人參-丁香醇提物抑制高山被孢霉脂質(zhì)合成的活性評價(jià)

倪偉鋒，趙大慶，倪以宇，白竹林，王思明

（長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長春 130000）

肥胖是目前全球最主要的公共健康問題之一，主要是機(jī)體長期能量攝入超過能量消耗，使能量經(jīng)各種脂肪酸合成相關(guān)酶的作用合成脂肪酸，并最終以甘油三酯的形式在白色脂肪或其他器官中過度堆積。臨床上很多疾病都是因長期肥胖而衍生來的，由肥胖所引起的疾病可謂遍及全身各個(gè)系統(tǒng)，尤以糖尿病、高血壓、高尿酸血癥等疾病與肥胖關(guān)系更為密切，對人類健康構(gòu)成巨大威脅。

人參，五加科植物人參C.A.Meyer的干燥根和根莖，具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺之功，用于體虛欲脫、脾虛食少、久病虛贏之證，于2012年被批準(zhǔn)為新資源食品。丁香，桃金娘科植物丁香Thunb.的干燥花蕾，具有溫中降逆、補(bǔ)腎助陽之效，用于脾胃虛寒、呃逆止嘔、食少吐泄之證，是2002年被批準(zhǔn)的首批藥食同源的中藥材。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肥胖之人往往脾腎陽虛、嗜食肥甘、喜靜少動(dòng)，主要病機(jī)為脾氣兩虛，在古代經(jīng)方中就有許多人參丁香互相配伍用于補(bǔ)氣健脾的記載，比例常為1:1、1:2和2:1，且常用方法為水煎煮和酒浸泡。研究發(fā)現(xiàn)人參、丁香單味用藥在抗氧化、抗腫瘤、抗炎、以及治療肥胖有較好的成效，而其配伍共同作用于治療肥胖的研究鮮有報(bào)導(dǎo)。

高山被孢霉（，MA）是白色絲狀真菌，一種重要的產(chǎn)油微生物，其油脂含量是其干重的50%以上，高山被孢霉的脂肪酸合成酶（FASN）由乙?；D(zhuǎn)移酶、丙二酸單?；D(zhuǎn)移酶、-烯脂酰還原酶、-羥脂酰脫水酶、-酮脂酰還原酶、-酮脂酰合酶和1個(gè)?；d體蛋白組成，在相關(guān)酶和載體蛋白的作用下使得脂肪酸合成，這與哺乳動(dòng)物類似，哺乳動(dòng)物的FASN是一類多功能酶，是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)合成過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，能夠催化細(xì)胞中長鏈脂肪酸的從頭合成，通過抑制FASN活性抑制脂質(zhì)從頭合成，一定程度上維持機(jī)體能量的平衡，也因其所含F(xiàn)ASN與哺乳動(dòng)物具有的相似性而被評為一種脂質(zhì)合成抑制劑篩選的平臺(tái)；而奧利司他（Olistat），能夠與FASN相關(guān)酶結(jié)合，阻止FASN催化的最后一步棕櫚酸的釋放，被美國食品和藥物管理局（FDA）認(rèn)證為減肥藥物。

本文借助高山被孢霉和3T3-L1脂肪細(xì)胞研究人參-丁香抑制脂質(zhì)合成作用，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探索，為從藥食同源食品中尋找以膳食補(bǔ)充劑達(dá)到食療緩解肥胖提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高山被孢霉（ATCC32222） 購于中國微生物菌種保藏管理中心；3T3-L1前脂肪細(xì)胞（Procell CL-0006）、3T3-L1專用培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生命科技有限公司；TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）、MTT（四甲基偶氮唑藍(lán)）、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基 購于北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒 購于碧云天生物技術(shù)公司；青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）、胰酶（0.25% 胰酶-EDTA（600 U/mL））、胎牛血清 購于美國Hyclone公司；引物 由吉林省庫美生物科技有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 購于Takara。

