不同工藝即食烤魚多環(huán)芳烴檢測方法及變化研究

張 艷，王圣開，程 燕，肖躍華，付 勛，馮婷婷

（1.重慶三峽職業(yè)學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，重慶 404155；

2.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000）

烤魚是重慶三峽庫區(qū)的特色美食，因其口味奇絕、營養(yǎng)豐富深受消費者喜愛?？爵~多元化發(fā)展過程中，即食型烤魚產(chǎn)品工藝的開發(fā)打破了烤魚現(xiàn)場烤制、現(xiàn)場消費的局限性，有利于烤魚市場的拓展?？爵~富含蛋白質(zhì)、脂肪，在加工過程中產(chǎn)生多環(huán)芳烴等物質(zhì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs），具有兩個或兩個以上苯環(huán)和稠環(huán)的有機污染物。PAHs具有致癌性、誘變性和致畸性。已證實，人群PAHs的攝入量與乳腺癌、皮膚癌、肺癌等的發(fā)生有相關(guān)性。此外，PAHs還可能引發(fā)糖尿病、心血管疾病等，PAHs在多個國家成為重要的安全監(jiān)測指標。美國環(huán)境保護署（EPA）根據(jù)環(huán)境中PAHs 的發(fā)生和致癌性選擇了16種優(yōu)先監(jiān)測的PAHs，簡稱 EPA16。歐盟食品安全局（EFSA）規(guī)定，熏烤肉類和熏烤水產(chǎn)品中苯并[a]芘的含量不得大于 2 μg/kg，4 種 PAH（苯并 [a]蒽、苯并 [b]熒蒽、苯并[a]芘和?）含量之和不得大于12 μg/kg。我國國家標準GB 2762-2017規(guī)定，熏、燒、烤肉類和熏、烤水產(chǎn)品中苯并[a]芘的含量不得大于5 μg/kg。

食品中PAHs主要來源于自然界天然存在、環(huán)境污染及食品加工過程等。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對于PAHs的研究報道較多，主要集中在土壤、食品及接觸材料安全性評價、食品中PAHs檢測方法優(yōu)化及食品加工中PAHs的影響因素研究等方面。已證實食品中PAHs的生成量與加工方式、加熱條件、抗氧化劑及脂質(zhì)等因素有關(guān)，F(xiàn)arhadian等發(fā)現(xiàn)木炭、煤氣和烤箱三種燒烤方式中，烤箱烤雞中PAHs 含量最低為3.51 μg/kg；油菜籽中PAHs含量隨焙炒溫度和時間的增加，PAHs含量呈上升趨勢；脂質(zhì)的不飽和程度越高，PAHs的形成也越多；抗氧化劑對肉制品中PAHs的形成有抑制作用。綜上所述，食品中PAHs的研究報道較多，但對不同工藝即食烤魚PAHs的變化研究報道較少。本研究采用固相萃取/高效液相色譜-熒光/紫外法（Online-SPE/HPLC-RF/SPD）進行即食烤魚中EPA16的檢測方法驗證，對比傳統(tǒng)碳烤、油炸、電烤三種熟化方式下即食烤魚中EPA16種類和含量的差異，分析不同工藝參數(shù)對EPA16含量的影響，以期為即食烤魚安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烤魚片 實驗室自制；乙腈、正己烷、二氯甲烷色譜純，上海申博化工有限公司；MIP-PAHs專用SPE 小柱（1 g，10 mL）、微孔有機濾膜（0.22 μm）迪馬科技有限公司；PAHs混合標準品（EPA16：萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并[a]蒽、?、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽和苯并[g,h,i]苝、茚并[1,2,3-c,d]芘） 北京曼哈格生物科技有限公司。

