植物胞外囊泡的結(jié)構(gòu)、生物活性及其在食藥遞送方面的應(yīng)用

朱珍珠，江 睿，廖柳月，張琳曼，謝丁宇，張婧藝

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023）

外泌體對(duì)細(xì)胞間的信息交流起傳導(dǎo)作用，同時(shí)能作為一種天然載體，參與人體內(nèi)多種疾病的生理過(guò)程。外泌體具有良好的生物相容性，不會(huì)引起特異性免疫等問(wèn)題，既跨越生物學(xué)屏障，又可反映來(lái)源于細(xì)胞的生理、病理情況，因此，其可作為運(yùn)載功能營(yíng)養(yǎng)因子或藥物的高效載體材料。隨著人們對(duì)外泌體的關(guān)注程度越來(lái)越高，首先要解決的便是如何分離純化外泌體并對(duì)其進(jìn)行表征的問(wèn)題，而成功分離外泌體后，如何開(kāi)發(fā)外泌體的生物學(xué)功能并將其運(yùn)用于食藥領(lǐng)域更是困擾著研究學(xué)者們。本文旨在探討可食性植物來(lái)源胞外囊泡從分離純化到活性研究，重點(diǎn)關(guān)注植物胞外囊泡在食品工業(yè)方面及遞送藥物方面的應(yīng)用，建立完整的知識(shí)體系，為后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)，促進(jìn)植物外泌體產(chǎn)品的研發(fā)，拓展其在食藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 植物胞外囊泡概況

1.1 結(jié)構(gòu)組成

1983年科學(xué)家在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)由活細(xì)胞分泌的納米級(jí)胞外囊泡，將其定義為外泌體（exosome）。2007年，An等研究發(fā)現(xiàn)了果蔬類可食性植物細(xì)胞也可分泌出納米級(jí)胞外囊泡，通過(guò)透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，植物胞外囊泡的結(jié)構(gòu)和組分與動(dòng)物外泌體相似，直徑約為40～150 nm且具有脂雙層膜的囊狀結(jié)構(gòu)，富含核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，呈茶托狀或杯狀。隨著研究的深入，人們認(rèn)為外泌體的產(chǎn)生機(jī)制如下：細(xì)胞通過(guò)胞吞作用，在漿膜雙重內(nèi)陷形成管腔狀囊泡的過(guò)程中，脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸會(huì)被有目的地挑揀出來(lái)，以形成具有亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的多囊體，多囊體通過(guò)Ca依賴途徑與細(xì)胞膜進(jìn)行融合后，將內(nèi)部的小囊泡釋放出來(lái)（圖1）。多囊體與質(zhì)膜結(jié)合的主要目的是將小泡釋放到真菌和高等植物的細(xì)胞外空間。目前沒(méi)有明確的方法來(lái)區(qū)分植物胞外囊泡和具有相似直徑但不具備外泌體生物學(xué)功能的外泌體樣囊泡，而在分離時(shí)，這些直徑相似的囊泡可能會(huì)被分離到一起，為了規(guī)范文獻(xiàn)，Marcela等提出，當(dāng)不確定該細(xì)胞由何種細(xì)胞分化而來(lái)時(shí)應(yīng)使用“植物胞外囊泡（plant extracellular vesicles, PEVs）”來(lái)代替“exosomes”。因此，本文中可食性植物胞外囊泡用PEVs表示。

圖1 外泌體產(chǎn)生過(guò)程Fig.1 The production process of exosome

PEVs具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸組成。PEVs含有的核酸主要為微小RNA（microRNA, miRNA），miRNA是一種內(nèi)源單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度通常為21～25個(gè)核苷酸，在生物體內(nèi)起到基因表達(dá)調(diào)控的作用。PEVs含有的RNA種類明顯少于動(dòng)物外泌體，因?yàn)閯?dòng)物外泌體中含有豐富的信使 RNA（message RNA，mRNA）、miRNA 和長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNAs）。

PEVs所含蛋白質(zhì)的種類較少，含量較低，現(xiàn)已鑒定出的主要種類有調(diào)節(jié)糖脂代謝的蛋白質(zhì)、鳥(niǎo)苷三磷酸酶、與膜和囊泡相關(guān)的蛋白質(zhì)等。動(dòng)物外泌體中含有的蛋白包括四次跨膜蛋白、熱休克蛋白、與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和融合相關(guān)的蛋白以及胞質(zhì)蛋白和膜聯(lián)蛋白等。通過(guò)比對(duì)檸檬PEVs與動(dòng)物外泌體中蛋白質(zhì)種類，發(fā)現(xiàn)其中有56.7%相重合，提示這些蛋白質(zhì)可能是與外泌體形成相關(guān)的特征性蛋白。