Infinite M200 PR0全自動(dòng)酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；CFX Connect PCR儀 美國 Bio-rad公司；6700F型掃描電鏡 日本電子；GCMS-TQ8040NX氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、UV-2550型紫外可見光度計(jì)日本島津公司；Innova 40搖床 德國Eppendorf公司；SX-700蒸汽滅菌器 日本Tomy Digital Biology公司；T10 bcsic型分散器 德國IKA公司；Kendro CO細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理

1.2.1.1 不同藥材比例 將人參、丁香分別粉碎后按不同比例1:1、1:2、2:1混勻，每種比例4份，共12份待用。

1.2.1.2 不同提取溶劑 將上述混勻藥材分別以1:10料液比進(jìn)行水煎煮，并用100%乙醇、70%乙醇和50%乙醇分別進(jìn)行回流提取，保持沸騰狀態(tài)提取1.5 h后過濾，重復(fù)兩次，合并兩次濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶劑去除，得到12種固體提取物。

1.2.2 人參丁香提取物對高山被孢霉脂肪合成的抑制作用研究

1.2.2.1 菌株的培養(yǎng)及提取物的篩選 將高山被孢霉在麥芽汁瓊脂固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，取之于肯德里克肉湯（Kendrick Broth）培養(yǎng)液（20 g/L葡萄糖，5 g/L 酵母提取物，1 g/L KHPO，0.25 g/L MgSO·7HO，10 g/L KNO）中活化三代，將活化的MA按1%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL Broth培養(yǎng)液，28 ℃培養(yǎng)72 h，分散器打散，稀釋至0.5光密度（OD）值后接種于96孔板中。每孔加入0.1% TTC和5 μg/mL上述不同提取物，并設(shè)置溶劑陰性的空白對照組與5 μg/mL奧利司他陽性對照組，將96孔板放置于28 ℃培養(yǎng)箱中，暗處培養(yǎng)72 h后于酶標(biāo)儀在485 nm處測OD值。

1.2.2.2 給藥擴(kuò)大培養(yǎng)及保存 將1.2.2.1中菌液以1%的接種量轉(zhuǎn)接于新的Broth液體培養(yǎng)基用于擴(kuò)大培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組加入1.2.2.1篩選出的人參丁香比為1:2的100%乙醇提取物（alcohol extract of genseng and clove，AEGC），設(shè)置給藥量為 5 mg/L AEGC 的給藥組，空白對照組加入相同體積的DMSO溶劑和5 mg/L奧利司他陽性對照組，在28 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)5 d。用分散機(jī)打散菌體，吸取5 mL混勻的菌液過濾，洗滌3遍，收集菌體于離心管中，冷凍干燥后獲得干重。過濾出剩余菌體，洗滌3遍，取約1/3菌體-80 ℃保存，用于酶活分析，剩余約2/3菌體經(jīng)冷凍干燥得到干菌-80 ℃保存，用于單試劑GPOPAP法測定甘油三酯含量、BCA法測定蛋白含量，以及總脂肪酸含量測定、脂肪酸組分分析和RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR。

1.2.2.3 電鏡觀察 取上述1.2.2.2中擴(kuò)大培養(yǎng)的高山被孢霉挑取少量菌絲轉(zhuǎn)接至L-多聚賴氨酸包被細(xì)胞爬片，并用戊二醛固定吹干后做為掃描電鏡的樣品，離子濺射儀噴金制片，在掃描電鏡下以3000 V電壓、7.6～7.7 mm工作距離下，使用500～2000倍放大倍數(shù)觀察拍照。

1.2.2.4 酶活分析 取1.2.2.2中適量菌體于研缽，倒入液氮研磨并不斷添加液氮研磨，重復(fù)多次，加入適量含有20%甘油的酶提取緩沖液（100 mmol/L KHPO/KOH，pH7.5，1 mmol/L苯 甲 脒 鹽 酸 ，1 mmol/L DTT），5 min，10000 r/min，4 ℃ 離心兩次，取上清液即得到酶提取液，用BCA法測定破碎上清液中的蛋白濃度，并測定蘋果酸酶（Malic enzyme，ME）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-P）和 ATP 檸檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）活力，嚴(yán)格按照 ELISA 試劑盒測定脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）活力。

