Effects of inulin (a), resveratrol (b), protein (c) and vegetable oil (d) on the bioaccessibility of procymidone in gut microbiota

2.4 腸道優(yōu)勢菌對供試水果中腐霉利生物可給性的影響

研究大腸桿菌、乳酸桿菌兩種主要腸道優(yōu)勢菌對葡萄中腐霉利生物可給性影響作用。 結(jié)果（圖4）表明，大腸桿菌和乳酸桿菌對腐霉利均具有時間效應(yīng)。消化初期8 h 內(nèi)，主要菌群影響下的腐霉利生物可給性于對照組無明顯差異；12 h 后，主要菌群對腐霉利生物可給性呈顯著降低效果，且于36 h 時可使其分別降低33.9%和32.0%。以上結(jié)果表明，大腸桿菌和乳酸桿菌是影響腐霉利生物可給性的主要優(yōu)勢腸道菌。

圖4 主要菌群大腸桿菌（a）和乳酸桿菌（b）對腐霉利生物可給性的作用規(guī)律Figure 4 Effects of Escherichia coli (a) and Lactobacillus (b) on bioaccessibility of procymidone

3 討論與結(jié)論

腸道菌群可產(chǎn)生水解酶酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶等代謝酶，對口服藥物以及黃酮類、萜類、生物堿類、蒽醌類化合物等天然產(chǎn)物具有強大的代謝轉(zhuǎn)化能力[10-12]。近年來研究表明腸道菌群可顯著影響重金屬、真菌毒素以及有機污染物生物可給性。本文采用SHIME 體外胃腸模擬法，研究了腸道菌群對葡萄等13 種農(nóng)產(chǎn)品中常見的腐霉利生物可給性的影響。結(jié)果表明腸道菌群可使葡萄、大豆、紫薯和花生中的腐霉利生物可給性分別降低32.2%、46.4%、9.9%和19.8%。大腸桿菌是影響腐霉利生物可給性的主要優(yōu)勢腸道菌，其可使葡萄中腐霉利生物可給性顯著降低33.9%。表明腸道菌群是影響農(nóng)藥殘留生物可給性的重要因素。

食物基質(zhì)成分的不同對環(huán)境污染物生物可給性的影響具有顯著差異。Cai 等發(fā)現(xiàn)淡水魚和蔬菜中多氯聯(lián)苯生物可給性分別為2.0% ～ 3.0%和25.0% ～27.0%，差異顯著[13]。Yu 發(fā)現(xiàn)在體外消化模型中不同的食物對PBDEs 生物可給性在13 種供試食物中有不同的影響，多溴聯(lián)苯醚生物可給性差異顯著（2.6% ～ 41.3%），且與脂肪和碳水化合物的含量呈正相關(guān)，蛋白質(zhì)和膳食纖維的含量呈負相關(guān)[14]。本文通過膳食成分的添加，發(fā)現(xiàn)在菊粉作用下可使腸道菌群對葡萄中腐霉利生物可給性顯著降低39.6%，其主要因素可能是菊粉能夠保持腸道中有益菌的數(shù)量平衡，促進腸道益生菌的產(chǎn)生，腸道微生物也可以利用其產(chǎn)生SCFAs，調(diào)節(jié)腸道pH 值，進而降低農(nóng)藥在腸道中的暴露風(fēng)險。

基于腸道菌群在不同膳食營養(yǎng)成分的干預(yù)下，可顯著降低農(nóng)藥殘留生物可給性，建議人們在日常飲食中可提高對不同膳食成分的攝入。