林麝應(yīng)激生理狀態(tài)與消化道球蟲(chóng)感染程度關(guān)系

丁建紅，熊小倩，吳家慧，胡德夫，李 凱*

(1. 北京林業(yè)大學(xué)生態(tài)與自然保護(hù)學(xué)院，北京 100083；2. 中國(guó)野生動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)保護(hù)繁育與利用委員會(huì)，北京 100013)

應(yīng)激是動(dòng)物機(jī)體受到內(nèi)部和外界各種因子刺激所產(chǎn)生的非特異性生理反應(yīng)，是機(jī)體應(yīng)對(duì)各種生存脅迫因子產(chǎn)生的一種生理適應(yīng)，過(guò)高或過(guò)低的應(yīng)激都不利于動(dòng)物的生存適應(yīng)[1]。生理學(xué)研究表明，皮質(zhì)醇參與且能夠指示動(dòng)物機(jī)體的應(yīng)激生理狀態(tài)[2-3]。應(yīng)激分為急性應(yīng)激和慢性應(yīng)激，急性應(yīng)激在短時(shí)間內(nèi)引起糖皮質(zhì)激素分泌增加，這調(diào)動(dòng)了機(jī)體的能量生成并增加了糖異生，同時(shí)抑制了其他生理過(guò)程[4]。當(dāng)個(gè)體長(zhǎng)期處于適應(yīng)超負(fù)荷狀態(tài)時(shí)，便發(fā)展成為慢性應(yīng)激，可能對(duì)動(dòng)物健康產(chǎn)生直接的、負(fù)面的影響[5-6]，如效應(yīng)細(xì)胞功能減弱，體液免疫和細(xì)胞免疫受到抑制，疾病的易感性增加，嚴(yán)重時(shí)個(gè)體行為會(huì)發(fā)生改變[7]。圈養(yǎng)動(dòng)物普遍存在慢性應(yīng)激[8]，高強(qiáng)度或長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)激直接導(dǎo)致動(dòng)物的生理異常[9]，圈養(yǎng)條件下林麝(Moschus berezovskii)的壓力主要是由活動(dòng)空間減小、食物改變、人工飼養(yǎng)等引發(fā)[10]。理解動(dòng)物在面臨挑戰(zhàn)和不斷變化的環(huán)境時(shí)的壓力反應(yīng)對(duì)它們的保護(hù)至關(guān)重要。

應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)的時(shí)間不同，對(duì)動(dòng)物的生存和健康造成的不良影響程度就不同。由于寄生蟲(chóng)侵染與宿主免疫力相關(guān)，使得研究者在應(yīng)激反應(yīng)與寄生蟲(chóng)感染相關(guān)性方面興趣大增。然而，在寄生蟲(chóng)感染和高強(qiáng)度應(yīng)激之間的研究中卻得出不一致的結(jié)果[11-12]。事實(shí)上，皮質(zhì)醇水平和寄生蟲(chóng)感染之間的相互作用不是簡(jiǎn)單的聯(lián)系，這取決于寄生蟲(chóng)的毒性、宿主的易感性和多種挑戰(zhàn)性刺激的協(xié)同作用。

皮質(zhì)醇通常在血漿樣品中作為腎上腺活動(dòng)和受干擾的參數(shù)被測(cè)量。然而，采集血液樣本對(duì)動(dòng)物來(lái)說(shuō)本身就是一種干擾。因此，非損傷檢測(cè)糖皮質(zhì)激素及其代謝物的方法越來(lái)越受歡迎。皮質(zhì)醇激素進(jìn)入血液后，經(jīng)肝臟代謝，一部分會(huì)以共軛物的形式通過(guò)膽汁進(jìn)入十二指腸，最終可以在糞便中檢測(cè)到[13]。Corlatti[14]驗(yàn)證了糞便皮質(zhì)醇作為評(píng)估動(dòng)物對(duì)不同應(yīng)激源的生理反應(yīng)的可靠性。Graham 等[15]研究表明糞便皮質(zhì)醇濃度和血漿皮質(zhì)醇濃度具有高度相關(guān)性。使用糞便樣本評(píng)估皮質(zhì)醇有以下優(yōu)點(diǎn)：糞便樣本易收集，不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成壓力[16]。且糞便樣本代表了一段時(shí)間內(nèi)激素的綜合水平，與從血液樣本中獲得的點(diǎn)估計(jì)值相比，糞便激素代表了激素的累積分泌量，他們較少受到短期波動(dòng)或激素分泌的脈沖性質(zhì)的影響[17-18]。因此，糞便皮質(zhì)醇被廣泛應(yīng)用來(lái)監(jiān)測(cè)動(dòng)物應(yīng)激生理狀態(tài)，尤其用于野生動(dòng)物保護(hù)上。

