TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)菰米成分的方法建立

楊愛(ài)馥，萬(wàn) 超，劉雪華，梁 冰，鄭秋月，姜 麗,

（1.大連海關(guān)，遼寧大連 116001；2.大連民族大學(xué)，遼寧大連 116600）

隨著現(xiàn)代食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)的發(fā)展，公眾對(duì)營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題關(guān)注的焦點(diǎn)已經(jīng)由解決一般人群傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)缺乏轉(zhuǎn)向如何合理膳食、平衡營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)健康。隨著國(guó)民生活水平的不斷提高，以及民眾保健養(yǎng)生意識(shí)的增強(qiáng)，高營(yíng)養(yǎng)、高價(jià)值農(nóng)產(chǎn)品迎合了現(xiàn)階段國(guó)民食物需求營(yíng)養(yǎng)化、健康化的特點(diǎn)，消費(fèi)量快速增長(zhǎng)。菰米（Wild rice），也被稱作野米，是禾本科菰屬（）植物的穎果，屬于全谷物，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含蛋白質(zhì)、必需氨基酸、脂肪酸、維生素、膳食纖維以及各種微量元素，且脂肪含量低。此外，菰米還含有大量的活性物質(zhì)，如酚酸、植物甾醇、谷維素、-氨基丁酸、類黃酮等，保證了其作為功能性食品的發(fā)展。菰米中的活性物質(zhì)能夠有效地抑制高脂血癥和氧化應(yīng)激，預(yù)防肥胖和肝臟脂肪毒性，改善異常糖代謝和抑制胰島素抵抗、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、還具有抗氧化、抗炎、抗過(guò)敏和免疫調(diào)節(jié)作用。因此，菰米已得到了國(guó)內(nèi)外的廣泛認(rèn)可，成為一種高價(jià)值的保健食品，被稱為“谷物中的魚(yú)子醬”。

世界上菰屬植物有4種，包括分布在東亞的中國(guó)菰（）以及分布在北美的水生菰（）、沼生菰（s）和德克薩斯菰（）。隨著菰米的商業(yè)化程度日益提高，北美菰米已作為一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、風(fēng)味獨(dú)特、價(jià)格昂貴的健康食品進(jìn)入飲食業(yè)并大量出口到法國(guó)、德國(guó)和意大利等國(guó)家，我國(guó)也批準(zhǔn)了加拿大菰米的準(zhǔn)入。這種進(jìn)口的“營(yíng)養(yǎng)之王”，正在占據(jù)國(guó)人的餐桌。但是目前尚無(wú)菰米成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法，市場(chǎng)上銷(xiāo)售的菰米制品魚(yú)龍混雜、真假難辨，因此急需開(kāi)發(fā)快速、靈敏、精準(zhǔn)的菰米成分真?zhèn)舞b別方法，以保護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益，并為菰米及其制品的進(jìn)口監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廣泛收集菰米樣品及近源谷物、異源食用菌和動(dòng)物樣品，包括大米、薏米、糯米、高粱米、紅米、黑米、黑麥、蕎麥、苦蕎、燕麥、大麥、小麥、藜麥、黃米、奇亞籽、黑芝麻、玉米、黑豆、蕓豆、黃豆、綠豆、扁豆、鷹嘴豆、紅豆、木耳、香菇、鱈魚(yú)、豬肉、牛肉、鴨肉等 購(gòu)自各網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)及大連各超市；植物基因組 DNA 提取試劑盒（貨號(hào) DP305）TIANGEN；Premix ExTaqTM Probe qPCR（貨號(hào)RR390 A） TAKARA；合成引物、探針及測(cè)序 由華大基因完成。

QuantStudio 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 ABI公司； NanoDrop Lite 分光光度計(jì) ThermoFisher公司；5415R小型高速冷凍離心機(jī) Eppendorf公司；WNB7 7L恒溫水浴鍋 Memmert公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 按照TIANGEN基因組 DNA 提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行DNA提??；使用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行DNA純度及濃度的測(cè)定。