PEVs中富含磷脂酸（phosphatidicacid，PA）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、雙半乳糖基二?；视停╠igalactosyl diacylglycerol，DGDG）和單半乳糖基二?；视停╩onogalactosyldiacylglycerol，MGDG）等脂質(zhì)分子，是構(gòu)成囊泡磷脂雙分子層的重要成分。其中，PA是重要的脂質(zhì)信號(hào)分子，能夠通過(guò)不同的作用模式調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程；DGDG和MGDG是重要的糖脂，可以在凍融凍干過(guò)程中穩(wěn)定PEVs。不同果蔬來(lái)源的EVs中脂質(zhì)的種類和相對(duì)含量均有所不同[14-15]。

功能上PEVs可以介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊，也可為細(xì)胞中生物活性代謝物的儲(chǔ)存和分泌提供安全的隔室。PEVs作為細(xì)胞間的通訊通路，在進(jìn)入消化系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)時(shí)，可對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生特異的生物學(xué)效應(yīng)，如生姜來(lái)源的PEVs可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)出血紅素加氧酶（oxygenase-1，HO-1）。作為隔室，PEVs在木本植物木質(zhì)部和韌皮部中參與木本植物細(xì)胞壁重塑的1,4--葡聚糖內(nèi)酯酶的儲(chǔ)存和運(yùn)輸。

1.2 提取方法

PEVs的提取借鑒動(dòng)物外泌體的提取方法，包括超速離心法、蔗糖密度梯度離心法、尺寸排阻色譜法（size exclusion chromatography，SEC）、超濾離心法、免疫磁珠法、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀法、微流控芯片法、非對(duì)稱場(chǎng)流分級(jí)分離法、超聲波納米過(guò)濾技術(shù)等（表1）。此部分已有綜述，此處不再贅述。本文就非對(duì)稱場(chǎng)流分級(jí)分離法和超聲波純化技術(shù)做補(bǔ)充敘述。

表1 現(xiàn)有外泌體提取方法Table 1 Methods for exosome extraction

非對(duì)稱場(chǎng)流分級(jí)分離法也叫單項(xiàng)色譜法，其原理是溶質(zhì)分子在流動(dòng)過(guò)程中由于受到與流動(dòng)方向相垂直或成某種角度的外場(chǎng)作用改變?cè)瓉?lái)的流動(dòng)方式而造成組分的分離。Liu等根據(jù)顆粒的分散系數(shù)不同開(kāi)發(fā)了一種用于分離各種線性和雙鏈環(huán)狀DNA鏈的方法。此法主要由不可滲透的上板和可滲透的底板組成的通道進(jìn)行分離，底板被確定孔徑的半滲透膜覆蓋。通過(guò)在流動(dòng)剖面上施加垂直橫流，來(lái)達(dá)到分離不同尺寸顆粒的目的。Sitar等將非對(duì)稱場(chǎng)流分級(jí)分離與多檢測(cè)系統(tǒng)耦合，結(jié)果顯示外泌體樣品中存在兩個(gè)顆粒亞群，較大的外泌體和較小的囊泡狀顆粒，且橫流速度和通道厚度對(duì)分離效率的影響較大。非對(duì)稱場(chǎng)流分級(jí)分離系統(tǒng)可分離納米到微米級(jí)的顆粒，因此該法適用于外泌體分離且純度較高。然而，非對(duì)稱場(chǎng)流分級(jí)分離法提取到的納米級(jí)囊泡的樣品量較少。

超聲波純化技術(shù)是基于超聲駐波，根據(jù)微粒的大小和密度并對(duì)其施加聲力來(lái)分離的，突出的優(yōu)點(diǎn)是連續(xù)且無(wú)接觸。不同大小的微粒會(huì)在叉指換能器產(chǎn)生的聲波場(chǎng)中受到輻射力而向兩側(cè)的壓力節(jié)點(diǎn)移動(dòng)，輻射壓力與顆粒體積成正比，所以較大的微粒留在側(cè)面，而較小顆粒留在通道中心，并且可以通過(guò)控制聲波功率和流速來(lái)截留不同尺寸的顆粒。Lee等采用一種聲波納米過(guò)濾系統(tǒng)從人卵巢癌細(xì)胞中分離純化出粒徑小于200 nm的外泌體。超聲波純化技術(shù)在提取外泌體的過(guò)程中耗時(shí)短，不存在外界污染，純度高，但是儀器較為昂貴。