林麝為東亞地區(qū)的特產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，雄麝所產(chǎn)的麝香是珍貴的中藥材原料[19]。球蟲(chóng)病是圈養(yǎng)林麝常見(jiàn)疾病之一，林麝感染球蟲(chóng)后會(huì)出現(xiàn)消化不良、拉稀、黃染、消瘦、最終因虛脫或其他繼發(fā)感染而死亡[20-21]。球蟲(chóng)是一種腸道原生動(dòng)物，寄生在宿主腸胃道或相關(guān)結(jié)構(gòu)的上皮或內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，感染幾種脊椎動(dòng)物宿主，包括魚(yú)類、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物。動(dòng)物通過(guò)攝入被卵囊污染的食物或通過(guò)口腔與糞便接觸直接傳播[22]。

目前，有關(guān)林麝寄生蟲(chóng)方面的研究主要集中在單一物種的鑒定[23]、驅(qū)蟲(chóng)藥效的評(píng)估[24-25]、區(qū)域寄生蟲(chóng)感染情況等[26]，而對(duì)寄生蟲(chóng)關(guān)聯(lián)性影響因素的研究報(bào)道較少，尤其應(yīng)激水平對(duì)腸道寄生蟲(chóng)感染影響的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)探索胃腸道球蟲(chóng)感染與糞便皮質(zhì)醇代謝物水平之間的關(guān)系，分析慢性應(yīng)激是否會(huì)增加球蟲(chóng)侵染林麝的幾率，旨在促進(jìn)圈養(yǎng)瀕危物種的健康管護(hù)，并探索宿主對(duì)胃腸道寄生蟲(chóng)感染的適應(yīng)策略。

1 材料與方法

1.1 采樣地點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究區(qū)域位于四川省廣元市九藥林麝養(yǎng)殖繁育中心(32°43′ N，104°81′ E)，海拔為1 496 m，該麝場(chǎng)由38 個(gè)飼養(yǎng)區(qū)組成，每個(gè)飼養(yǎng)區(qū)由6 個(gè)圈舍(3 m × 2 m)和一個(gè)露天活動(dòng)場(chǎng)(18 m × 6 m)組成。參與配種的雄麝在配種期由圈舍轉(zhuǎn)移至露天活動(dòng)場(chǎng)進(jìn)行配種，其余雄麝在獨(dú)立的小舍內(nèi)。

本研究選取雄性成麝(3～6 歲)75 頭作為研究對(duì)象，其中參與配種的雄麝40 頭，未參與配種的雄麝35 頭。所有麝均有出生記錄，用耳標(biāo)來(lái)區(qū)分個(gè)體年齡。采樣時(shí)間為2019 年10—11 月，麝場(chǎng)統(tǒng)一飼喂時(shí)間為07:00 及16:00 點(diǎn)，該季節(jié)林麝主要攝食干樹(shù)葉，并輔以少量精飼料(主要為麥麩、玉米、豆粕和一些時(shí)令蔬菜)，所有麝均投喂充足食物，飲水充分。在喂食1 h 前統(tǒng)一打掃圈舍。采樣期間，實(shí)驗(yàn)個(gè)體無(wú)疾病和異常行為。

