中國烏骨雞品種BCDO2 基因多態(tài)性和膚色鑒定

賈曉旭，陸俊賢，唐修君，樊艷鳳，馬尹鵬，黃勝海，葛慶聯(lián)，高玉時

(江蘇省家禽科學研究所，揚州 225125)

種業(yè)是農業(yè)的“芯片”，開展種質資源挖掘、保護和評價是解決我國畜牧業(yè)種源“卡脖子”問題的技術前提。我國各地自然和人文條件的不同，人們對雞培育方向和目的也不盡相同，形成了豐富多彩的雞遺傳資源?！秶倚笄葸z傳資源品種名錄(2021年版)》公布的我國地方雞品種種質資源有115 個。雞按照用途一般分為肉用型和蛋用型，我國一些烏骨雞品種還有一定的藥用價值。早在1 300 年前的本草綱目就有烏骨雞的記載：“烏骨雞，有白毛烏骨者，黑毛烏骨者、斑毛烏骨者，有骨肉皆烏者、肉白烏骨者，但觀雞舌黑者，則骨肉俱烏、入藥更良”[1]。對這些具有優(yōu)勢特色性狀的種質資源進行評價也是一項十分重要的工作。

BCDO2基因是雞重要色素沉積基因，位于第24 條染色體內，編碼β-胡蘿卜素雙加氧酶2。β-胡蘿卜素雙加氧酶2 是一種抗氧化應激的關鍵保護成分，也是線粒體類胡蘿卜素的清道夫和內在凋亡通路的看門人[2]。這種酶可以將有色的類胡蘿卜素裂解成為無色的脫脂類胡蘿卜素，如果BCDO2基因發(fā)生突變，可以抑制該基因在皮膚中的表達，正是由于BCDO2基因表達量的減少而產生了黃皮膚。除了在雞上，BCDO2基因在其他動物上色素沉積的也有研究。Berry 等研究發(fā)現(xiàn)牛BCDO2基因外顯子3 上的一處SNP，與牛的黃色脂肪和β-胡蘿卜素產物相關[3]。V?ge 等研究表明BCDO2基因突變可能會改變羊的皮下脂肪中類胡蘿卜素的含量，從而影響羊的屠體性狀[4]。

雞的BCDO2基因存在著大量的SNPs，可能是由共同的祖先遺傳下來的。Eriksson 等通過對家雞和原雞的BCDO2序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)黃色皮膚的品種與灰色原雞(Gallus sonneratii)聚集在一起，白色皮膚的品種與紅色原雞(Gallus Gallus)聚集在一起，表明黃色皮膚的家雞其野生祖先可能跟灰色原雞有著較近的親緣關系，為雞馴化的起源和歷史提供了新的見解[5]。Huang 等對10 個品種黃羽肉雞地方品種進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)BCDO2基因作為重要的候選基因被選擇[6]。目前還沒有對我國烏骨雞BCDO2基因多態(tài)性系統(tǒng)研究的報道，為此，本研究選擇我國5 個代表性的烏骨雞品種，通過PCR 擴增和直接測序的方法對其BCDO2基因進行了研究，以期為我國烏骨雞遺傳資源的保護、選育和鑒定工作提供遺傳背景信息。

1 材料與方法

1.1 材料

東鄉(xiāng)綠殼蛋雞和金湖烏鳳雞采自國家級地方雞種基因庫(江蘇)，絲羽烏骨雞群體2 采自江西絲羽烏骨雞保種場、余干烏骨雞采自江西余干烏骨雞保種場，新興竹絲雞3 號采自江蘇溫氏畜牧有限公司。并選擇黃膚品種和白膚品種各一個作為對照，黃膚品種選擇白耳黃雞，白膚品種選擇崇仁麻雞，每個品種內個體間沒有直接的親緣關系（表1）。

表1 本研究中雞的品種和性狀相關信息Table 1 List of chicken breeds and characters used in this study

在雞翅靜脈采集血液，用常規(guī)的酚-氯仿法提取基因組DNA，雙蒸水溶解，核酸濃度測定儀測定DNA 濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