1.2.2.5 脂肪酸分析 將1.2.2.2中凍干后的菌體置于研缽中進(jìn)行研磨粉碎，稱取50 mg菌粉置于已加入2 mL 4 mol/L鹽酸的凍存管中，對菌體進(jìn)行破壁處理，隨后置于80 ℃水浴1 h后迅速轉(zhuǎn)至-80 ℃中冷凍15 min，如此重復(fù)三次后，萃取得無色液體至氮?dú)獯蹈傻么种?，再?jīng)鹽酸-甲醇甲酯化后萃取得到得脂肪酸甲酯經(jīng)GC-MS檢測，與37種混合脂肪酸標(biāo)品比較進(jìn)行分析。

1.2.2.6 RT-qPCR 用Trizol從上述1.2.2.2的MA中分離出總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反向轉(zhuǎn)錄到cDNA。引物序列見表1。采用CFX連接實(shí)時(shí)系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）進(jìn)行RT-qPCR，采用以下實(shí)驗(yàn)條件：階段 1（1 次循環(huán)）95 ℃ 30 s，階段 2（40 次循環(huán)）95 ℃ 5 s；54 ℃ 15 s；72 ℃ 30 s；擴(kuò)增完畢后，以18sRNA為內(nèi)參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達(dá)的CT值，采用2法進(jìn)行相對基因表達(dá)量分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 人參丁香提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞作用研究1.2.3.1 增殖抑制作用測定 采用MTT法來測定AEGC對細(xì)胞的毒性作用，將胰酶消化培養(yǎng)液重懸的3T3-L1前脂肪細(xì)胞以 5×10個(gè)/孔接種于96孔板，100 μL專用培養(yǎng)基每孔，平行6個(gè)孔，于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，倒掉培養(yǎng)液，更換為100 μL加有不同濃度AEGC和奧利司他陽性對照的專用培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，參照細(xì)胞存活率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組OD-不含細(xì)胞的等量培養(yǎng)基OD）/（空白組OD-不含細(xì)胞的等量培養(yǎng)基OD）]×100常規(guī)方法，于每孔中加 MTT溶液 20 μL，孵育 4 h后，吸去培養(yǎng)液和MTT，加入DMSO后，于490 nm處測吸光密度（OD）值。

1.2.3.2 給藥干預(yù)誘導(dǎo)分化 將脂肪細(xì)胞以5×10個(gè)/孔接種于96孔板，專用培養(yǎng)基培養(yǎng)待細(xì)胞接觸抑制，將其放置在含10% FBS的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，換于含10% FBS、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μmol/L地塞米松和10 μg/mL胰島素的DMED高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，換于含10%胎牛血清和10 μg/mL胰島素的DMEM培養(yǎng)2 d，隨后以10% FBS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)液。將加入地塞米松等誘導(dǎo)劑算作分化第1 d，從第1 d起，實(shí)驗(yàn)組分別給予含不同濃度的AEGC和奧利司他，全程干預(yù)細(xì)胞分化過程，之后對其抑制作用進(jìn)行測定。

1.2.3.3 細(xì)胞分化抑制作用測定 取上述1.2.3.2中第8 d分化的細(xì)胞每孔加MTT溶液20 μL，孵育4 h后，吸去培養(yǎng)液和MTT，加入DMSO于酶標(biāo)儀在490 nm處測吸光密度（OD）值，檢測AEGC對細(xì)胞分化過程中細(xì)胞的毒性。細(xì)胞分化的第8 d嚴(yán)格按照試劑盒方法每孔加入油紅，進(jìn)行油紅O染色拍照和異丙醇洗脫油紅半定量檢測脂質(zhì)生成率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組 OD-空白組 OD）/（對照組 OD-空白組 OD）]×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 人參丁香提取物對高山被孢霉脂肪合成的抑制作用

