N+ 離子束注入對(duì)毛葉山桐子種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和碳氮含量的影響

趙子睿，周靜波，張 明，姚建銘

(1. 上海伯豪生物技術(shù)有限公司，上海 201203；2. 安徽林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院資源與環(huán)境系，合肥 230031；3. 中國(guó)科學(xué)研究院等離子體物理研究所，合肥 230031)

山桐子（Idesia polycarpaMaxim.）屬于大風(fēng)子科山桐子屬落葉喬木，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域、華北和西北南部的17 個(gè)省區(qū)。其中，變種毛葉山桐子（I. polycarpaMaxim. var.vestitaDiels）與原種的主要區(qū)別在于小枝、葉柄、葉下面及花序均密生短柔毛[1-3]。毛葉山桐子為陽(yáng)性速生樹種，生長(zhǎng)迅速，主桿挺直，分枝輪生，樹冠圓塔形；果實(shí)成熟后呈紅、黃等色，垂于枝頭，是比較理想的城市綠化、美化和造林的優(yōu)良樹種。同時(shí)，毛葉山桐子也是一種木本油料樹種，果實(shí)和種子都可榨油。毛葉山桐子油主要由亞油酸、油酸、棕櫚酸、棕櫚烯酸、硬脂酸等脂肪酸組成，可以制備生物柴油和潤(rùn)滑油；經(jīng)深加工的油脂可以用作降低血脂、血壓的藥物[4-6]。然而，毛葉山桐子資源有限，主要以產(chǎn)地劃分，在自然界種子萌發(fā)困難，成片成林的群落較少，這給其廣泛、大面積推廣栽種造成了極大的困難。因此，研究毛葉山桐子的生態(tài)適應(yīng)性，加快其優(yōu)質(zhì)苗木的選育，提高良種化水平成為當(dāng)務(wù)之急。

離子束生物技術(shù)是一項(xiàng)新型的生物技術(shù)，其原理是在真空條件下，通過(guò)離子注入機(jī)高壓電離氣體或金屬物質(zhì)，產(chǎn)生等離體，注入植物材料。通過(guò)注入離子的能量傳遞、電荷傳遞、質(zhì)量沉積等多種效應(yīng)，引起植物體內(nèi)某些物質(zhì)或染色體發(fā)生變化，再通過(guò)人工選育的方法得到良種[7]。離子束注入技術(shù)可以產(chǎn)生多種突變性狀，在植株表型變化的突變類型主要包括葉色、葉型、花型、花色、株型、生長(zhǎng)周期突變等，從而豐富種質(zhì)資源[8]。目前這項(xiàng)技術(shù)已應(yīng)用于蔬菜[9]、花卉[10]、小麥[11-12]、水稻[13-15]、玉米[16]、甘草[17]和麻風(fēng)樹[18]等的催芽、育種和改良作物品質(zhì)等領(lǐng)域，但是離子束生物技術(shù)處理毛葉山桐子種子所產(chǎn)生的生物效應(yīng)尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究旨在將氮離子束生物技術(shù)應(yīng)用到毛葉山桐子的良種培育中，借鑒其在小麥、水稻、蔬菜的催芽和改良品質(zhì)等領(lǐng)域的方法和經(jīng)驗(yàn)，研究氮離子束注入毛葉山桐子的種子后對(duì)種子萌芽和幼苗表型的生物學(xué)效應(yīng)，以期為園林和林業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)苗木、促進(jìn)安徽省山桐子產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