雖然已存在多種分離純化外泌體的方法，但是這些方法的提取產(chǎn)量和純度還有待提高，成本有待降低，以滿足PEVs在食品工業(yè)發(fā)展和生物醫(yī)藥行業(yè)的迫切需求。隨著研究的深入，根據(jù)研究對(duì)象和目的對(duì)提純方法進(jìn)行合理優(yōu)化，選擇高效、低廉、簡(jiǎn)便的外泌體提純方法是開(kāi)展外泌體相關(guān)研究的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。無(wú)論是基于何種提取方法得到的外泌體，都需要進(jìn)一步對(duì)其物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征，這是研究外泌體生物學(xué)功能和實(shí)用價(jià)值的必要環(huán)節(jié)。

1.3 表征方法

1.3.1 物性表征 PEVs與外泌體的表征可借鑒納米顆粒的表征手段（表2）。透射電子顯微鏡（transmission electron microscope, TEM）通過(guò)電壓將高密度的電子束與樣品相碰撞，根據(jù)樣品密度和厚度的不同，產(chǎn)生的散射角大小也不同，成像的明暗亮度出現(xiàn)差異，生成具有分辯度的電鏡圖片。經(jīng)高倍放大后，可以觀測(cè)到動(dòng)植物樣品的亞顯微結(jié)構(gòu)，提供形態(tài)學(xué)、尺寸分布、均勻性和表面結(jié)構(gòu)的信息。目前研究人員利用TEM觀測(cè)到葡萄柚胞外囊泡超微結(jié)構(gòu)，以橢圓形的雙層膜結(jié)構(gòu)為主，顆粒大小在200 nm以內(nèi)。然而，對(duì)于PEVs在制樣過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致原結(jié)構(gòu)的破壞，這可能影響樣品的形態(tài)，導(dǎo)致無(wú)法觀察到樣品的真實(shí)形貌。

表2 植物胞外囊泡的表征手段Table 2 The characterization methods of PEVs

掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM）利用二次電子信號(hào)成像原理來(lái)觀測(cè)樣品表面的形貌特征，包括樣品的整體形態(tài)和細(xì)微結(jié)構(gòu)。SEM精度略不如TEM，但高于傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡。Liu等通過(guò)SEM圖像清晰觀察到韭菜來(lái)源胞外囊泡是一側(cè)凹陷的半球形結(jié)構(gòu)，且分散良好，其尺寸都在200 nm附近。掃描電子顯微鏡可提供PEVs的大小和立體形態(tài)的一般細(xì)節(jié)，但是無(wú)法提供囊泡的層狀結(jié)構(gòu)和內(nèi)部信息，不能分析異質(zhì)囊泡群體，且分散樣品成像條件苛刻，通量低。

原子力顯微鏡（atomic force microscope, AFM）借助一種弱相互作用力（即原子力）來(lái)觀測(cè)樣品，將探針與樣品極近距離接觸即可通過(guò)原子力表征樣品的形貌，且能達(dá)到極高的分辨率。Zu等通過(guò)AFM在動(dòng)態(tài)模式下表征并確定茶葉來(lái)源PEVs為100 nm左右，有完整膜的球形納米顆粒外觀。AFM通過(guò)力測(cè)量提供樣品表面的機(jī)械和化學(xué)性質(zhì)的信息，提供三維可視化分析；可在空氣或液體狀態(tài)下操作，不需要在真空中操作。AFM探針尖端的周期性接觸會(huì)造成囊泡的移動(dòng)，導(dǎo)致信號(hào)干擾。

納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）結(jié)合微電泳技術(shù)和布朗運(yùn)動(dòng)，利用Stockes-Einstein方程式計(jì)算出單個(gè)粒子的流體力學(xué)直徑和濃度。此法是國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)和廣大研究者認(rèn)可的外泌體鑒定技術(shù)之一，既適用于單分散體系，也適用于多分散體系樣品。Jae等通過(guò)NTA測(cè)定了從甘藍(lán)分離出胞外囊泡的粒徑范圍都在100～200 nm。該法操作簡(jiǎn)單快速且不破壞外泌體的原始狀態(tài)，樣本可視化，尺寸分布數(shù)據(jù)更可靠。當(dāng)儀器搭配相應(yīng)濾光片，NTA可以測(cè)量熒光抗體標(biāo)記的外泌體來(lái)分析其純度。該法不足之處在于，樣品處理方式可能會(huì)影響尺寸分布，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)等。

