基于近紅外光譜的酸棗仁不同偽品摻假檢測

趙 昕，劉 鑫，王韻彭，趙志磊,4, ，王獻(xiàn)友, ，王庭欣，劉孟琛

（1.河北大學(xué)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院，河北保定 071002；2.計(jì)量儀器與系統(tǒng)國家地方聯(lián)合工程研究中心，河北保定 071002；3.河北省能源計(jì)量與安全檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002；

4.河北大學(xué)地理標(biāo)志研究院，河北保定 071002）

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Mill.var（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子。酸棗仁主要含有黃酮、皂苷、生物堿等物質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁、降血糖、抗癡呆、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)等藥用功效。酸棗仁主要分布于我國東北、華北、西北以及南方等部分地區(qū)。其中河北邢臺(tái)所產(chǎn)的邢棗仁量大質(zhì)優(yōu)，為全國聞名的道地藥材。酸棗仁作為我國傳統(tǒng)常用中藥材，應(yīng)用歷史悠久，遠(yuǎn)銷海內(nèi)外。然而由于酸棗仁的形似易混淆品較多，不法商販為牟取暴利摻入混偽品，使得市售酸棗仁價(jià)格與質(zhì)量參差不齊，摻雜摻假現(xiàn)象嚴(yán)重。摻偽酸棗仁藥材直接影響藥用效果及消費(fèi)者和藥材廠商的經(jīng)濟(jì)利益，含毒或相悖藥性偽品甚至危及生命健康，因此開展酸棗仁偽品的快速檢測技術(shù)具有重要意義。

常用的中藥材真?zhèn)螜z測技術(shù)有薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法等。以上方法雖然檢測精度較高，但實(shí)驗(yàn)過程繁復(fù)，需要專業(yè)操作人員，儀器成本高，檢測耗時(shí)長，不利于實(shí)際中的市場推廣應(yīng)用。近紅外光譜技術(shù)基于被測物質(zhì)中含氫基團(tuán)的振動(dòng)吸收光譜特征，具有無損、快速和環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，便于在現(xiàn)代化高通量加工生產(chǎn)環(huán)境中實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測。目前已廣泛應(yīng)用于糧油、果蔬、肉類和乳制品等多種農(nóng)產(chǎn)品和食品的質(zhì)量檢測中。Li等基于近紅外光譜結(jié)合偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）算法，成功地對(duì)兩種外觀相似的藏紅花混偽品（蓮花雄蕊和玉米柱頭）進(jìn)行了快速鑒別和定量分析。Chen等采用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）類建模方法和基于浮雕的變量選擇方法，實(shí)現(xiàn)了三七粉摻假（苦參粉和玉米粉）的非目標(biāo)鑒別。以上研究表明近紅外光譜技術(shù)可以用于中藥材真?zhèn)舞b別和摻假檢測。

目前，有關(guān)酸棗仁摻偽檢測的研究較少。申晨曦等基于氫核磁共振與偏最小二乘法對(duì)酸棗仁及其摻偽品進(jìn)行了鑒別。劉紅玉和張悅綜述了鑒別酸棗仁與偽品理?xiàng)椚实氖N檢測方法，包括性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、薄層色譜、紫外光譜、紅外光譜、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、高效毛細(xì)管電泳法、超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem quadrupole-time of flightmass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）鑒別和 DNA指紋圖譜鑒別?；诮t外光譜技術(shù)檢測酸棗仁真?zhèn)蔚难芯可形匆妶?bào)道。綜上所述，本文針對(duì)酸棗仁摻假質(zhì)量問題，具體選取了其市場上常見的不同偽品理?xiàng)椚?、枳椇子和兵豆，利用近紅外光譜技術(shù)開發(fā)一種酸棗仁摻偽的快速檢測方法，為后續(xù)便攜式或在線檢測儀器開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁及偽品理?xiàng)椚?、枳椇子和兵?購買于河北安國中藥材市場遠(yuǎn)光藥業(yè)有限公司。

MPA型傅里葉變換近紅外光譜儀 德國布魯克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 使用一號(hào)篩（10目）去除樣品顆粒中的雜質(zhì)以及不完整顆粒；分別制備摻入單種偽品的酸棗仁摻假樣品，摻入的偽品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。對(duì)摻假樣品進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，使酸棗仁和偽品混合均勻。共制備酸棗仁摻假樣?0種（3類偽品×10個(gè)摻假質(zhì)量分?jǐn)?shù)），以及酸棗仁和3類偽品純樣品4種。同時(shí)摻入理?xiàng)椚省㈣讞鹤雍捅怪苽浜卸喾N摻雜物的酸棗仁樣品，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比見表1。