2016 年10 月采集安徽省舒城萬(wàn)佛山農(nóng)戶家的毛葉山桐子果實(shí)，用相對(duì)濕度60%的細(xì)沙于5 ℃冰箱中層積沙藏。12 月取出凈種，晾干后放在自封袋中，儲(chǔ)存于5 ℃冰箱中待用。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)芽率測(cè)定 2017 年3 月，將種子送往武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司。微波ECR 離子注入機(jī)（IBBe-Device）分別用不同能量的N+離子束20 keV 4×1015、25 keV 4×1015和30 keV 4×1015N+·cm-2（分別簡(jiǎn)稱20、25 和30 keV）注入毛葉山桐子種子。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，以未經(jīng)N+離子束注入的毛葉山桐子種子為對(duì)照（0 keV，CK），20、25和30 keV 每種處理100 粒種子，3 次重復(fù)。3 月24日，取4 種處理的種子各300 粒，分別用下列方法浸種：用1 g·L-1KMnO4消毒種子1 h，15 g·L-1KH2PO4、200 mg·L-1GA3和0.1 g·L-1的生根粉混合溶液浸種24 h。倒出混合液，洗凈種子，放在紗布上晾干。3 月27 日，將晾干后的種子分別放在12個(gè)鋪墊濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿100 粒，用水浸濕，定期更換濾紙并加水。蓋上培養(yǎng)皿蓋，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，光照培養(yǎng)箱溫度設(shè)為23 ℃，空氣濕度80%，光強(qiáng)2 500 Lx。早晨6:00 開燈，下午18:00關(guān)燈。觀察記錄發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率。

1.2.2 容器苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 4 月25 日，將光照培養(yǎng)箱中催芽苗，定植于口徑×高為12 cm × 10 cm 的營(yíng)養(yǎng)缽中，從CK、20、25 和30 keV 4 種處理的所有營(yíng)養(yǎng)缽苗中，各選擇9 株長(zhǎng)勢(shì)相近的幼苗作為樣本。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每種處理栽植3 盆，每盆栽植1 株，3 次重復(fù)，放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)為23 ℃，每天光照12 h。5 月27 日開始，每隔7 d 測(cè)定1 次容器苗的株高、冠幅、葉片數(shù)，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[19]，地徑用游標(biāo)卡尺測(cè)定，共測(cè)定7 次。

1.2.3 葉片全N、全C 含量測(cè)定 9 月11 日，分別從CK、20、25 和30 keV 4 種處理容器苗9 株樣本中，剪取葉片，每株從基部開始向上取6 片葉，在水龍頭下沖洗干凈，吸水紙吸干。4 個(gè)處理樣本的葉片分別放于9 個(gè)牛皮紙信封中，共36 個(gè)信封放在電熱鼓風(fēng)干燥箱中，105 ℃殺青20 min，再于50 ℃烘干96 h；9 月18 日，用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)將葉片研成粉狀。9 月20 日使用元素分析儀（EA3000，Vector，Italy）測(cè)定全N、全C 的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

為比較不同能量的N+束對(duì)毛葉山桐子種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行不同處理間的顯著性檢驗(yàn)，具有顯著性差異的進(jìn)一步進(jìn)行Tukey 多重比較（HSD），統(tǒng)計(jì)分析在統(tǒng)計(jì)軟件R（4.0.2 版本）進(jìn)行，加載multcomp、car、agricolae 等軟件包，作圖在Excel 中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同能量N+離子束注入毛葉山桐子種子對(duì)其發(fā)芽率的影響

從圖1 可以看出，催芽后的21、22、26 和27 d，30 keV 處理的種子發(fā)芽率與CK 差異都顯著，而20和25 keV 處理的種子發(fā)芽率與CK 差異都不顯著；催芽后的10 ～ 20 d 和23 ～ 25 d，20、25 和30 keV處理的種子發(fā)芽率與CK 的差異都不顯著。結(jié)果表明30 keV N+離子束注入毛葉山桐子種子對(duì)發(fā)芽率起顯著增加作用，而20 和25 keV N+離子束注入種子對(duì)發(fā)芽率的的作用不顯著。

圖1 不同能量N+離子束注入后對(duì)毛葉山桐子種子發(fā)芽率的影響Figure 1 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the germination rate of I. polycarpa var. vestita seeds