LC-20A高效液相色譜儀（帶熒光/紫外檢測器）日本島津公司；AE2202天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；IKA MS3漩渦振蕩儀 德國海道爾夫有限公司；GM200刀式混合研磨儀 德國Retsch公司；TurboVap 500氮吹儀 德國 Biotage公司；KH-2000DB超聲波振蕩器 昆山市超聲儀器有限公司；25型油水混合油炸鍋 瑞安市食品機械總廠；YXD-90C電烤箱 廣州市賽思達機械設(shè)備有限公司；實驗室常規(guī)玻璃儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 混標儲備溶液：將 16種PAHs混合標準液（200 μg/mL）用乙腈稀釋定容配制成1000 ng/mL的混合標準儲備溶液。再稀釋成1、5、10、20、50、100、200 ng/mL 的系列標準工作液。

1.2.2 樣品制備及預(yù)處理

1.2.2.1 工藝流程 鮮草魚→預(yù)處理（魚肉切分成約2 cm厚的魚片）→腌制（0.5%濃度的復(fù)合磷酸鹽、6%濃度的食鹽腌制液及少許香辛料中腌制20 min）→熟化→拌料翻炒→真空包裝→高壓殺菌→冷卻→產(chǎn)品

1.2.2.2 樣品制備 不同熟化方式樣品：腌制后的魚片瀝干水后，實驗分成6組。分別采用傳統(tǒng)炭火烤制（5 min）、油炸（250 ℃，5 min）、電烤（250 ℃，5 min）熟化烤魚，至色澤金黃，得到烤魚片。3組樣品以不加調(diào)味料為對照，將另3組烤魚片按相同比例加入相同的麻辣調(diào)味料進行翻炒至香，冷卻后真空包裝。

油炸樣品：腌制后的魚片瀝干水后，實驗分成8組。4組樣品在 200 ℃下分別油炸 4、6、8和 10 min；4組樣品在180、200、220、240 ℃ 下分別油炸6 min，放入濾網(wǎng)中瀝干明油，得到烤魚片，拌料翻炒至香，冷卻后真空包裝。

電烤樣品：腌制后的魚片瀝干水后，實驗分成8組。4組樣品在 200 ℃ 分別電烤 4、6、8、10 min；4組樣品在180、200、220、240 ℃下分別電烤6 min，得到烤魚片，拌料翻炒至香，冷卻后真空包裝。

1.2.2.3 樣品預(yù)處理 稱取2.00 g試樣于50 mL離心管中，分別加入10 mL正己烷提取2次，合并兩次上清液，氮吹至3～5 mL，待凈化。移取待凈化液到已活化SPE小柱上，準確加入6 mL正己烷淋洗小柱，并棄去流出液，加入10 mL二氯甲烷洗脫并收集洗脫液，將洗脫液于30 ℃水浴中用氮氣緩緩吹至近干。吸取1 mL乙腈復(fù)溶混勻，過0.22 μm濾膜，待測。

1.2.3 儀器分析條件 色譜柱：Waters PAHs C柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測器：熒光/紫外檢測器（因苊烯沒有熒光性，采用紫外檢測器，其余15種PAHs采用熒光檢測器）；柱溫：30 ℃，進樣盤溫度30 ℃，進樣量 20 μL；流動相：乙腈和水；流速：1.5 mL/min。梯度洗脫程序、激發(fā)和發(fā)射波長、紫外波長見表1。

表1 流動相梯度洗脫、PAHs切換色譜時間及檢測波長參數(shù)Table 1 Parameters of mobile phase gradient elution, PAHs switching chromatography time and detection wavelength

1.2.4 準確度和精密度實驗 將1000 ng/mL的標準儲備溶液稀釋至200 ng/mL，為加標工作液。稱取碳烤樣品 2.00 g，分別加入 50、100、150 μL 加標液，按1.2.2.3處理后，上機測定。做3個平行加標試驗，計算加標回收率及相對標準偏差。

1.2.5 PAHs食用風(fēng)險評價 以苯并[a]芘（BaP）為標準參考物，其毒性當量因子（Toxic equivalency factors，TEF）為1，各個單體的BaP的毒性當量因子和濃度計算相當于BaP毒性等效濃度（TEQ），計算公式為:

式中：C為第 i種 PAHs的質(zhì)量濃度；TEF為第i個PAHs對應(yīng)的TEF。

本研究采用終生致癌風(fēng)險（Incremental lifetime cancer risk，ILCR）為度量指標，評價烤魚中PAHs對人體的致癌風(fēng)險，計算公式為：