表1 包含多種摻假物的酸棗仁樣品的配比Table 1 The proportioning of Ziziphi Spinosae Semen with multiple adulterants

1.2.2 光譜采集 實(shí)驗(yàn)采用MPA型傅里葉變換近紅外光譜儀，使用積分球漫反射模式采集光譜數(shù)據(jù)。室溫下，每次測量時(shí)取20 g樣品放入樣品杯中。設(shè)置光譜采集范圍為 12500～4000 cm（800～2500 nm），光譜分辨率為16 cm，掃描次數(shù)為64次。每種類型樣品采集20條光譜，共獲得680條（20條光譜×34種摻假樣品）光譜數(shù)據(jù)。

1.2.3 主成分分析 主成分分析（principal component analysis，PCA）是光譜分析中常用到的無監(jiān)督數(shù)據(jù)降維算法。通過正交變換降維處理將具有線性相關(guān)性的多個(gè)光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為一組數(shù)量較少的新變量，可以在不丟失重要光譜信息的情況下，分離具有特征差異的數(shù)據(jù)。為了對(duì)酸棗仁和三種偽品之間的差異性進(jìn)行初步分析，對(duì)4種純樣品的光譜數(shù)據(jù)應(yīng)用了PCA變換。

1.2.4 光譜預(yù)處理 為了消除基線漂移和噪聲，提高模型預(yù)測性能，采用了歸一化（normalize，NOR）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量（standard normal variate，SNV）、移動(dòng)平均平滑（moving average smoothing，MAS）、SG 平滑（Savitzky-Golay smoothing，SGS）和 SG 一階導(dǎo)數(shù)（Savitzky-Golay first-order derivative，SGD1）五種預(yù)處理方法，并進(jìn)行了對(duì)比分析。

1.2.5 偏最小二乘回歸模型建立與評(píng)價(jià) 偏最小二乘回歸方法（partial least squares regression，PLSR）是一種應(yīng)用廣泛的線性光譜數(shù)據(jù)定量分析建模方法，綜合了主成分分析、典型相關(guān)分析和多元線性回歸3種方法的優(yōu)點(diǎn)，可以有效解決建模時(shí)變量間的多重相關(guān)性等問題。偏最小二乘回歸中有兩種建模方法，分別是PLS1和PLS2。PLS1方法單獨(dú)校準(zhǔn)開發(fā)每一個(gè)屬性的預(yù)測模型，PLS2建立一個(gè)同時(shí)校準(zhǔn)所有屬性的模型。在本文中，PLS1和PLS2分別用于建立單摻雜樣品和多摻雜樣品的定量模型。

根據(jù)決定系數(shù)（）、校正均方根誤差（RMSEC）、交叉驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）、預(yù)測均方根誤差（RMSEP）和偏差（Bias）來評(píng)價(jià)所建模型的性能。數(shù)值越大且越趨于1，RMSE數(shù)值越小且趨于0，則模型效果越好?；诓煌A(yù)處理后的數(shù)據(jù)，建立偏最小二乘回歸模型。每種類型樣品的20條光譜按照隨機(jī)劃分原則，14條光譜組成校正集，6條光譜組成預(yù)測集。

1.2.6 連續(xù)投影算法 連續(xù)投影算法（successive projection algorithm，SPA）是一種迭代正向選擇方法，常用于多變量建模中的特征變量選擇。它采用選擇共線性最小變量的投影運(yùn)算以從復(fù)雜的光譜數(shù)據(jù)中提取有效信息，可以大大減少建模所需變量數(shù)，提高建模效率。為了進(jìn)一步優(yōu)化預(yù)測模型，提高模型實(shí)用性和魯棒性，本文采用SPA算法挑選建模最優(yōu)波長變量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

光譜采集由OPUS軟件實(shí)現(xiàn)，光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理及PLS建模在The Unscrambler X 9.7中進(jìn)行，其余算法在Matlab R2013b中實(shí)現(xiàn)。圖片采用Origin 2018繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始光譜分析

觀察獲得的原始吸收光譜曲線，發(fā)現(xiàn)800～1062 nm波長范圍內(nèi)譜線數(shù)據(jù)存在較大噪聲，且整體吸光度值較低，無明顯吸收峰，因此截取1063～2503 nm波長范圍數(shù)據(jù)用于后續(xù)的處理與分析。酸棗仁及其摻假樣品波長截取后的原始光譜如圖1所示。從原始光譜曲線上無法直接對(duì)酸棗仁及偽品進(jìn)行鑒別區(qū)分，需要借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法作進(jìn)一步分析處理。