使用脂溶性光敏感復(fù)合物TTC試劑篩選抑制高山被孢霉脂肪合成的結(jié)果如圖1所示，人參-丁香比為1:1、1:2、2:1的100%乙醇提取物在72 h干預(yù)后的OD值和空白組有顯著差異（＜0.05），其中，1:2的人參丁香100%乙醇提取物（AEGC）差異最大（＜0.01）顯著優(yōu)于陽性結(jié)果（＜0.05），說明此提取物在所有提取物中最大的抑制了MA的脂質(zhì)合成，結(jié)合表2所示的提取率，1:2人參丁香的100%乙醇提取物提取率在同層次中最高，且抑制脂質(zhì)合成能力最強(qiáng)，故使用AEGC進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)探索抑制脂質(zhì)合成機(jī)制。

圖1 TTC篩選MA脂質(zhì)合成抑制初步結(jié)果Fig.1 Preliminary results of TTC screening for MA lipid synthesis inhibition

表2 人參丁香不同比例和不同溶媒的提取率Table 2 Extraction rate of different proportions of ginseng cloves and different solvents

2.2 AEGC作用高山被孢霉后電鏡下形態(tài)變化

高山被孢霉形態(tài)如圖2所示，在放大500倍鏡下總體形態(tài)無明顯差異，而在放大2000倍鏡下，陽性組和給藥組菌絲的粗細(xì)度更均勻，內(nèi)含油脂的藕節(jié)狀菌絲較空白組幾乎不可見。通過對高山被孢霉的給藥擴(kuò)大培養(yǎng)，提取物AEGC可能會(huì)減少M(fèi)A的脂質(zhì)積累。

圖2 高山被孢霉電鏡形態(tài)Fig.2 Mortierella alpina electron microscope morphology

2.3 AEGC作用高山被孢霉后甘油三酯和蛋白含量

MA中所含的甘油三酯含量和蛋白含量如圖3所示，給藥組和陽性組的甘油三酯含量極顯著小于空白組甘油三酯含量（＜0.01），而MA所含的蛋白質(zhì)含量無顯著差異（＞0.05），由此推測，提取物AEGC能不減少蛋白含量而抑制甘油三酯的積累以免對高山被孢霉產(chǎn)生損傷。

圖3 高山被孢霉蛋白含量和甘油三酯含量Fig.3 Mortierella alpina protein content and triglyceride content

2.4 AEGC作用高山被孢霉后酶活分析

高山被孢霉中蘋果酸酶（ME）、ATP-檸檬酸裂解酶（ACLY）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-P）和脂肪酸合酶（FAS）酶活力如圖4所示，給藥組和陽性組的酶活力較空白組顯著降低（＜0.05），因丙二酸單酰輔酶A與乙酰輔酶A在FAS的催化下合成脂肪酸；ACLY在丙酮酸進(jìn)入線粒體合成檸檬酸再進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生乙酰CoA過程中發(fā)揮著十分重要的作用；G-6-P和ME共同提供脂肪酸合成所需的NADPH，ME產(chǎn)生的NADPH很多將用于脂肪酸的合成，故推測AEGC能通過抑制ME、ACLY、G-6-P和FAS的酶活力，從而抑制高山被孢霉脂質(zhì)的合成與積累。

圖4 AEGC作用后高山被孢霉酶活力Fig.4 Enzyme activity of Mortierella alpina after AEGC

2.5 AEGC干預(yù)擴(kuò)大培養(yǎng)高山被孢霉脂肪酸含量分析

擴(kuò)大培養(yǎng)高山被孢霉的脂肪酸含量氣質(zhì)分析如表3所示，共檢出25種不同的脂肪酸，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中高山被孢霉C14:0、C16:0、C18:0和C20:0脂肪酸以及多種脂肪酸含量顯著減少（＜0.05），同時(shí)總脂肪酸的含量也明顯減少，與奧利司他陽性結(jié)果趨勢一致，以此推測AEGC可能是潛在的脂質(zhì)合成抑制劑。