1.2.2 樣品真實(shí)性鑒定 利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)收集到的菰米和近源谷物樣品針對(duì)ITS基因的部分特異區(qū)段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行BLAST比對(duì)，進(jìn)行樣品真實(shí)性鑒定，并選取相似度最高的結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載中國(guó)菰（）、水生菰（）、沼生菰（）和德克薩斯菰（）及其近源種栽培稻（）、小粒野生稻（）、斑點(diǎn)野生稻（）、緊穗野生稻（）的 ITS 基因序列，通過(guò)Mega4比對(duì)分析，根據(jù)引物、探針差異性原則、利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物和探針。序列如下：上游引物：5’-CGAGAGTCGTGTGG ATGTTGT-3’；下游引物：5’-TGCGGAAGGATCATT GTCGT-3’；探針：FAM-5’- CGGCGGTCGGTAAGAGG TGTTCC-3’-TAMRA

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法建立 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系Table 1 Reaction system for TaqMan real-time PCR

反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 10 min（1 個(gè)循環(huán)）；95 ℃變性 5 s，60 ℃ 退火/延伸 30 s（40 個(gè)循環(huán)），熒光閾值為設(shè)備默認(rèn)值。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 利用1.2.1中的DNA提取方法提取1.1中所述各樣品基因組DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，以ddHO水為空白對(duì)照，檢測(cè)所建立實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗(yàn) 模擬添加：分別以鱈魚(yú)粉和易混谷物（大米、黑米和黑麥混合物）為基質(zhì)做添加試驗(yàn)。待測(cè)物菰米樣品與基質(zhì)按質(zhì)量比例（100%、10%、1%、0.1%、0.01%）進(jìn)行混合，提取不同濃度混合樣品DNA，作為靈敏度檢測(cè)模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

菰米基因組DNA梯度稀釋至質(zhì)量濃度為10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、0.1 pg/μL，進(jìn)行靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)。

1.2.7 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn) 菰米基因組DNA梯度稀釋至質(zhì)量濃度為10、1、0.1 ng/μL，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，每個(gè)樣品3個(gè)平行，以不同濃度基因組DNA獲得的Ct值計(jì)算其平均數(shù)和變異系數(shù)，進(jìn)行重復(fù)性和穩(wěn)定性分析。

1.2.8 市售樣品的檢測(cè)試驗(yàn) 購(gòu)置市售的進(jìn)口菰米80份，菰米碎米5份，雜糧米10份，混合米粉5份，檢測(cè)其是否含有菰米成分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。利用QS6實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀自帶的軟件分析擴(kuò)增曲線和 Ct 值。利用 Microsoft Excel 2016 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品真實(shí)性鑒定

利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)收集到的近源谷物樣品進(jìn)行真實(shí)性和準(zhǔn)確性鑒定，結(jié)果如圖1和表2所示。本研究收集到的樣品序列和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)相似度達(dá)99.9%。

表2 菰米和近源谷物樣品名稱及測(cè)序結(jié)果Table 2 Name and sequencing results of wild rice and near source grain samples

圖1 菰米和近源谷物的分子進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Evolutionary tree of wild rice and near source grain samples

2.2 真核生物18S rRNA通用引物檢測(cè)結(jié)果

用真核生物18S rRNA通用引物擴(kuò)增本試驗(yàn)所提取的所有樣品DNA溶液，所有樣品DNA溶液均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值范圍在15.26～24.85之間，說(shuō)明所有用于菰米成分特異性檢測(cè)的DNA樣品均適用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)（圖2）。

圖2 菰米和其他樣品18S rRNA基因檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of 18S rRNA gene in wild rice and other materials

2.3 菰米成分實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)

檢測(cè)收集到的4個(gè)菰米物種樣品：中國(guó)菰（）、水生菰（）、沼生菰（）、德克薩斯菰（），以大米等其他谷物以及大豆、鱈魚(yú)等異源性動(dòng)植物基因組DNA作為陰性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，檢測(cè)引物和探針的特異性。結(jié)果顯示，4個(gè)菰米物種樣品均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，大米等其他谷物以及異源性動(dòng)植物基因組DNA（圖3）均無(wú)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果，不同物種之間沒(méi)有交叉反應(yīng)，說(shuō)明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法具有很好的特異性。