圖1 原始光譜Fig.1 Original spectra

酸棗仁及偽品理?xiàng)椚?、枳椇子和兵豆的平均吸收光譜及誤差帶如圖2所示。由圖可知，酸棗仁及3種偽品的原始吸收光譜曲線整體輪廓形狀相似，吸光度值及其變化程度存在差異。酸棗仁及三種偽品在1063～2503 nm波長范圍內(nèi)均具有4個(gè)明顯的吸收峰，其波段范圍分別為1111～1265 nm、1370～1556 nm、1854～1984 nm 和 2022～2200 nm。在 1111～1265 nm范圍內(nèi)，理?xiàng)椚试?200 nm處有一個(gè)單獨(dú)的波峰，可能與脂肪或油中長鏈脂肪酸部分的CH基團(tuán)的第二泛音有關(guān)。酸棗仁、枳椇子和兵豆均在1210 nm處有一個(gè)吸收峰，且在1167 nm有一處小凸起，查閱相關(guān)文獻(xiàn)Woodcock等在橄欖油樣品的光譜分析中指出1211 nm和1168 nm 分別與CH和CH基團(tuán)中C-H鍵伸縮振動(dòng)的第二泛音有關(guān)。此外，同樣地Tigabu和Odén在火炬松種子近紅外光譜分析中指出1206 nm附近吸收峰與1170 nm附近的小凸起與CH，CH和CH=CH中C-H鍵的伸縮振動(dòng)的第二泛音有關(guān)，附近波長1180 nm也反映了含有順式雙鍵純脂肪酸（如油酸）中基本C-H鍵吸收的第二泛音。以上表明，1111～1265 nm內(nèi)吸收峰與酸棗仁及偽品內(nèi)的脂肪成分有關(guān)。在1370～1556 nm范圍內(nèi)，4種樣品在1460 nm處表現(xiàn)出一個(gè)主要的吸收峰，文獻(xiàn)表明該吸收峰與水有關(guān)。在1854～1984 nm范圍內(nèi)的1926 nm主要吸收峰與C=O鍵伸縮第二泛音，O-H伸縮和HOH變形的合頻，以及O-H鍵彎曲振動(dòng)第二泛音有關(guān)，主要反映蛋白質(zhì)、水和淀粉的吸收特性。在2022～2200 nm范圍內(nèi)，主要吸收峰位于2132 nm處，與氨基酸中NH和C=O鍵的伸縮振動(dòng)有關(guān)。以上表明，光譜數(shù)據(jù)中的主要吸收峰反映了樣品中脂肪、水、蛋白質(zhì)和淀粉等主要成分信息。然而目前譜線數(shù)據(jù)中存在基線漂移等噪聲，難以直接從數(shù)值大小上對(duì)酸棗仁及偽品進(jìn)行鑒別區(qū)分，需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步處理。

圖2 酸棗仁及三種偽品的平均光譜及誤差帶Fig.2 Average spectra and error bands of pure samples of Ziziphi Spinosae Semen and three kinds of counterfeits

2.2 PCA定性分析

為了初步判斷酸棗仁與三種偽品基于近紅外光譜數(shù)據(jù)的可分性，首先采用無監(jiān)督分類方法PCA對(duì)酸棗仁及3種偽品純樣品的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒別分析。酸棗仁及3種偽品在前2個(gè)主成分中的散點(diǎn)圖如圖3所示。第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的方差貢獻(xiàn)率分別為84.6%和15.0%。酸棗仁、理?xiàng)椚?、枳椇子和兵豆?shù)據(jù)點(diǎn)置信橢圓間沒有重疊區(qū)域，基于近紅外光譜數(shù)據(jù)可以較好地實(shí)現(xiàn)酸棗仁與理?xiàng)椚省㈣讞鹤雍捅沟蔫b別區(qū)分。

圖3 酸棗仁及三種偽品光譜數(shù)據(jù)在前2個(gè)主成分中的散點(diǎn)圖Fig.3 PCA scatter plot of PC1 vs.PC2 of the spectral data of Ziziphi Spinosae Semen and three kinds of counterfeits