1.2 糞樣采集

收集75 個(gè)個(gè)體的新鮮糞樣，用于糞便皮質(zhì)醇代謝物水平測(cè)定的糞樣每隔1 d 采集1 次，共采集5次，采集的糞樣保存在-20 ℃冰箱中。用于糞便寄生蟲(chóng)卵的檢測(cè)的糞樣連續(xù)采集3 d，保存在4 ℃冰箱中。采樣時(shí)間為每天04:00—06:00，選取新排未接觸地面的糞便顆粒(10～15 g)放入自封袋內(nèi)，標(biāo)注好編號(hào)、采樣日期等關(guān)鍵信息。

1.3 糞便寄生蟲(chóng)卵檢測(cè)

采用飽和鹽水漂浮法對(duì)糞便中球蟲(chóng)卵囊進(jìn)行檢測(cè)。采用麥克馬斯特計(jì)數(shù)法[27]進(jìn)行蟲(chóng)卵的定量測(cè)定，步驟如下：稱取2 g 糞便于100 mL 燒杯中，充分研磨，加入60 mL 飽和氯化鈉，用玻璃棒攪拌到糞便混勻?yàn)橹?。過(guò)60 目標(biāo)準(zhǔn)篩到新燒杯中，吸取濾液注入麥克馬斯特計(jì)數(shù)板的兩個(gè)計(jì)數(shù)室中，靜置5 min 后鏡檢。

公式如下：OPG=(n/0.15)×V/m，公式中n是指麥克馬斯特計(jì)數(shù)板兩個(gè)計(jì)數(shù)室中蟲(chóng)卵或卵囊數(shù)的平均值，0.15 為蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)室的體積。V為糞便溶液體積，60 mL；m為糞便重量，2 g。

1.4 糞便皮質(zhì)醇激素的提取及含量測(cè)定

參照He 等[10]的提取方法并略做修改，具體操作方法如下：稱取0.3 g 糞便于4 mL 離心管中，放入2 顆研磨球，使用連續(xù)加樣器加入3 mL 90%低溫乙醇，使用震蕩研磨儀25 Hz·min-1研磨3 min。再將研磨好的樣品3 000 r·min-1離心15 min，取1 mL上清液，60 ℃水浴蒸干，加入1 mL 乙醇搖勻分裝回收，并于-20℃保存待測(cè)。

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定提取物中皮質(zhì)醇的含量。使用皮質(zhì)醇試劑盒(北京冬歌有限公司)定量皮質(zhì)醇濃度。皮質(zhì)醇試劑盒的主要測(cè)定參數(shù)：靈敏度＜5 ng·mL-1；變異系數(shù)：板內(nèi)板間均小于15%；特異性：無(wú)交叉反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法與數(shù)據(jù)分析

皮質(zhì)醇水平表示為每克干糞中激素的含量，表示為ng·g-1。所得數(shù)據(jù)經(jīng)迭代法去除極值后，計(jì)算每個(gè)個(gè)體的平均值作為每個(gè)個(gè)體的糞便皮質(zhì)醇基值水平。迭代法的具體步驟為：去除每個(gè)個(gè)體糞便皮質(zhì)醇處于Mean ± 1.5 SD 之外的值[27]。采用K-S 檢驗(yàn)和Levene 檢驗(yàn)驗(yàn)證各組數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。以球蟲(chóng)卵囊量作為因變量，糞便皮質(zhì)醇代謝物水平、年齡和個(gè)體參配狀況為預(yù)測(cè)變量做廣義線性模型(GLMs)，這種統(tǒng)計(jì)方法的優(yōu)點(diǎn)包括可以處理非正態(tài)分布和引入連接函數(shù)。本研究利用負(fù)二項(xiàng)分布和對(duì)數(shù)連接函數(shù)擬合了一組球蟲(chóng)豐度模型，年齡和參配狀況作為分類預(yù)測(cè)因子，而皮質(zhì)醇代謝物水平作為連續(xù)預(yù)測(cè)因子被納入模型中。用Spearman 相關(guān)性分析檢驗(yàn)皮質(zhì)醇代謝物水平和球蟲(chóng)卵囊數(shù)之間的相關(guān)性，3 個(gè)皮質(zhì)醇水平組球蟲(chóng)卵囊數(shù)差異比較采用單因素方差分析。