式中：DR為每天的烤肉攝入量，根據(jù)調(diào)查統(tǒng)計烤魚人均消費量為0.5 kg/d；CSF為苯并[a]芘的致癌斜率系數(shù)，其值為7.3 mg/kg·d；EF為暴露頻率，d/y；ED為暴露年數(shù)，其值為70年；BW為體重，取70 kg；AT為預(yù)期壽命，70年。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 16種PAHs檢測方法建立

按1.2.1配制標準溶液，在上述色譜條件下進行16種PAHs測定，根據(jù)3倍信噪比計算16種PAHs的檢出限，結(jié)果見表2。在1～200 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，校正曲線相關(guān)系數(shù)在0.9993～0.9998之間，根據(jù)3倍信噪比（S/N）確定16種PAHs的檢出限范圍為0.20～2.50 μg/kg。16 種 PAHs的樣品加標回收率為64.25%～122.80%，RSD值范圍為 1.38%～7.13%，滿足分析檢測要求。

表2 16種PAHs的相關(guān)系數(shù)、檢出限、準確度和精密度結(jié)果Table 2 Correlation coefficient, detection limit, accuracy and precision test results of 16 PAHs

2.2 不同熟化方式對即食烤魚中多環(huán)芳烴的影響

圖1、圖2 是采用碳烤（5 min）、油炸（250 ℃，5 min）、電烤（250 ℃，5 min）三種熟化方式下，以不添加調(diào)味料為對照（碳烤K、油炸K、電烤K），共6組即食烤魚中PAHs種類和含量比較。從6組樣品PAHs的檢出種類分析，主要檢出種類為萘、苊烯、芴、菲、芘等輕質(zhì) PAHs（2～4 個環(huán)），16 種 PAHs中，苊、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝和茚并[1,2,3-c,d]芘在6組樣品中均未檢出。碳烤樣品中檢測出PAHs種類最多，為12種，其次為油炸樣品，檢出9種，電烤樣品最少，檢出8種。

圖1 不同熟化方式烤魚中PAHs含量Fig.1 PAHs content in roasted fish with different cooking methods

圖2 不同熟化方式烤魚中PAHs總量和PAH4含量Fig.2 Total PAHs and PAH4 contents in roasted fish with different cooking methods

從樣品中PAHs的含量分析，碳烤、油炸和電烤三組樣品中，PAHs總量、單個PAHs含量及PAH含量均比對照樣品（碳烤K、油炸K，電烤K）略低，這可能是因為調(diào)味料一定程度上抑制了烤魚中脂肪的氧化，從而降低了PAHs的生成量。檢出的PAHs中，輕質(zhì)PAHs含量高，其中萘、苊烯、菲和芘檢出含量較高。碳烤樣品中苊烯、萘檢出值分別高達 25.87 和 17.35 μg/kg，PAHs 總量高達 58.74 μg/kg，PAH（苯并 [a]蒽、 ? 、苯并 [b]熒蒽、苯并 [a]芘）為1.52 μg/kg，明顯高于油炸和電烤樣品組；其次是油炸組，PAHs 總量為 36.24 μg/kg，PAH為 0.809 μg/kg；電烤樣品 PAHs總量最低，為 21.71 μg/kg，PAH為0.350 μg/kg。這與Badry提出采用炭火直接烤制對食品中PAHs生成的影響更顯著的研究結(jié)果相符。油炸樣品PAHs檢出種類及總量均高于電烤樣品組，這可能是因為油炸組不飽和脂質(zhì)含量高，更易氧化，PAHs的生成量增加。其中我國PAHs重要標志物苯并[a]芘在碳烤和油炸樣品中檢出，均低于國家限量值（5 μg/kg），但烤魚中 PAHs安全性有待進一步進行食用風(fēng)險評估。