2.3 光譜預(yù)處理及PLS1全波長模型

采用5種預(yù)處理方法對(duì)波段截取后的光譜進(jìn)行去噪處理，并建立相應(yīng)的PLS1模型，結(jié)果如表2所示。表2方法中NON表示光譜數(shù)據(jù)未經(jīng)預(yù)處理，用于不同預(yù)處理方法去噪效果的對(duì)比分析。三種摻假物不同預(yù)處理方法對(duì)應(yīng)的PLS1模型的決定系數(shù)均在0.94以上，其中理?xiàng)椚蕮郊贅悠纺Ｐ皖A(yù)測性能最佳，兵豆次之，枳椇子最差。然而從外形與紋理觀察，理?xiàng)椚逝c酸棗仁最相似，枳椇子次之，兵豆差別最大。造成以上成因可能是由于相比于酸棗仁，枳椇子與兵豆的密度較大，混合樣品制備時(shí)偽品分布較不均勻。理?xiàng)椚蕮郊贅悠分?，SGD1對(duì)應(yīng)模型的最大，且和相對(duì)較大，故選為最優(yōu)預(yù)處理方法；枳椇子摻假樣品中，SGS對(duì)應(yīng)模型的數(shù)值最大，且和相對(duì)較大，故選其為最優(yōu)預(yù)處理方法；兵豆摻假樣品中，SNV對(duì)應(yīng)模型的最大，且和相對(duì)較大，故選為最優(yōu)預(yù)處理方法。三種摻假樣品基于最優(yōu)預(yù)處理方法的全波長PLS1模型的預(yù)測集結(jié)果如圖4所示，理?xiàng)椚蕮郊贅悠穼?duì)應(yīng)模型的為0.9778，RMSEP為4.9891%，枳椇子摻假樣品對(duì)應(yīng)模型的為0.9585，RMSEP為6.8281%，兵豆摻假樣品對(duì)應(yīng)模型的為0.9722，RMSEP為5.8852%。圖5所示為經(jīng)過最佳預(yù)處理后酸棗仁與3種偽品純樣品的平均光譜曲線。

圖5 最優(yōu)預(yù)處理后的酸棗仁與3種偽品的平均光譜曲線Fig.5 Average spectral curves of Ziziphi Spinosae Semen and three kinds of counterfeits after the optimal pretreatments

表2 基于不同預(yù)處理方法的全光譜PLS1模型結(jié)果Table 2 PLS1 models based on full spectral data using different pretreatment methods

圖4 基于最優(yōu)預(yù)處理方法PLS1模型的預(yù)測集結(jié)果Fig.4 Prediction set results of the PLS1 models based on the optimal pretreatment methods

2.4 最優(yōu)波長選擇與PLS1多光譜模型

為了進(jìn)一步優(yōu)化預(yù)測模型，減少輸入變量，降低模型復(fù)雜度，節(jié)省計(jì)算時(shí)間，提高模型綜合性能。本文對(duì)最優(yōu)預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)應(yīng)用SPA算法挑選最優(yōu)建模波長。基于最優(yōu)波長建立的多光譜PLS1模型的預(yù)測結(jié)果如表3所示。通過對(duì)比建立的多光譜模型的知，兵豆摻假樣品所建模型的預(yù)測效果最好，理?xiàng)椚蕮郊贅悠反沃?，枳椇子摻假樣品效果較差，且三種模型≥0.9491，RMSEP≤7.6232%，Bias的絕對(duì)值≤1.4168%。三個(gè)模型預(yù)測集結(jié)果如圖6所示，模型均表現(xiàn)出了良好的預(yù)測能力。與全光譜模型相比，多光譜模型預(yù)測性能稍差，但輸入波長變量個(gè)數(shù)大大降低。實(shí)際生活中，不法分子為了牟取較高利潤，摻假含量一般較高。因此，所建模型具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值與意義。

圖6 基于最優(yōu)波長多光譜模型的預(yù)測集結(jié)果Fig.6 Prediction set results of multispectral models based on the optimal wavelengths

表3 基于 SPA算法所選最優(yōu)波長建立的多光譜模型的預(yù)測結(jié)果Table 3 The prediction result of the multispectral model based on the optimal wavelength selected by the SPA algorithm