2.2 不同能量N+離子束注入毛葉山桐子種子對(duì)其容器苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 不同能量N+離子束注入種子對(duì)毛葉山桐子容器苗株高的影響 從圖2 可以看出，20 keV 處理的毛葉山桐子容器苗，在定植47 d 時(shí)，株高與對(duì)照差異顯著，30 keV 處理的容器苗，在定植61 和68 d時(shí)，株高與對(duì)照差異顯著，25 keV 處理的容器苗，在47、61 和68 d 時(shí)，株高與對(duì)照差異都不顯著；定植40、54 和75 d 時(shí)，20、25 和30 keV 處理的容器苗，株高與對(duì)照差異都不顯著。說(shuō)明20 和30 keV 的N+離子束注入毛葉山桐子種子，對(duì)容器苗的株高增加有一定的促進(jìn)作用，而30 keV 處理的容器苗株高增長(zhǎng)更快一些。

圖2 不同能量N+離子束注入對(duì)毛葉山桐子幼苗株高影響Figure 2 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the height of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.2.2 不同能量N+離子束注入種子對(duì)毛葉山桐子容器苗冠幅的影響 從圖3 可以看出，30 keV 處理的毛葉山桐子容器苗，在定植61 d 時(shí)，冠幅與對(duì)照差異顯著，在定植54、68 和75 d 時(shí)，雖然與對(duì)照差異不顯著，但是都大于對(duì)照，20 keV 處理的容器苗，在定植54、61、68 和75 d 時(shí)，冠幅與對(duì)照差異不顯著，而且都小于對(duì)照；25 keV 處理的容器苗，定植54、61、68 和75 d 時(shí)，冠幅與對(duì)照差異不顯著，同時(shí)都小于30 keV 處理的容器苗；說(shuō)明30 keV的N+離子束注入毛葉山桐子種子，對(duì)容器苗冠幅的增加起一定的作用。

圖3 不同能量N+離子束注入對(duì)毛葉山桐子幼苗冠幅影響Figure 3 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the crown diameter of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.2.3 不同能量N+離子束注入種子對(duì)毛葉山桐子容器苗葉片數(shù)的影響 從圖4 可以看出，30 keV 處理的毛葉山桐子容器苗，在定植54 d 時(shí)，葉片數(shù)與對(duì)照差異顯著，定植61、68 和75 d，雖然與對(duì)照差異不顯著，但都是多于對(duì)照，20 和25 keV 處理的容器苗，在定植54、61、68 和75 d 時(shí)，葉片數(shù)與對(duì)照差異都不顯著；說(shuō)明30 keV 處理對(duì)于毛葉山桐子容器苗的葉片增加有一定的促進(jìn)作用。

圖4 不同能量N+離子束注入對(duì)毛葉山桐子幼苗葉片數(shù)的影響Figure 4 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the leaf number of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.2.4 不同能量N+離子束注入種子對(duì)毛葉山桐子容器苗地徑的影響 從圖5 可以看出，在定植47、54、61、68 和75 d 時(shí)，30 keV 處理的毛葉山桐子容器苗，地徑雖然與對(duì)照差異不顯著，但在數(shù)值上都大于對(duì)照，而且有上升的趨勢(shì)；20 keV 處理的容器苗，地徑與對(duì)照差異都不顯著，只有定植47 d 時(shí)，略高于對(duì)照，其他都是小于對(duì)照；25 keV 處理的容器苗，地徑與對(duì)照差異也不顯著，只有定植47 和68 d時(shí)，略高于對(duì)照，其他也都小于對(duì)照。說(shuō)明30 keV處理對(duì)于毛葉山桐子容器苗地徑的增加略有作用。綜上所述，20 keV 處理的N+離子束注入毛葉山桐子種子，對(duì)容器苗的株高增加有一定的促進(jìn)作用，對(duì)冠幅、葉片數(shù)、地徑增加沒(méi)有顯著的影響；25 keV處理的N+離子束注入毛葉山桐子種子，對(duì)容器苗的株高、冠幅、葉片數(shù)、地徑的增加都沒(méi)有顯著的影響；30 keV 處理的N+離子束注入毛葉山桐子種子，對(duì)容器苗的株高、冠幅、葉片數(shù)的增加都有顯著的影響，對(duì)地徑增加影響雖然不顯著，但是從數(shù)值上來(lái)看，高于對(duì)照。說(shuō)明30 keV N+離子束注入毛葉山桐子種子，在容器苗定植后，對(duì)其株高、冠幅、葉片數(shù)和地徑增加都有促進(jìn)作用，可以用該法培養(yǎng)株高、冠大、葉片多和地徑粗的容器苗，為園林和林業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)苗木。