2.3 不同油炸工藝對即食烤魚PAHs的影響

2.3.1 不同油炸時間對PAHs的影響 將魚片在200 ℃下分別油炸4、6、8和10 min后，其PAHs含量見表3。由表3可知，油炸4、6 min的兩組樣品均測出8種PAHs，分別為萘、苊烯、芴、菲、蒽、熒蒽、芘和苯并[b]熒蒽；油炸8、10 min的兩組樣品檢測出上述8種PAHs外，還測出苯并[a]芘。苊烯、熒蒽在油炸 8 min 時含量最高，分別為 5.850、2.650 μg/kg，隨著油炸時間的延長，大部分PAHs含量呈顯著升高趨勢（＜0.05），當油炸6 min時，PAHs含量較油炸4 min樣品變化不明顯，但當油炸到8 min時，各PAHs含量增加顯著（＜0.05），油炸到10 min 時，PAHs總量由18.568 μg/kg 升到 27.083 μg/kg，PAH由 0.252 μg/kg升到0.827 μg/kg。由此得出，油炸溫度相同時，油炸時間長，PAHs種類及含量均增加，油炸6 min后，增加趨勢加快，這可能是因為油炸6 min后，烤魚含水量下降較快，烤魚脂肪發(fā)生氧化生成過氧化物進一步內(nèi)環(huán)化形成PAHs。

2.3.2 不同油炸溫度對PAHs的影響 將魚片在180、200、220、240 ℃下分別油炸 6 min，其 PAHs含量變化見表4。由表4可知：180 ℃油炸樣品檢出6種，均為輕質(zhì)PAHs；200 ℃油炸樣品檢出PAHs 8種；220、240 ℃油炸樣品檢出9種，較180 ℃油炸樣品增加苯并[b]熒蒽和苯并[a]芘兩種重質(zhì)PAHs。從含量分析，除芴以外，其余檢出PAHs隨油炸溫度升高顯著增加（＜0.05），其中含量較高的有萘、苊烯、菲、熒蒽和芘；萘、熒蒽和芘含量增加約5倍，菲含量增加約3倍。PAHs總量和PAH亦隨著溫度升高呈增加趨勢，當油炸溫度為240 ℃時，PAHs總量高達34.27 μg/kg，約為180 ℃油炸樣品的3倍。由此得出，相同油炸時間下，油炸溫度越高，PAHs含量越高，重質(zhì)PAHs（5環(huán)及以上）如苯并[b]熒蒽、苯并[a]芘檢出率增大。

表4 不同油炸溫度下即食烤魚PAHs的測定值（μg/kg）Table 4 Determination results of PAHs in instant roasted fish at different frying temperatures (μg/kg)

由表3、4得出：油炸時間越長、溫度越高，PAHs種類增多，PAHs和PAH總量越高。油炸溫度和時間對PAHs影響分析比較，油炸時間對PAHs總量的影響較溫度對PAHs影響小，這與Lee等研究結(jié)果相符。

表3 不同油炸時間即食烤魚PAHs的測定值（μg/kg）Table 3 Determination results of PAHs in instant roasted fish at different frying times (μg/kg)

2.4 不同電烤工藝對即食烤魚PAHs的影響

2.4.1 不同電烤時間對PAHs的影響 魚片在200 ℃電烤 4、6、8、10 min，4組樣品 PAHs變化見表5。電烤4、6 min兩組樣品檢出6種PAHs，均為輕質(zhì)PAHs；電烤8、10 min的兩組樣品檢測出上述6種PAHs外，還測出苯并[a]芘。從含量分析，檢出的萘、苊烯、菲含量較高，菲在6 min樣品檢出量最高達4.041 μg/kg；隨電烤時間延長，各檢出PAHs含量整體顯著增加（＜0.05），其中苊烯增幅最大，電烤10 min樣品苊烯含量約為4 min的4倍。PAHs總量隨電烤時間亦呈明顯增加，電烤4、6 min兩組樣品PAH未檢出。