對(duì)于理?xiàng)椚蕮郊贅悠?，選取了1137、1857 nm和2054 nm 3個(gè)最優(yōu)波長。對(duì)于枳椇子摻假樣品，選取了 1067、1106、1145、1273、1330、1915、1961和2503 nm共8個(gè)最優(yōu)波長。對(duì)于兵豆摻假樣品，選取了5個(gè)最優(yōu)波長，分別為1170、1198、1271、1345和1362 nm。理?xiàng)椚蕮郊贅悠纷顑?yōu)波長的分布較分散，枳椇子和兵豆摻假樣品的大部分最優(yōu)波長分布在1200 nm吸收峰附近，結(jié)合2.1節(jié)分析內(nèi)容，該吸收峰附近波長主要反映脂肪相關(guān)成分。研究表明，與酸棗仁相比，枳椇子和兵豆中的脂肪油成分含量較少（酸棗仁中脂肪油含量約為23.17%～29.25%，枳椇子中粗脂肪含量約為9.45%，兵豆脂肪含量約為1.1%）。理?xiàng)椚逝c酸棗仁具有相似的化學(xué)成分構(gòu)成。由于酸棗仁與偽品中成分含量不同，導(dǎo)致所采集的光譜產(chǎn)生差異，根據(jù)此特點(diǎn)利用近紅外光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)酸棗仁與其偽品的區(qū)分。

酸棗仁及其摻假樣品多光譜模型的預(yù)測集決定系數(shù)≥0.9491，表明所建立的回歸方程具有較好的擬合度。三種偽品摻假樣品多光譜PLS1模型回歸方程如下所示。

理?xiàng)椚蕮郊贅悠返幕貧w方程如下：

2.5 多種摻雜物的PLS2全波長模型

表4為不同預(yù)處理方法下的PLS2全波長模型預(yù)測結(jié)果。對(duì)比不同預(yù)處理方法，SGD1預(yù)處理后模型對(duì)四種成分預(yù)測的交叉驗(yàn)證決定系數(shù)最大，故SGD1為最優(yōu)預(yù)處理方法。對(duì)比SGD1對(duì)應(yīng)的模型對(duì)不同成分的預(yù)測效果，酸棗仁摻假樣品的為0.7840，RMSEP為5.7677%，理?xiàng)椚蕮郊贅悠返臑?.7784，RMSEP為4.8009%，枳椇子摻假樣品的為 0.2007，RMSEP為 4.3800%，兵豆摻假樣品的為0.4503，RMSEP為3.7806%。酸棗仁的定量預(yù)測效果最好，理?xiàng)椚屎捅勾沃?，枳椇子的預(yù)測效果最差。其原因可能是多種摻假物建模樣品中兵豆和枳椇子的含量相對(duì)較低，且枳椇子不同摻雜質(zhì)量分?jǐn)?shù)類型較少，導(dǎo)致建模樣品代表性較差。

表4 不同預(yù)處理方法下多摻雜物樣品的全光譜PLS2模型結(jié)果Table 4 Performance of the PLS2 models for multiple-adulterants samples using different pretreatment methods based on the full spectral range

3 結(jié)論

本文利用近紅外光譜技術(shù)研究了酸棗仁中常見3種偽品理?xiàng)椚?、枳椇子和兵豆摻假的定性定量檢測方法。PCA定性分析表明酸棗仁、理?xiàng)椚省㈣讞鹤雍捅沟慕t外光譜表現(xiàn)出不同的吸收特征，數(shù)據(jù)具有良好的可分性。分別對(duì)3種偽品摻假樣品建立了全波長PLS1模型進(jìn)行定量分析，預(yù)測集的決定系數(shù)≥0.9480，RMSEP≤8.0225%，Bias的絕對(duì)值≤2.6690%。采用SPA算法挑選最優(yōu)波長對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)于理?xiàng)椚蕮郊贅悠?、枳椇子摻假樣品和兵豆摻假樣品分別優(yōu)選了3個(gè)、8個(gè)和5個(gè)最優(yōu)波長，分別建立了對(duì)應(yīng)的多光譜PLS1模型。3類多光譜模型的預(yù)測集決定系數(shù)≥0.9491，RMSEP≤7.6232%，Bias的絕對(duì)值≤1.4168%。多光譜模型大大降低了建模輸入變量個(gè)數(shù)，有利于縮短計(jì)算時(shí)間，降低儀器開發(fā)成本。PLS1模型均表現(xiàn)出良好的預(yù)測性能，具有實(shí)際檢測應(yīng)用價(jià)值與意義。對(duì)于多摻雜物樣品的PLS2模型，酸棗仁的預(yù)測效果最好，≥0.7115，枳椇子預(yù)測效果最差，≥0.2007。在未來的研究中，多種摻雜物的定量檢測模型有待進(jìn)一步優(yōu)化。綜上，本文所研究方法為后續(xù)酸棗仁質(zhì)量在線或便攜式檢測儀器開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，也為種子類中藥材質(zhì)量的光學(xué)無損快檢方法研究提供參考依據(jù)。