還使用線性的GLMs 擬合了一系列模型來(lái)測(cè)試個(gè)體年齡、參配對(duì)糞便皮質(zhì)醇代謝物水平的影響。模型以糞便皮質(zhì)醇代謝物水平為因變量，個(gè)體年齡和參配狀態(tài)為預(yù)測(cè)變量。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用Excel 2013 和SPSS 20.0 軟件完成，畫(huà)圖使用Auto CAD 2018 完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)模型選擇

運(yùn)用廣義線性模型檢驗(yàn)?zāi)挲g和參配對(duì)糞便皮質(zhì)醇代謝物水平的影響，以及年齡、參配和糞便皮質(zhì)醇代謝物水平對(duì)球蟲(chóng)感染強(qiáng)度的影響，篩選最優(yōu)模型進(jìn)行分析。結(jié)果（表1)表明，糞便皮質(zhì)醇代謝物水平在個(gè)體間差異很大，范圍為420.236～1 229.312 ng·g-1（SE=19.442）。每個(gè)個(gè)體的平均皮質(zhì)醇濃度為746.469 ng·g-1；年齡和參配的交互作用對(duì)個(gè)體糞便皮質(zhì)醇代謝物水平有影響。3 歲齡和6 歲齡個(gè)體糞便皮質(zhì)醇代謝物水平差異不顯著(GLMs,P=0.074)，參配和未參配個(gè)體糞便皮質(zhì)醇代謝物水平差異不顯著(GLMs,P= 0.534)。3 歲齡參配個(gè)體糞便皮質(zhì)醇代謝水平最低（671.99±27.64），6 歲齡參配個(gè)體糞便皮質(zhì)醇代謝水平最高（805.18 ± 38.94），3歲齡參配個(gè)體和6 歲齡參配個(gè)體糞便皮質(zhì)醇代謝水平差異極顯著（GLMs,P＜ 0.01），其余3 組間糞便皮質(zhì)醇代謝水平差異不顯著。

個(gè)體球蟲(chóng)感染率為97.33%，平均每克糞便中球蟲(chóng)卵囊數(shù)為2 182.347，個(gè)體間感染差異顯著，檢測(cè)范圍為0～16 450 g-1。年齡、參配均對(duì)個(gè)體球蟲(chóng)感染強(qiáng)度無(wú)影響，3 歲齡個(gè)體與6 歲齡個(gè)體球蟲(chóng)感染強(qiáng)度差異不顯著(GLMs,P= 0.304)，參配個(gè)體與未參配個(gè)體球蟲(chóng)感染強(qiáng)度差異不顯著(GLMs,P=0.555)。糞便皮質(zhì)醇代謝物水平對(duì)球蟲(chóng)感染強(qiáng)度影響極顯著(GLMs,P＜ 0.01)。

2.2 糞便皮質(zhì)醇濃度聚類

運(yùn)用系統(tǒng)聚類方法，根據(jù)糞便皮質(zhì)醇代謝物水平對(duì)林麝進(jìn)行分組，根據(jù)聚類結(jié)果將林麝個(gè)體分為3 組，低濃度組共21 個(gè)個(gè)體，范圍為420.24～654.70 ng·g-1，平均值為（555.44 ± 59.62）ng·g-1；中濃度組共36 個(gè)個(gè)體，范圍為668.41～842.37 ng·g-1，平均值為（739.81 ± 51.47）ng·g-1；高濃度組共18 個(gè)個(gè)體，范圍為880.46～1 229.31 ng·g-1，平均值為（982.67±97.57）ng·g-1(圖1)。

2.3 糞便皮質(zhì)醇代謝物水平與球蟲(chóng)感染強(qiáng)度關(guān)系

Spearman 相關(guān)性分析表明糞便皮質(zhì)醇代謝物水平和球蟲(chóng)感染強(qiáng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.502,P＜ 0.01）(圖2)。