納米粒徑分析法通過(guò)觀測(cè)粒子在溶液中的布朗運(yùn)動(dòng)來(lái)測(cè)定粒徑大小，粒徑越大布朗運(yùn)動(dòng)的速度就越慢，反之則越快。具體觀測(cè)可使用激光照射粒子，激光起伏的速度會(huì)表明粒子布朗運(yùn)動(dòng)的速度快慢，通過(guò)檢測(cè)散射光強(qiáng)度反應(yīng)粒子的粒徑，即動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light-scattering，DLS）。Raimondo 等通過(guò)DLS測(cè)定了檸檬汁胞外囊泡的尺寸分布在10～300 nm內(nèi)。該法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、精度高，適用于單分散體系。

Zeta電位反映了溶液中的粒子在分散體系中受靜電作用的影響情況，可表征粒子分散體系的物理穩(wěn)定性。Zeta電位的絕對(duì)值越大，體系越穩(wěn)定；一般認(rèn)為Zeta電位的絕對(duì)值大于30 mV時(shí)，體系穩(wěn)定。如葡萄胞外囊泡在-11.2到-13.8 mV之間，生姜胞外囊泡-24.6到-29.7 mV之間。該法操作簡(jiǎn)單，樣品量較少、耗時(shí)短。

目前對(duì)PEVs的表征方法雖然有很多，但是單一檢測(cè)手段均不能覆蓋樣品的全部信息，因此，綜合各種表征手段是全方位研究PEVs的關(guān)鍵步驟。同時(shí)，生物樣本具有復(fù)雜性，在胞外囊泡中含有粒徑形貌相近的顆粒，使用基于物理特性的儀器可能無(wú)法鑒定出具有生物功能的類似外泌體的PEVs。所以，利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)PEVs的生物大分子進(jìn)行化學(xué)成分表征是非常必要的。

1.3.2 組分表征 PEVs所含脂質(zhì)可用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行表征。PEVs 中所含蛋白質(zhì)可用蛋白印跡法測(cè)定其蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，通過(guò)質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。PEVs中所含RNA可用瓊脂糖凝膠電泳、Northern印跡法、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）分析；或放射性同位素如P標(biāo)記miRNA然后使核酸探針與miRNA雜交；或轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序，可檢測(cè)靶基因的表達(dá)水平。如Zhao等從椰子水中提取的PEVs，通過(guò)PCR和基因測(cè)序鑒定了PEVs中miRNA的存在。

1.3.3 原位熒光標(biāo)記 PEVs組成成分的差異會(huì)對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響，其表面不同的特異性標(biāo)志物也可以用來(lái)標(biāo)記并純化特定來(lái)源的PEVs。上述提及PEVs的提取方法，尤其是基于PEVs直徑的分離方法，其實(shí)無(wú)法將PEVs與那些不具備外泌體生物學(xué)功能但在直徑上類似的囊泡分離。目前，已有三種對(duì)PEVs進(jìn)行標(biāo)記的方法，熒光染料可與PEVs特異性結(jié)合，利用懸浮液的熒光強(qiáng)度來(lái)衡量PEVs的含量。不同的熒光染料與PEVs特異性結(jié)合的部位也有所不同。第一種，借助熒光染料對(duì)PEVs脂質(zhì)雙分子層的標(biāo)記方法。如親脂性染料一般與PEVs膜脂質(zhì)區(qū)結(jié)合，這種結(jié)合非常穩(wěn)定，通常能保持10 d以上。其原理是該種熒光染料可與細(xì)胞膜結(jié)合并使自身處于激發(fā)態(tài)，發(fā)出熒光且不會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。Zheng等用一種紅色親脂性熒光染料（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate， DiI）標(biāo)記血漿中的外泌體，以此追蹤阮病毒在未感染受體中的傳播方式。第二種，借助PEVs表層特異性蛋白的標(biāo)記方法。根據(jù)對(duì)擬南芥、橄欖、煙草和向日葵來(lái)源PEVs的研究，Marcela 等確定了PEVs的標(biāo)志蛋白有三個(gè)，熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70），S-腺苷同型半胱氨酸酶（S-adenosyl-homocysteinase）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase， GAPDH）（圖2）。當(dāng)含有這三種標(biāo)志性蛋白，可將PEVs和其他不具備外泌體生物學(xué)功能的囊泡區(qū)分開(kāi)來(lái)。第三種，借助熒光染料對(duì)PEVs內(nèi)的特定酶發(fā)生反應(yīng)的標(biāo)記方法。如滲透型化合物通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入PEVs后與內(nèi)容物中的特定酶反應(yīng)，從而形成穩(wěn)定的熒光分子。Warren等用乙酰甲氧基甲酯鈣黃綠素（Calcein-AM）對(duì)PEVs進(jìn)行追蹤和檢測(cè)，以了解其在生理或病理過(guò)程中所扮演的角色以及其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用潛力。其原理是AM基團(tuán)為鈣黃綠素提供用于穿透細(xì)胞膜的疏水性，而在進(jìn)入PEVs后，AM基團(tuán)被酯酶剪切，從而讓鈣黃綠素可以停留在目標(biāo)PEVs內(nèi)并發(fā)出綠色熒光。