從美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 數(shù)據庫中下載已發(fā)表 13 條原雞序列，紅色原雞(Gallus Gallus)(EU334155, EU334157, EU334162, EU334163,EU334164, EU334165, EU334166)，黑尾原雞(Gallus lafayetii)(EU334158) ， 灰 色 原 雞(Gallus sonneratii)(EU334149, EU334152, EU334159, EU334160,EU334161)。

1.2 分析方法

選取雞已知DNA 序列(EU334163)作為參考序列，用Primer Premier 5.0 和Oligo 6.0 軟件設計引物擴增BCDO2基因，正向：5'- AGTACAGGAAGGG AAGGAT -3'；反向：5'- TTTATGTGCTCGCAGAA TG -3'，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 反應體系25 μL：2×PCR Master Mix (南京博爾迪，南京)12.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL (生工生物公司，上海)，模板DNA 50 ng，最后用滅菌水補齊25 μL。PCR 擴增條件如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。取5 μL擴增好的PCR 產物在1.5%瓊脂糖(康為世紀公司，北京)上凝膠電泳檢測，選擇條帶亮并且無非特異性擴增的樣本交由上海生工生物公司測通。

1.3 數(shù)據處理和分析

所獲序列根據峰圖進行人工校對后，以.seq 格式輸出，利用Clustal-X 軟件進行序列比對[7]。用DnaSP 5.10.1 軟件統(tǒng)計變異位點數(shù)和單倍型數(shù)[8]。用MEGA 6.0 軟件采用最大似然法(maximum likelihood, ML)構建系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。采用Network 10.2.0軟件繪制Median-joining 單倍型網絡圖[10]。

2 結果與分析

2.1 BCDO2 基因多態(tài)位點和單倍型分布

本研究擴增片段長度為725 bp，設計的引物在試驗雞群得到了較好的擴增，PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，特異性良好，與目的片段大小一致(圖1)?；? 個品種215 條序列，總計發(fā)現(xiàn)6 個多態(tài)位點，分別為 6273091(G-A)、6273129(A-G)、6273229(C-T) 、6273240(C-T) 、 6273307(A-G) 和6273672(A-G)(表2)。

圖1 PCR 擴增結果Figure 1 PCR amplification results

基于本研究發(fā)現(xiàn)的6 個多態(tài)位點，界定了3 個單倍型Hap1～Hap3（表2）。由表3 可以看出，Hap1 分布在除白耳黃雞以外的其他6 個品種。Hap3 包含分布于4 個品種，分別為白耳黃雞、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、金湖烏鳳雞及和余干烏骨雞。Hap2 僅少量分布在兩個品種中：金湖烏鳳雞（2/30）和新興竹絲雞3 號（1/35）。白耳黃雞、崇仁麻雞和絲羽烏骨雞只有1 種單倍型。同時擁有2 種單倍型的品種有3 個，東鄉(xiāng)綠殼蛋雞(12/18)、新興竹絲雞3 號(34/1)和余干烏骨雞(23/7)。金湖烏鳳有3 種單倍型，個體數(shù)分別為20、2 和8。30 只白膚崇仁麻雞只檢測到Hap1 一種單倍型，30只黃膚白耳黃雞只檢測到Hap3 一種單倍型。

表2 BCDO2 基因多態(tài)位點分布Table 2 Variable nucleotide sequence positions in BCDO2

表3 BCDO2 基因不同單倍型在不同品種間的分布Table 3 BCDO2 genetic diversity index of different chicken breeds

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于本研究發(fā)現(xiàn)的23 個單倍型，進行了中介網絡圖構建(圖2)。結果表明，3 種單倍型歸屬于2 個不同的分支W和Y，其中W分支包括Hap1和Hap2，Y 分支僅包括Hap3。2 個分支均未呈明顯的星狀發(fā)散分布。利用本研究發(fā)現(xiàn)的3 種單倍型和13 條原雞序列構，我們構建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。發(fā)育樹分為2 個分支，Hap1 和Hap2 同紅色原雞(Gallus Gallus)(EU334155, EU334157, EU334166)聚為一支，Hap3和紅色原雞(Gallus Gallus)(EU334162, EU334163,EU334164, EU334165)、黑尾原雞(Gallus lafayetii)(EU334158) 和 灰 色 原 雞 (Gallus sonneratii)(EU334149,EU334152, EU334159, EU334160,EU334161)聚為一支，其中黑尾原雞 (EU334158)明顯跟其他原雞親緣關系較遠。