圖2 皮質(zhì)醇水平和球蟲(chóng)感染強(qiáng)度相關(guān)性Figure 2 Correlation between cortisol concentration and coccidial infection intensity

高中低3 個(gè)濃度組球蟲(chóng)感染強(qiáng)度經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)，差異極顯著(P＜ 0.01)(圖3)。低濃度組球蟲(chóng)感染強(qiáng)度顯著高于中、高濃度組。低濃度組呈現(xiàn)最高的球蟲(chóng)卵囊數(shù)，為(4 561.905 ±1 063.708) EPG·g-1，高濃度組呈現(xiàn)最低的球蟲(chóng)卵囊數(shù)，為(603.667±155.997) EPG·g-1。

圖3 高中低3 個(gè)皮質(zhì)醇組球蟲(chóng)感染強(qiáng)度差異Figure 3 Comparison of coccidial infection intensity among three cortisol groups

3 討論

本研究中，3 歲齡參配個(gè)體糞便皮質(zhì)醇水平最低，根據(jù)早期研究推測(cè)這組動(dòng)物應(yīng)激最嚴(yán)重。在He等[10]的研究中，高擁擠組林麝糞便皮質(zhì)醇代謝水平低于低擁擠組，并證實(shí)圈養(yǎng)環(huán)境給林麝造成了一種慢性壓力。林麝是一種野生動(dòng)物，圈養(yǎng)后，由于面臨多種應(yīng)激源如活動(dòng)空間減小、食物改變、人工飼養(yǎng)等，造成了巨大的壓力。況且，林麝善于奔跑和跳躍，圈養(yǎng)后，由于活動(dòng)空間減小，加上人為干擾，當(dāng)林麝受刺激后，會(huì)反復(fù)在圈舍中行走或上下跳躍，直到氣喘吁吁，長(zhǎng)期以往，給林麝造成了一種慢性應(yīng)激。Mason[28]研究表明，即使動(dòng)物在圈養(yǎng)條件下飼養(yǎng)多代，應(yīng)激效應(yīng)也依舊存在。

在歐洲椋鳥(niǎo)[29]、豚鼠[30]的研究中證實(shí)，個(gè)體長(zhǎng)期處于慢性壓力條件下，其基礎(chǔ)皮質(zhì)醇水平降低。Rich 等[29]研究顯示，個(gè)體長(zhǎng)期處于慢性應(yīng)激條件下，下丘腦精氨酸催產(chǎn)素(AVT,鳥(niǎo)類)(在哺乳動(dòng)物中為精氨酸加壓素)釋放減少，調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇濃度降低。當(dāng)機(jī)體面臨某種壓力時(shí)，下丘腦室旁核神經(jīng)元分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH），再作用于垂體前葉，分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH），又通過(guò)外周循環(huán)作用于腎上腺，釋放皮質(zhì)醇。當(dāng)個(gè)體長(zhǎng)期處于某種慢性壓力狀態(tài)下，由于負(fù)反饋?zhàn)饔?，腎上腺對(duì)促腎上腺皮質(zhì)激素的反應(yīng)降低，使得皮質(zhì)醇分泌量減少[31-32]。本研究中，3 歲齡參配個(gè)體糞便皮質(zhì)醇水平最低，可能和3 歲齡個(gè)體初為種麝有關(guān)。雄麝1.5 歲性成熟，2.5 歲達(dá)到體成熟[33-34]。近年來(lái)，麝場(chǎng)為增加優(yōu)質(zhì)種源，常選取剛體成熟的雄麝作為種麝。本研究選取3 歲和6 歲林麝作為研究對(duì)象，正是想比較初為種麝的群體和成熟種麝應(yīng)激生理差異。初次參與配種，雄麝和雌麝活動(dòng)領(lǐng)域重合，且配種期間，雄麝追逐雌麝或頻繁交配（麝場(chǎng)配種機(jī)制為“一雄多雌”制）[35]，這對(duì)于雄麝本身就是一種應(yīng)激，對(duì)于初次成為種麝的3 歲個(gè)體來(lái)說(shuō)，應(yīng)激更為嚴(yán)重。但并非所有參配個(gè)體糞便皮質(zhì)醇代謝水平均低于未參配個(gè)體，在6 歲齡組中，參配個(gè)體糞便皮質(zhì)醇代謝水平反而高于未參配個(gè)體，說(shuō)明參配不是造成林麝應(yīng)激的唯一應(yīng)激源，林麝不同的應(yīng)激水平是由圈養(yǎng)環(huán)境中多種應(yīng)激源綜合作用的結(jié)果。