圖2 PEVs標(biāo)志性蛋白Fig.2 Protein markers in PEVs

2 植物胞外囊泡的抗炎活性

可食性PEVs經(jīng)口服攝入后，在胃部酸性環(huán)境下保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，通過(guò)囊泡運(yùn)輸機(jī)制到達(dá)小腸部位，通過(guò)受體蛋白識(shí)別，PEVs脂質(zhì)雙分子層與宿主細(xì)胞膜融合，經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入腸道細(xì)胞內(nèi)，釋放其攜帶的內(nèi)容物。PEVs被腸道特異性吸收，這促使學(xué)者們重點(diǎn)關(guān)注PEVs對(duì)機(jī)體腸道健康所發(fā)揮的作用。炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是胃腸道慢性自身免疫性疾病，癥狀可表現(xiàn)為間歇性復(fù)發(fā)和炎癥緩解，其致病機(jī)制包括環(huán)境或遺傳因素、腸道微生物群和免疫反應(yīng)。大量研究表明，攝入可食用PEVs在緩解腸道炎癥方面起著重要作用。通過(guò)構(gòu)建腸上皮細(xì)胞模型和小鼠腸炎模型，研究學(xué)者評(píng)估了可食用性植物來(lái)源胞外囊泡的對(duì)腸道屏障的保護(hù)作用。其中，機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是完整的腸粘膜上皮細(xì)胞以及上皮細(xì)胞間的緊密連接，柑橘來(lái)源PEVs可參與調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的基因表達(dá)恢復(fù)腸道屏障功能；葡萄PEVs通過(guò)誘導(dǎo)腸道干細(xì)胞增殖加速腸粘膜上皮的恢復(fù)。腸道微生物群是腸道黏膜屏障的重要組成部分，腸道菌群失衡，會(huì)加速腸道炎癥?？诜枞~來(lái)源PEVs可增強(qiáng)腸道菌群的多樣性和整體豐度，厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比例下降，從而緩解葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium salt，DSS）誘導(dǎo)的腸炎。富含脂質(zhì)PEVs會(huì)被腸道乳酸菌科優(yōu)先吸收，靶向調(diào)節(jié)鼠李糖乳桿菌單加氧酶ycnE產(chǎn)量，誘導(dǎo)白介素-22（interleukin-22，IL-22），改善小鼠腸道屏障，減輕結(jié)腸炎。PEVs通過(guò)靶向腸道巨噬細(xì)胞，上調(diào)血紅素加氧酶-1的表達(dá)，抑制促炎因子的生成，上調(diào)白介素-10 （interleukin-10, IL-10）的分泌，從而維持腸道穩(wěn)態(tài)。PEVs還可參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，如魚(yú)腥草來(lái)源PEVs促進(jìn)由脂多糖刺激引起的M1型活化向M2表型的轉(zhuǎn)化，并抑制核因子B（nuclear factor kappa-B，NF-B）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路的激活。除此之外，韭菜PEVs可通過(guò)激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體及其下游信號(hào)通路，包括半胱天冬酶-1自切割、細(xì)胞因子釋放和原代巨噬細(xì)胞的焦亡。這些發(fā)現(xiàn)揭示了PEVs可保護(hù)腸道屏障，調(diào)控炎癥通路，維持腸道穩(wěn)態(tài)，從而減輕機(jī)體炎癥。

