大鯢黏液糖蛋白的提取工藝優(yōu)化及純化表征

唐嘉誠，包建強(qiáng),2,3, ，陳彥婕，單錢藝,4，黃可承，宮 萱

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306；4.上海市靜安區(qū)市場監(jiān)督管理局，上海 200072）

大鯢（）俗稱娃娃魚，是世界上現(xiàn)存最大的兩棲動(dòng)物，有著“活化石”的美譽(yù)。主要分布于我國湖南，貴州，陜西等地，為大型兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科。其肉質(zhì)細(xì)膩鮮美，具有較高的食用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值。大鯢軀干修長，側(cè)面多褶皺，肌肉發(fā)達(dá)，皮膚成灰色或灰褐色，其表皮分布有豐富的腺體結(jié)構(gòu)，在受到外界刺激時(shí)，能夠分泌出帶有特殊氣味的白色黏液，在加工過程中常被丟棄。多項(xiàng)研究表明，一些天然資源如草藥、植物蛋白、細(xì)菌分泌物等具有一定的抗菌和抗氧化活性。Seham等通過硫酸銨沉淀法提取非洲鯰魚的黏液糖蛋白（CFG），具有良好的抑菌作用。王慧陽等研究發(fā)現(xiàn)蝸牛黏液，具有一定抗氧化能力，并且能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，促進(jìn)免疫細(xì)胞因子釋放。大鯢黏液中富含黏液糖蛋白，具有一定的生物活性，因此對大鯢黏液的深化利用研究有助于提高大鯢加工副產(chǎn)物的利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。

糖蛋白是指具有多分支的寡糖鏈（一般為15～20個(gè)單糖單元）與多肽鏈以共價(jià)鍵相連而成的復(fù)合物，其含量以蛋白為主，糖蛋白在動(dòng)物、植物和微生物中廣泛存在，是生命活動(dòng)中一種重要大分子，有著抗氧化、抗菌、降血糖等生物活性功能。徐偉良通過提取純化大鯢黏液糖蛋白，證明其對于人肺癌細(xì)胞A549具有明顯的抑制作用。張金豫等通過水提醇沉法得到的大鯢黏液糖蛋白對·OH、DPPH·和O·都有一定的清除能力。但是對于大鯢黏液粗糖蛋白的提取工藝的優(yōu)化、純化表征鮮有報(bào)道。本文通過單因素實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面法優(yōu)化大鯢黏液粗糖蛋白的提取工藝，并對其進(jìn)行純化表征，以期為后續(xù)的大鯢黏液糖蛋白研究提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鯢黏液：中國浙江麗水養(yǎng)殖場提供大鯢活體，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行黏液收集并制備成凍干粉末供后續(xù)使用；DEAE-52纖維素 GE Healthcare公司；Sephadex-G100 北京索萊寶有限公司；MW:3500透析袋、Tris-HCl（pH7.4） 上海源葉生物科技有限公司；濃硫酸、無水乙醇、濃鹽酸、氯仿、正丁醇、氯化鈉 上海麥克林生化科技有限公司；上述試劑均為國產(chǎn)分析純。

DK-S28型精宏水浴鍋 上海坤權(quán)生物科技有限公司；H-1850R型臺式高速冷凍離心機(jī) 上海向帆儀器有限公司；SHIMADZU AUY220型電子分析天平 上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；Hitachi LA-8080氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；UV-1800PC分光光度計(jì) 上海精科儀器廠；傅里葉紅外光譜儀美國尼高力公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 堿法提取大鯢黏液粗糖蛋白的工藝流程 稱取一定量大鯢黏液凍干粉，以一定料液比加入一定濃度的NaOH溶液，在一定溫度和時(shí)間下水浴加熱提取，離心分離收集上清液，調(diào)節(jié)pH至7.0左右，加入預(yù)冷無水乙醇（4 ℃）至終濃度為80%，置于4 ℃冰箱中醇沉8 h，離心收集沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌2～3次，凍干成粉末。將粉末復(fù)溶于去離子水中加入 Sevag 試劑（正丁醇:氯仿=1:4，v/v），于冰水浴上攪拌15 min（250 r/min），去除游離蛋白。提取液3000 r/min離心10 min，取最上層液體，以上所有步驟重復(fù)3次。將提取液轉(zhuǎn)移入透析袋（MW:3500）透析48 h去除游離蛋白。48 h后，將透析液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中凍干得大鯢黏液粗糖蛋白，并收集稱重，按式（1）計(jì)算得率：

式中：W——粗糖蛋白得率（%）；M——凍干后粗糖蛋白質(zhì)量（g）；M——大鯢黏液凍干粉質(zhì)量（g）。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 提取時(shí)間對得率的影響 稱取5 g大鯢黏液凍干粉，以0.3 mol/L的NaOH溶液，在料液比為1:30 g/mL，溫度為50 ℃水浴中分別提取 2、3、4、5、6 h，按上述工藝提取，去除游離蛋白，凍干，按式（1）計(jì)算得率。

1.2.2.2 提取溫度對得率的影響 稱取5 g大鯢黏液凍干粉，以0.3 mol/L的NaOH溶液，在料液比為1:30 g/mL，分別在溫度 30、40、50、60、70 ℃ 水浴中分別提取5 h，按上述工藝提取，去除游離蛋白，凍干，按式（1）計(jì)算得率。