本研究顯示，低濃度組個(gè)體球蟲(chóng)卵囊數(shù)遠(yuǎn)高于高濃度組個(gè)體，即個(gè)體應(yīng)激程度越高，對(duì)球蟲(chóng)的易感性越大。研究表明個(gè)體長(zhǎng)期處于慢性壓力下，會(huì)造成機(jī)體免疫抑制[36-39]，長(zhǎng)期的慢性壓力會(huì)使機(jī)體平衡紊亂，白細(xì)胞重新分布緩慢，效應(yīng)細(xì)胞功能降低，細(xì)胞免疫或體液免疫下降，從而使得機(jī)體抗感染能力降低[7,40]。當(dāng)其應(yīng)對(duì)寄生蟲(chóng)感染時(shí)，壓力大的個(gè)體易感性增加，且壓力大的個(gè)體可能缺乏足夠的能量來(lái)對(duì)寄生蟲(chóng)進(jìn)行有效的防御[41]。該結(jié)果與許多針對(duì)不同動(dòng)物的研究結(jié)果一致，如黑猩猩[42]、大耳負(fù)鼠[43]、草原袋鼠[44]、負(fù)鼠[45]和胎生蜥蜴[46]。

研究結(jié)果顯示3 歲齡個(gè)體和6 歲齡個(gè)體球蟲(chóng)感染強(qiáng)度差異不顯著，可能是由于他們都是成年個(gè)體所致。在Pelletier 等[47]的研究中也顯示，不同年齡羚羊肺線蟲(chóng)感染無(wú)差異。王宇等[26]研究表明，林麝各類寄生蟲(chóng)感染率無(wú)年齡差異。

本研究發(fā)現(xiàn)林麝參配對(duì)球蟲(chóng)感染強(qiáng)度無(wú)影響，這與以往幾項(xiàng)研究結(jié)果不符，如索艾羊[48]和大耳負(fù)鼠[49]。可能有以下幾點(diǎn)原因：(1)早期研究大多選取的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是處于哺乳期的雌性動(dòng)物，本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為交配初期雄性，在小型哺乳動(dòng)物中，妊娠和哺乳的代價(jià)是十分昂貴的[50]，通常雌性在繁殖階段寄生蟲(chóng)感染達(dá)到高峰[51]。可能雌性更易于解釋繁殖與抗寄生蟲(chóng)侵染之間的能量分配。(2)本研究開(kāi)展時(shí)，林麝正處于交配初期，由于采樣沒(méi)有涉及整個(gè)交配期，故交配對(duì)球蟲(chóng)感染的影響不顯著。Strona 等[45]研究表明，處于交配后期的負(fù)鼠寄生蟲(chóng)感染量顯著多于非交配期及交配前期，提示交配后期個(gè)體能量分配更偏重于繁殖而弱化了抗寄生蟲(chóng)感染。(3)推測(cè)與他人結(jié)果不符主要是研究的寄生蟲(chóng)種類不同，他人研究的多為腸道蠕蟲(chóng)，而本研究中林麝感染的球蟲(chóng)為原生動(dòng)物。由于其傳播力強(qiáng)、侵入能力強(qiáng)、更易在體內(nèi)定殖、世代周期短等特性[22]，使得球蟲(chóng)能在林麝種群中大量傳播，故配種對(duì)其影響不顯著。在本研究中，應(yīng)激是與球蟲(chóng)感染相關(guān)的唯一變量，這表明應(yīng)激對(duì)林麝抵抗力降低影響最為顯著。