圖5 不同能量N+離子束注入對(duì)毛葉山桐子幼苗地徑影響Figure 5 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the ground diameter of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.3 不同能量N+離子束注入種子對(duì)容器苗葉片全C、N 含量的影響

從圖6 可以看出，容器苗定植140 d（9 月11日），20、25 和 30 keV 處理的毛葉山桐子葉片中的全氮含量與對(duì)照差異都顯著。20 和25 keV 處理葉片中的全碳含量與對(duì)照差異顯著；而30 keV 處理的毛葉山桐子葉片中的全碳含量與對(duì)照差異不顯著。從圖7 可以看出，20 keV 處理的毛葉山桐子葉片中的C / N 與對(duì)照差異不顯著，而25 和30 keV處理與對(duì)照差異顯著，都小于對(duì)照，30 keV 最小。

圖6 不同能量N+束注入對(duì)毛葉山桐子幼苗葉片全碳和全氮含量的影響Figure 6 Effects of different energy N+ ion beam exposure on total C and N contents in the leaves of I. polycarpa var. vestita seedlings

圖7 不同能量N+束注入對(duì)毛葉山桐子幼苗葉片碳氮比的影響Figure 7 Effects of different energy N+ ion beam exposure on C/N in the leaves of I. polycarpa var. vestita seedlings

綜上所述，這4 種能量的N+離子束注入毛葉山桐子種子，經(jīng)過(guò)催芽、定植，140 d 后的容器苗，其樣本每千克葉片中的含氮量（g）與對(duì)照差異都顯著，說(shuō)明這幾種能量的N+注入毛葉山桐子種子，對(duì)種苗生長(zhǎng)葉片中的含氮量增加起促進(jìn)作用，有利于植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。這也從氮營(yíng)養(yǎng)方面說(shuō)明了30 keV 處理的毛葉山桐子株高、冠幅、葉片數(shù)等營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)顯著差異于對(duì)照的原因，但從圖6 中并沒(méi)有看到20、25和30 keV 處理之間每千克葉片含N 量（g）的差異，說(shuō)明這幾種處理在株高、冠幅、葉片數(shù)、地徑等形態(tài)上的差異可能還有其他內(nèi)因，有待進(jìn)一步研究。

3 討論與結(jié)論

植物個(gè)體發(fā)育的起點(diǎn)從種子萌發(fā)開始，播種后種子能否迅速萌發(fā)，達(dá)到早苗、全苗和壯苗，關(guān)系到能否為作物的豐產(chǎn)打下良好的基礎(chǔ)[20]。植物的生長(zhǎng)是一種不可逆的體積增加的過(guò)程。植物的體積大?。ㄍǔ？梢杂瞄L(zhǎng)度或直徑來(lái)代表）可以作為測(cè)量植物生長(zhǎng)的一個(gè)重要指標(biāo)[21]。植物的株高、冠幅、葉片數(shù)和地徑可以很好地反映植物的生長(zhǎng)狀態(tài)。30 keV 注入毛葉山桐子種子，無(wú)論在發(fā)芽率，后期容器苗的株高、冠幅、葉片數(shù)等形態(tài)指標(biāo)，都顯著差異于未處理的對(duì)照。20 keV 注入毛葉山桐子種子，其發(fā)芽率與CK 差異不顯著；對(duì)容器苗的株高增加有一定的促進(jìn)作用，對(duì)冠幅、葉片數(shù)、地徑增加沒(méi)有顯著的影響。25 keV 注入毛葉山桐子種子，其發(fā)芽率與CK 差異不顯著；對(duì)容器苗的株高、冠幅、葉片數(shù)、地徑的增加都沒(méi)有顯著的影響。基于上述結(jié)果，不難看出30 keV 注入毛葉山桐子種子，顯著提高了種子的發(fā)芽率，促進(jìn)了株高、冠幅、葉片數(shù)、地徑的生長(zhǎng)，是適宜于毛葉山桐子種子的萌發(fā)、植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)的N+離子束注入能量。