圖2 基于BCDO2 基因單倍型構建的中介網絡圖Figure 2 Median-Joining network profile of the BCDO2 haplotypes observed in the present study

圖3 基于BCDO2 基因序列采用ML 法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 The maximum likelihood tree based on BCDO2 gene sequences

3 討論與結論

隨著國家倡導家禽冰鮮上市，屠體外觀在雞肉產品中的影響會越來越大。市場上一般都會要求同一批次的雞屠體或者分割具有相同的膚色[11]。我國華南地區(qū)人民希望雞的膚色在可接受的范圍內盡可能的黃。研究表明影響雞膚色的因素十分復雜，包括遺傳、飼料和生理狀況等[12]。雞的黃色膚色主要是由于外源的類胡蘿卜素在皮膚中沉積造成的。研究顯示正是由于BCDO2基因分解類胡蘿卜素功能的喪失導致了類胡蘿卜素在雞的膚色的沉積[5]。本研究BCDO2基因的多態(tài)位點能夠很好地區(qū)分白膚色(崇仁麻雞)和黃膚色(白耳黃雞)，這與許繼國等研究了黃白膚色的雞BCDO2基因的多態(tài)性分布情況，發(fā)現(xiàn)一處變異位點與膚色性狀完全連鎖的研究結果是一致的[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)BCDO2基因多態(tài)位點與雞的脛色和喙色有連鎖關系[12-14]，黃膚色的雞一般脛色和喙色都偏黃色，而白膚色的雞，脛色和喙色偏黑色。烏骨雞一般脛色和喙色都偏黑色。本研究沒有發(fā)現(xiàn)BCDO2基因多態(tài)位點與烏骨雞喙色和脛色有連鎖關系。

黑色素的合成是從酪氨酸酶氧化酪氨酸開始，然后經過一系列復雜的反應完成的。目前烏骨雞膚色相關調控基因尚未得到精確定位。Li 等對淅川烏骨雞進行全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)了一個包含與黑色素生成相關基因的選擇性區(qū)域[15]。Yu 等研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)基因一處變異位點可以作為烏骨雞皮膚顏色標記輔助選擇的遺傳標記[16]。本研究發(fā)現(xiàn)絲羽烏骨雞BCDO2基因有1 種單倍型，而東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、金湖烏鳳雞、余干烏骨雞和新興竹絲雞3 號至少有2 種單倍型，具體的遺傳機理有待進一步深入研究。

BCDO2基因除了應用于膚色研究，也應用于雞的起源進化研究。Gao 等基于BCDO2基因研究結果認為家雞至少有2 個起源[13]，Loog 等比較了古代和現(xiàn)代非商業(yè)品種，認為BCDO2基因等位基因頻率的顯著上升可能歸因于亞洲雞種的基因流動[17]。Eriksson 等[5]研究表明白膚色家雞可能起源于紅色原雞，而黃色皮膚的家雞其野生祖先可能跟灰色原雞有著較近的親緣關系。本研究發(fā)現(xiàn)我國烏骨雞BCDO2基因Hap1 和Hap2 只與紅色原雞聚為一類，Hap3 和多個原雞聚為一類，這與徐文娟等利用線粒體Cytb基因研究我國烏骨雞起源至少起源與3個紅色原雞(Gallus gallus)亞種，可能還含有少量的灰原雞(Gallus sonneratii)血緣的結果基本一致[18]。同白膚和黃膚家雞相比，除新興竹絲雞3 號和金湖烏鳳雞少量個體有特有單倍型(Hap2)，其他均與黃白膚色BCDO2基因序列相同，說明烏骨雞也是由家雞選育出來的，這與翁茁先等研究結果一致[19]。BCDO2基因作為分子標記可以應用于雞的起源進化研究是可行的。

本研究研究以黃膚色和白膚色雞為對照，研究了我國烏骨雞品種BCDO2基因的多態(tài)性情況。研究結果發(fā)現(xiàn)BCDO2基因多態(tài)位點能夠很好地區(qū)分黃白膚色的品種，但很難區(qū)分烏骨雞。多個原雞在我國烏骨雞品種形成過程中，都做出了貢獻。該研究結果為我國烏骨雞遺傳資源的保護、選育和鑒定工作提供了遺傳背景信息。