不同植物來(lái)源胞外囊泡在抗炎分子作用機(jī)制略有差異，這可能與PEVs攜帶的核酸種類有關(guān)。Xiao等通過(guò)基因測(cè)序技術(shù)預(yù)測(cè)出大豆、哈密瓜、橙子、生姜、番茄5種來(lái)源PEVs中的靶向細(xì)胞因子的miRNA基因序列（表3）。PEVs內(nèi)miRNAs既可以調(diào)控腸道屏障功能，又可調(diào)節(jié)樹(shù)突細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的功能以及NF-B相關(guān)信號(hào)通路提高機(jī)體免疫功能。除了miRNA以外，PEVs內(nèi)的蛋白對(duì)IBD進(jìn)程中的免疫反應(yīng)、腸道屏障以及腸道菌群均具有一定的調(diào)控作用。玉米來(lái)源PEVs的脂質(zhì)成分葡萄糖神經(jīng)酰胺，已被證實(shí)可以抑制IBD中的結(jié)腸炎癥。以上研究表明，PEVs各組分對(duì)緩解IBD的均可起到重要作用。綜上所述，PEVs的結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物決定了其在腸道內(nèi)的抗炎活性。值得關(guān)注的是，PEVs攜帶的miRNAs在調(diào)節(jié)免疫功能和炎癥信號(hào)通路方面發(fā)揮的關(guān)鍵作用，使PEVs可能成為炎癥性腸炎治療的一個(gè)具有前景的研究方向。

表3 可食性植物胞外囊泡miRNAs和預(yù)測(cè)靶基因Table 3 miRNAs and predicted target human genes of PEVs

3 植物胞外囊泡在食品工業(yè)和藥物遞送方面的應(yīng)用

3.1 植物胞外囊泡在食品工業(yè)中的應(yīng)用

3.1.1 在功能飲料中的應(yīng)用 植物胞外囊泡具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降脂及免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性，且其含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等營(yíng)養(yǎng)成分。進(jìn)食后PEVs會(huì)暴露在消化道環(huán)境中，但磷脂雙分子層會(huì)保護(hù)PEVs不受消化道和胃酸環(huán)境的破壞。因此，PEVs腔內(nèi)的生物活性物質(zhì)（miRNA、蛋白質(zhì)和代謝物）不會(huì)與腸道的降解酶接觸，從而確保了其穩(wěn)定

性。食用后PEVs能被腸道細(xì)胞吸收發(fā)揮局部作用，并通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)其他組織影響整個(gè)機(jī)體健康。飲品如豆?jié){、椰汁、橙汁、蔬菜汁、姜茶中富含PEVs，可促進(jìn)腸胃吸收，加強(qiáng)人體營(yíng)養(yǎng)健康。鑒于PEVs可有效緩解炎癥性腸病，為患者定制個(gè)性化的復(fù)配飲品，具有一定的應(yīng)用前景。PEVs還可以通過(guò)凍干的方式得到粉末，比如從新鮮茶葉中提取的胞外囊泡凍干粉，將其添加到飲料中，或可以做成茶包，經(jīng)水復(fù)溶，制備茶飲。

3.1.2 食品加工過(guò)程對(duì)PEVs的影響 PEVs主要從新鮮水果、蔬菜及其他可食性草本植物制得，在食品加工過(guò)程中，能否保持PEVs的營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性至關(guān)重要。燉煮是最常用的加熱方式，研究表明，蒲公英、金銀花和紅景天經(jīng)過(guò)煮沸半小時(shí)左右，PEVs攜帶的核酸經(jīng)胃腸道被人體吸收，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)輸送到各器官，發(fā)揮抗炎、抗腫瘤等功能。水果可直接食用或榨汁，主要涉及物理過(guò)程，可保證胞外囊泡的結(jié)構(gòu)和活性。微波加熱豆?jié){，會(huì)造成磷脂耗損量增加，蛋白質(zhì)和碳水化合物會(huì)和磷脂產(chǎn)生絡(luò)合物。牛奶作為食源外泌體的重要來(lái)源，經(jīng)微波處理，脂肪整體含量變化不大，但是脂肪球受微波的作用逐步分解縮小，導(dǎo)致脂肪分離。因此，微波處理要控制好加熱時(shí)間，避免食源外泌體營(yíng)養(yǎng)成分的流失。商業(yè)滅菌牛奶和鮮牛奶相比，商業(yè)滅菌牛奶外泌體所含的蛋白質(zhì)種類有43%和鮮牛奶是一致的，有8127個(gè)RNAs相同，且兩種牛奶外泌體都具有抗腫瘤的活性。發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致酸奶外泌體的內(nèi)容物和生物活性物質(zhì)發(fā)生改變，如從新鮮馬奶和酸馬奶中分離得到的外泌體對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生不同的免疫調(diào)節(jié)作用，新鮮馬奶外泌體可促進(jìn)IL-12p40和TNF-的分泌，而酸馬奶外泌體促進(jìn)抗炎因子IL-10的分泌。在煮熟或加工肉制品中也發(fā)現(xiàn)外泌體的存在，如煎炸的和巴氏殺菌的牛里脊肉、牛心、腎上腺的深度測(cè)序分析已經(jīng)證實(shí)，miRNA的存在，且可潛在靶向人類特定細(xì)胞的mRNAs。總的來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)煮沸、微波、商業(yè)滅菌和發(fā)酵工藝處理后的食品原料中依然能分離出外泌體或PEVs，并且能夠較大程度地保護(hù)其中的活性物質(zhì)，發(fā)揮多種生物功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。然而，在食品加工過(guò)程中仍然存在PEVs原始結(jié)構(gòu)破裂、蛋白質(zhì)變性等問(wèn)題，加工食品中的miRNA的穩(wěn)定性是否由于外泌體的包封所致，目前具體機(jī)制尚未明確，還需要進(jìn)一步研究。