代西梅等[22]用能量為30 keV 的N+離子束注入馬齒莧，提高了種子的萌發(fā)速率、發(fā)芽率相一致。周立人等將30 keV 的離子束注入大麥種胚后，不僅對(duì)種子本身萌發(fā)能力和M1 代胚根、胚芽細(xì)胞的有絲分裂有促進(jìn)作用，還對(duì)胚根根尖細(xì)胞和胚芽細(xì)胞內(nèi)的核及染色體產(chǎn)生不同程度損傷，表現(xiàn)出核和染色體畸變[23]。黃洪云等年用能量為30 keV 的離子束注入玉米種子，種子電導(dǎo)率和幼苗葉片MDA 含量均較低，對(duì)細(xì)胞膜的破壞性小[24]。郭建秋等研究采用能量為 30 keV 的氮離子束注入大豆的種子，結(jié)果與航天搭載處理M1 代的出苗率、株高、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)無(wú)顯著差異[25]。樊繼偉等試驗(yàn)中氮離子束注入能量只有 1 個(gè)水平（30 keV），氮離子束注入后，小麥誘變?nèi)后w氮素利用產(chǎn)生一定變化，影響產(chǎn)量和品質(zhì)[26]。這些研究的結(jié)論與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，不僅對(duì)環(huán)境變化敏感，而且可塑性大。作為植物固碳能力的指標(biāo)，葉片碳含量是植物適應(yīng)環(huán)境變化，維持碳平衡的重要參數(shù)。氮是蛋白質(zhì)、核酸、磷脂的主要成分，而這三者又是原生質(zhì)、細(xì)胞核和生物膜的重要組成部分，因此，氮在植物生命活動(dòng)中占首要地位[27]，含氮量影響植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。20 keV 處理的毛葉山桐子每kg 樣本葉片中的含C 量和含N 量與對(duì)照差異顯著；25 keV 處理的毛葉山桐子葉片含C量和含N 量與對(duì)照差異也顯著；30 keV 處理的毛葉山桐子葉片含C 量與對(duì)照差異不顯著，但是略高于對(duì)照，含N 量與對(duì)照差異顯著。說(shuō)明20 和25 keV處理對(duì)毛葉山桐子幼苗葉片的固碳能力有一定的促進(jìn)作用。葉片中的含碳量在采用N+離子束注入后都有增加，但增加幅度隨N+離子束能量增加而減?。欢扛魈幚砘疽恢拢▓D6），也即是說(shuō)，隨著N+離子束能量增加，其C/N 比值在減?。▓D7）。熊炳霖等的研究結(jié)果表明，葉綠素含量和碳氮比呈極顯著的負(fù)相關(guān)[28]，30 keV 處理的毛葉山桐子葉片C/N 最小，葉綠素含量高，光合效率好，有助于葉片的生長(zhǎng)和發(fā)育，這從植物發(fā)育生理上解釋了部分試驗(yàn)結(jié)果。

本研究采用0、20、25 和30 keV 等4 個(gè)不同能量N+離子束注入毛葉山桐子種子進(jìn)行試驗(yàn)，篩選出30 keV 4×1015N+·cm-2為適宜注入劑量，顯著增加了種子發(fā)芽率、株高、冠幅、葉片數(shù)和葉片中氮的含量，有利于植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。該方法對(duì)其他觀賞植物優(yōu)質(zhì)苗木培育也有較大的參考價(jià)值。