表3 高山被孢霉脂肪酸含量GC-MS分析（mg/g）Table 3 GC-MS analysis of fatty acid content of Mortierella alpina (mg/g)

2.6 AEGC作用高山被孢霉后相關(guān)基因PCR分析

為了進(jìn)一步研究AEGC對脂質(zhì)合成的機(jī)制，選擇了、、和作用于脂質(zhì)合成機(jī)制中重要的因子，結(jié)果如圖5所示，給藥組和陽性藥組的這些基因表達(dá)量均顯著減少（＜0.05），因ACC和FAS是脂質(zhì)生成的必需和限速底物，ACLY亦是脂質(zhì)合成重要酶之一，且ME為脂肪酸的合成提供了NADPH，故推測AEGC對高山被孢霉脂質(zhì)合成的抑制作用可能是通過下調(diào)相關(guān)mRNA的表達(dá)以影響高山被孢霉從頭合成脂肪生成。

圖5 高山被孢霉脂質(zhì)合成相關(guān)酶表達(dá)Fig.5 Lipid synthesis-related enzyme expression of Mortierella alpina

2.7 細(xì)胞增殖

MTT法檢測AEGC對3T3-L1脂肪細(xì)胞增殖抑制作用結(jié)果如圖6所示，在加入不同濃度（10、20、30、40和 50 μg/mL）的 AEGC 培養(yǎng) 48 h后，和空白對照組相比，AEGC給藥組以及濃度為 20、30 μg/mL的陽性組脂肪細(xì)胞活力顯著下降（＜0.05），均表現(xiàn)出對脂肪細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用，并且隨著藥物濃度的升高對細(xì)胞增殖的抑制作用越強(qiáng)。

圖6 AEGC對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖抑制作用Fig.6 The inhibitory effect of AEGC on the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes

2.8 細(xì)胞分化

MTT法檢測3T3-L1脂肪細(xì)胞分化后細(xì)胞的活力結(jié)果如圖7所示，在給藥干預(yù)誘導(dǎo)后，和空白對照組相比較，給藥干預(yù)脂肪細(xì)胞的分化并不會(huì)對脂肪細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性。

圖7 給藥誘導(dǎo)后細(xì)胞活力Fig.7 Cell viability after induction of administration

2.9 3T3-L1脂肪細(xì)胞油紅染色及半定量分析

油紅O染色法半定量分析誘導(dǎo)后3T3-L1脂肪細(xì)胞胞內(nèi)的脂質(zhì)含量，結(jié)果如圖8所示，較空白對照組，給藥組（20、30 μg/mL）和陽性藥組被油紅染色的紅色戒環(huán)明顯減少，通過異丙醇洗脫，給藥組和陽性藥組脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)含量顯著減少（＜0.05），表明AEGC能抑制3T3-L1分化為脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)合成和積累。

圖8 油紅染色洗脫和拍照結(jié)果Fig.8 Oil red staining elution and photographing results

3 結(jié)論

本次研究在微生物方面，利用TTC初步篩選出用于抑制脂質(zhì)合成的人參丁香比為1:2的100%乙醇提取物，在給藥干預(yù)后通過掃面電鏡觀察和脂肪酸氣質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)霉內(nèi)脂質(zhì)減少，也發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)合成途徑中ACC、FAS、ME等重要因子其酶活被抑制及其mRNA表達(dá)量減少，AEGC表現(xiàn)出較好的抑制高山被孢霉脂質(zhì)合成能力；在細(xì)胞水平，通過經(jīng)典雞尾酒誘導(dǎo)方式，在AEGC干預(yù)誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的脂肪細(xì)胞在經(jīng)油紅O染色半定量分析，發(fā)現(xiàn)其對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中脂質(zhì)的積累起到了一定程度的抑制作用。綜上AEGC能夠抑制高山被孢霉的脂質(zhì)合成和3T3-L1細(xì)胞分化的成脂積累，本結(jié)果評估了AEGC對高山被孢霉脂質(zhì)代謝的影響和細(xì)胞層面的初步探究，對治療肥胖癥提供了一個(gè)新的可選方案。