3.1.3 植物胞外囊泡作為壁材遞送食品功能因子在食品工業(yè)中，花青素作為食品著色劑，易受酸堿度、溫度等因素影響導(dǎo)致其穩(wěn)定性差；蝦青素作為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其在體內(nèi)的消化吸收受到溶解度和酯化程度的限制；姜黃素作為藥食同源物質(zhì)，生物利用度低、水溶性差，在人體內(nèi)尚未完全發(fā)揮作用便被排出體外。選擇合適的壁材，有望解決這些食品功能因子的穩(wěn)定性和生物利用度差等問(wèn)題。PEVs作為納米級(jí)囊泡，在生理環(huán)境下具有尺寸效應(yīng)，類似脂質(zhì)體，且內(nèi)含核酸和蛋白質(zhì)，在細(xì)胞間具有天然的通信功能。PEVs可直接從口腔攝入，生物相容性好，有助于提高功能因子的生物利用度，增強(qiáng)功能因子營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，這使得PEVs成為優(yōu)良的壁材。

目前有六種方法有望將目標(biāo)分子包埋到PEVs中，分別是滲透休克法、脂質(zhì)體膜融合、凍融法、電穿孔法、超聲法、皂苷處理法和共孵育法（圖3）。滲透休克法通過(guò)瞬時(shí)改變胞外囊泡的滲透壓，使其產(chǎn)生輕微裂解，從而將目標(biāo)分子包埋進(jìn)囊泡中。Kunisawa等利用滲透休克法成功將模型分子包埋進(jìn)胞外囊泡中，同時(shí)也嘗試了其余幾種方法，如脂質(zhì)體膜融合技術(shù)利用脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合性或細(xì)胞的胞吞作用將預(yù)裝在脂質(zhì)體中的目標(biāo)分子隨著膜融合過(guò)程遞送進(jìn)PEVs中。凍融法在脂質(zhì)體膜融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)迅速冷凍在PEVs內(nèi)部形成冰晶，進(jìn)而使PEVs表膜破碎，破碎的表膜和冰晶同時(shí)存在；當(dāng)融解時(shí)，破碎的表膜會(huì)重新融合形成完整的PEVs，通過(guò)反復(fù)凍融目標(biāo)分子得到了多次被包埋的機(jī)會(huì)，從而提高目標(biāo)分子的包埋率。電穿孔法通過(guò)施加外加電場(chǎng)使細(xì)胞膜輕微破裂，使目標(biāo)分子得以進(jìn)入PEVs中。超聲法是在特定頻率下，目標(biāo)分子和PEVs共同超聲，通過(guò)空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，將目標(biāo)分子包埋進(jìn)PEVs中。鮑少杰用超聲的方法將蝦青素包載進(jìn)西蘭花來(lái)源的PEVs中，可提高蝦青素生物利用度，抑制腸炎。皂苷有著自組裝特性，可形成穩(wěn)定乳液，皂苷處理能使目標(biāo)分子更易被包埋進(jìn)PEVs中。共孵育法是目前最常用的方法，通過(guò)疏水相互作用、擴(kuò)散作用或靜電相互作用將目標(biāo)分子包埋進(jìn)PEVs中。水溶性的花青素與牛奶外泌體共孵育一定時(shí)間，得到的遞送體系可以有效抑制乳腺癌的惡化。采用PEVs來(lái)運(yùn)載脂溶性目標(biāo)分子已有成功案例，如吳菊萍等用番茄來(lái)源的PEVs分別包裹脂溶性模型藥物細(xì)胞膜紅色熒光探針（DiI）和目的基因來(lái)培育細(xì)胞，且比陽(yáng)離子脂質(zhì)體負(fù)載目的基因的效果更好（表4）。這幾種方法中滲透休克法包載水溶性分子的效率最高，凍融法次之，其他方法包載效率低。根據(jù)目標(biāo)分子溶解性差異，借助PEVs來(lái)運(yùn)載脂溶性和親水性目標(biāo)分子的策略也有所不同。