圖3 菰米的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Specific detection results of wild rice by real-time PCR

2.4 菰米成分實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度檢測(cè)

菰米樣品和鱈魚(yú)粉樣品按質(zhì)量比例（100%、10%、1%、0.1%、0.01%）進(jìn)行混合，提取不同濃度混合樣品DNA，作為靈敏度檢測(cè)模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示，菰米檢測(cè)方法的靈敏度可穩(wěn)定達(dá)到0.01%（W/W）。

圖4 模擬添加鱈魚(yú)粉靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Sensitivity test results of simulated added Gadus macrocephalus powder

菰米樣品和易混谷物（大米、黑米和黑麥混合物）基質(zhì)按質(zhì)量比例（100%、10%、1%、0.1%、0.01%）進(jìn)行混合，提取不同濃度混合樣品DNA，作為靈敏度檢測(cè)模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示如圖5所示，菰米檢測(cè)方法的靈敏度可穩(wěn)定達(dá)到0.01%（W/W）。

圖5 模擬添加易混谷物靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Sensitivity test results of simulated mixed grains

以 1 μL濃度范圍在 10～0.0001 ng/μL之間菰米基因組DNA為模板，進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)體系中模板量為0.001 ng時(shí)，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，該方法的最低檢出限為0.001 ng基因組DNA（圖6）。

圖6 不同DNA濃度靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Sensitivity test results of different DNA concentrations

2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

以 1 μL 濃度分別為 10、1、0.1 ng/μL 的菰米基因組DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，以不同濃度基因組DNA獲得的Ct值計(jì)算其平均數(shù)和變異系數(shù)，進(jìn)行重復(fù)性和穩(wěn)定性分析。結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)在0.42%～0.84%，批間變異系數(shù)在1.74%～2.91%（表3），說(shuō)明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表3 菰米實(shí)時(shí)熒光PCR重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)分析Table 3 Repeatability and stability of real-time PCR for wild rice detection

2.6 菰米成分實(shí)時(shí)熒光PCR法實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)

對(duì)市售的進(jìn)口菰米、菰米碎米以及不含菰米成分的雜糧米和混合米粉等100份樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中菰米樣品均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，均為陽(yáng)性結(jié)果；不含菰米成分的雜糧米和混合米粉樣品均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，為陰性結(jié)果（表4），檢測(cè)結(jié)果與商品標(biāo)識(shí)一致。由大量的實(shí)際應(yīng)用結(jié)果可見(jiàn)，本方法檢測(cè)食品中菰米成分具有很好的適用性。

表4 市售菰米商品檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of commercial wild rice

3 結(jié)論

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為食品安全檢測(cè)的重要工具，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)、動(dòng)植物源性成分檢測(cè)、高經(jīng)濟(jì)價(jià)值農(nóng)產(chǎn)品摻雜鑒偽、食源性致病菌檢測(cè)等領(lǐng)域。本研究以菰米ITS基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)，建立了菰米成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，通過(guò)分析菰米樣品及其他谷物和異源性動(dòng)植物樣品的擴(kuò)增結(jié)果、分析異源性基質(zhì)（鱈魚(yú)粉）以及易混谷物基質(zhì)（大米、黑米和黑麥混合物）與菰米梯度混合后實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的靈敏度、分析菰米基因組DNA濃度梯度實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的靈敏度、測(cè)試菰米實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性，驗(yàn)證了本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，與對(duì)照組無(wú)交叉反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度為0.001 ng/μL菰米基因組DNA或0.01%（W/W）的菰米粉，可快速高效地進(jìn)行菰米成分的定性檢測(cè)，為出入境商品中菰米的真實(shí)性甄別以及菰米成分檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化提供技術(shù)支撐。本方法的建立將填補(bǔ)我國(guó)菰米檢測(cè)的空白，對(duì)促進(jìn)我國(guó)菰米產(chǎn)業(yè)及進(jìn)出口貿(mào)易的穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。