2.4.2 不同電烤溫度對PAHs的影響 將魚片在180、200、220、240 ℃ 下分別電烤 6 min，其 PAHs含量變化見表6。由表6可見，180、200 ℃電烤樣品檢出PAHs 6種，未檢出PAH；隨電烤溫度升高，220、240 ℃電烤兩組樣品檢測出上述6種PAHs外，還檢出蒽、苯并[b]熒蒽和苯并[a]芘。除菲、芘、苯并[a]芘外，其余檢出的PAHs均隨電烤溫度升高顯著增高（＜0.05），其中苊烯增幅約達5倍。PAHs總量從 12.200 μg/kg 增至 25.023 μg/kg，PAH量從未檢出增至0.651 μg/kg。

表6 不同電烤溫度即食烤魚PAHs的測定值（μg/kg）Table 6 Determination results of PAHs in instant roasted fish at different electric roasting temperatures (μg/kg)

由表5、6得出，電烤時間和溫度越高，PAHs種類增多，PAHs總量越高。電烤180～200 ℃、時間4～6 min PAH未檢出。

表5 不同電烤時間即食烤魚PAHs的測定值（μg/kg）Table 5 Determination results of PAHs in instant roasted fish at different electric roasting times (μg/kg)

2.5 烤魚食用風(fēng)險評估

通過不同加工處理后烤魚中PAHs的ILCR計算，結(jié)果見表7。由表7可知，攝入頻率、熟化方式、加熱時間和溫度均對患癌風(fēng)險有影響。所有處理組在攝入烤魚頻率為每月1次（12 d/y）時，ILCR均低于1.0×10（USEPA提出 ILCR的可接受標準值），理論上對人體的致癌風(fēng)險可以忽略；碳烤烤魚、油炸和電烤烤魚（溫度200 ℃，時間8 min以上）、電烤烤魚（溫度200 ℃，時間8 min以上或溫度220 ℃，時間6 min以上），攝入烤魚頻率大于每月2次（24 d/y）時，ILCR值在10～10之間，具有潛在的致癌風(fēng)險。因此，從評價模型中可得出，油炸或電烤烤魚加熱時間控制6 min，溫度200 ℃以內(nèi)，攝入烤魚頻率小于每月2次，患癌風(fēng)險低。

表7 不同工藝烤魚在人群不同暴露頻率的致癌風(fēng)險評價Table 7 Carcinogenic risk assessment of roasted fish with different processes in different exposure frequencies

3 結(jié)論

本文利用高效液相色譜法測定即食烤魚中的PAHs含量，16種PAHs相關(guān)系數(shù)在0.9993～0.9998之間，檢出限范圍為 0.20～2.50 μg/kg；加標回收率64.25%～122.80%，RSD值為 1.38%～7.13%，滿足檢測要求。以不添加調(diào)味料烤魚為對照，碳烤、油炸、電烤三種不同熟化工藝對PAHs種類和含量的影響為碳烤＞油炸＞電烤，其中，萘、苊烯、菲和芘檢出含量較高，添加調(diào)味料的烤魚樣品中PAHs生成量較對照組低。熟化時間和溫度對PAHs種類和含量有影響，油炸時間6 min后，隨著油炸時間增長、油炸溫度增高，PAHs檢出種類和PAHs含量顯著增加，PAH亦越高；油炸溫度對PAHs種類和含量影響較油炸時間大，其中檢出的萘、苊烯、菲、熒蒽和芘含量較高，重質(zhì)PAHs檢出率越高。電烤時間和溫度越高，PAHs種類增多，PAHs總量越高。萘、苊烯含量隨電烤時間和溫度增幅最大，其中電烤180～200 ℃、時間4～6 min PAH未檢出。以終生致癌風(fēng)險為指標，進行烤魚食用風(fēng)險評估，控制烤魚工藝（200 ℃，6min）和攝入頻率（＜2次/月），患癌風(fēng)險可忽略不計。

檢測樣品中苯并[a]芘和PAH含量均低于我國國家標準（GB 2762-2017）和歐盟標準，但多個樣品中輕質(zhì)PAHs含量高，輕質(zhì)PAHs不穩(wěn)定，容易向重質(zhì)PAHs轉(zhuǎn)化。在后期工作中著力于即食烤魚包裝、貯藏過程中動態(tài)監(jiān)測PAHs含量的變化，確保即食烤魚質(zhì)量安全。