表4 植物胞外囊泡運(yùn)載食品功能因子的實(shí)例Table 4 Food functional factors as cargos in PEVs delivery system

圖3 PEVs遞送目標(biāo)分子的策略Fig.3 Delivery strategies of target molecules by PEVs

3.2 植物胞外囊泡作為藥物遞送體系的應(yīng)用

藥物分子的溶解性直接影響藥物的口服利用度及藥效。采用PEVs或動(dòng)物外泌體作為運(yùn)載體系，可直接從口腔攝入，生物相容性好，有助于提高藥物攝入量，增強(qiáng)體內(nèi)藥物積累量，從而提高治療效果。PEVs還可以運(yùn)輸抗癌藥物，因?yàn)樗鼈兺黄屏朔鞘称穪?lái)源的外泌體和合成脂質(zhì)對(duì)生物利用度、穩(wěn)定性和安全性的限制（表5）。甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）是脂溶性抗癌藥，經(jīng)口服給藥，毒副作用大。Wang等研究發(fā)現(xiàn)葡萄柚來(lái)源PEVs作為載體，通過(guò)共孵育的方法，包封MTX后，可將MTX靶向遞送至腸道細(xì)胞，緩解由DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。將阿霉素或生存素的小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）與含有葉酸的重組生姜來(lái)源PEVs整合，用于靶向小鼠結(jié)腸癌和乳頭狀瘤。與傳統(tǒng)遞藥體系（如脂質(zhì)體、乳液、微膠囊、“核-殼”結(jié)構(gòu)無(wú)機(jī)納米粒子等）相比，PEVs作為藥物遞送體系，具有的優(yōu)勢(shì)在于取材方便、易于提取純化、食用安全，且具有良好的生物相容性。盡管目前對(duì)PEVs選擇性包裝和釋放藥物以及與靶細(xì)胞相互作用的具體機(jī)制還不完全了解，但是由于其在控制生理和病理過(guò)程中以及作為藥物載體方面的潛在重要作用，未來(lái)對(duì)各種來(lái)源PEVs中的生物分子進(jìn)行全面系統(tǒng)分析，將促進(jìn)PEVs在藥物遞送方面的應(yīng)用。

表5 植物胞外囊泡在藥物遞送方面的應(yīng)用實(shí)例Table 5 The applications of PEVs on drug delivery system

4 結(jié)論和展望

總而言之，PEVs的分離方式和表征手段多種多樣，既取決于PEVs的來(lái)源，也取決于儀器的限制。不同分離方式的結(jié)合可以在一定程度上提高分離的效果，不同表征方式的聯(lián)用可以體現(xiàn)PEVs綜合性質(zhì)。在應(yīng)用方面，PEVs可對(duì)腸炎起到干預(yù)作用，其作用機(jī)理如下：a.保護(hù)腸道屏障，誘導(dǎo)腸道干細(xì)胞增殖，加速腸道粘膜的恢復(fù)；b.維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)；c.通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用，抑制炎癥信號(hào)通路。PEVs作為遞送載體，具有良好的生物相容性和口服安全性，可跨越生物學(xué)屏障，無(wú)副作用和潛在毒性，將脂溶性和親水性目標(biāo)分子遞送至體內(nèi)組織，提高目標(biāo)分子的生物利用度或藥效。當(dāng)然，PEVs在走向?qū)嶋H應(yīng)用的過(guò)程中，還存在諸多問(wèn)題，比如PEVs的儲(chǔ)藏條件較為苛刻；不同植物來(lái)源PEVs含量存在較大差異，如何選擇合適的可食性植物來(lái)源至關(guān)重要。外泌體的研究在臨床上已有成功案例，如何在食品行業(yè)尋找到合適的應(yīng)用方向，一方面需要科研人員奠定好食源性PEVs的理論基礎(chǔ)，另一方面要與工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際相結(jié)合。相信隨著分離方式和表征手段的不斷優(yōu)化，能有更多PEVs在食藥領(lǐng)域發(fā)揮作用的例子涌現(xiàn)，擁有更廣闊的前景。