1.2.2.3 提取液濃度對得率的影響 稱取5 g大鯢黏液凍干粉，分別以 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L 的NaOH溶液，在料液比為1:30 g/mL，溫度50 ℃水浴中提取5 h；按上述工藝提取，去除游離蛋白，凍干，按式（1）計(jì)算得率。

1.2.2.4 料液比對得率的影響 稱取5 g大鯢黏液凍干粉，以0.3 mol/L的NaOH溶液，分別采用1:20、1:25、1:30、1:35、1:40 g/mL 的料液比，溫度 50 ℃水浴中提取5 h；按上述工藝提取，去除游離蛋白，凍干，按式（1）計(jì)算得率。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，應(yīng)用Design Expert12軟件，以堿提醇沉實(shí)驗(yàn)單因素?cái)?shù)據(jù)為基礎(chǔ)，以料液比（A）、溫度（B）、提取時(shí)間（C）、提取液濃度（D）為主要影響因素，以大鯢黏液粗糖蛋白得率為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化堿法提取大鯢黏液糖蛋白工藝。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.4 大鯢黏液粗糖蛋白純化 陰離子交換層析法和凝膠層析法是純化糖蛋白的常用方法。將粗大鯢黏液粗糖蛋白溶解在Tris-HCl（pH7.4）中（調(diào)整樣液濃度為2～3 mg/mL），然后經(jīng)0.22 μm孔徑的濾膜過濾。DEAE-52柱（1.6 cm×40 cm）經(jīng)預(yù)處理后，用20 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）平衡柱體，然后將大鯢黏液粗糖蛋白溶液裝填至DEAE-52柱上，用含有0.02 mol/L Tris-HCl（pH7.4）的梯度 NaCl洗脫液（0、0.15、0.25、0.35和0.45 mol/L）進(jìn)行洗脫。洗脫速率設(shè)置為1 mL/min，每5 min收集一次洗脫液。用紫外檢測器在280 nm處測定每支管的蛋白質(zhì)含量，而用苯酚-硫酸法在490 nm處得到多糖峰。繪制兩種測定的紫外吸收光譜，并確定、收集、透析和凍干重疊峰。將收集到的凍干粉用去離子水溶解，采用SephadexG-100進(jìn)一步純化。最后得到的洗脫液采用上述方法進(jìn)行檢測。收集重疊峰、凍干，得到純化后的大鯢黏液糖蛋白（MGP）應(yīng)用于后續(xù)理化表征實(shí)驗(yàn)，以下簡稱MGP。

1.2.5 大鯢黏液糖蛋白（MGP）表征實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 SDS-PAGE電泳鑒定 SDS-PAGE廣泛用于蛋白質(zhì)的測定，參照李敏等的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，本實(shí)驗(yàn)采用5%濃縮膠和12%分離膠，將MGP樣品進(jìn)行前處理后，10 μL上樣。電泳在恒壓120 V下進(jìn)行。當(dāng)指示劑在大約1～2 cm處到達(dá)凝膠底部時(shí)，停止電泳，采用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，脫色后觀察電泳條帶。

1.2.5.2 氨基酸分析 根據(jù)劉俊奇的實(shí)驗(yàn)方法并略作修改，采用Hitachi LA-8080氨基酸自動(dòng)分析儀測定糖蛋白的氨基酸組成。將總共15 mg的MGP粉末置于水解管中，然后加入6 mol/L HCl和3滴重蒸苯酚。然后將水解管在110 ℃烘箱中水解22 h。水解完畢待冷卻至室溫后，將樣品真空干燥，將殘余物重新溶解在超純水中并按上述方法真空干燥。最后，加入檸檬酸緩沖液（pH2.2）進(jìn)行溶解，通過0.22 μm過濾器過濾，并通過氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

1.2.5.3 紫外全波長掃描以及糖肽鍵檢測分析 參考Li等對灰星鯊水解產(chǎn)物糖蛋白的紫外全波長掃描以及糖肽鍵檢測方法。MGP的紫外全波長吸收光譜圖，采用UV-1800PC分光光度計(jì)測定。將大鯢黏液糖蛋白溶解在去離子水中。調(diào)整濃度為1 mg/mL并使用200～400 nm的波長范圍進(jìn)行掃描；配置MGP溶液（2 mg/mL）加入等體積的0.4 mol/L NaOH，在25 ℃反應(yīng)2 h，然后用UV-1800PC分光光度計(jì)在200～300 nm處進(jìn)行分析，與去離子水混合的樣品作為對照。

1.2.5.4 FTIR光譜分析 采用Nicolet1 iS10 FT-IR光譜儀對MGP進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析。直接將1 mg MGP粉末直接壓入FTIR光譜儀進(jìn)行4000～550 cm范圍內(nèi)的紅外光譜分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Design Expert12進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析，使用Origin 2017軟件進(jìn)行作圖，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對大鯢黏液粗糖蛋白得率的影響從圖1可知，大鯢黏液粗糖蛋白得率在5 h達(dá)到最大值，為5.01%。薛張芝等對墨魚纏卵腺進(jìn)行糖蛋白提取，其在4 h得到最高的得率。大鯢黏液及一些動(dòng)物源糖蛋白如墨魚纏卵腺等，其組分復(fù)雜，在溶液中難分散，釋放需要更長時(shí)間的浸提從而達(dá)到更高的提取效率，這與薛張芝實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。在5 h之前，大鯢黏液糖蛋白得率隨著提取時(shí)間的增加而增加，在5 h之后，大鯢黏液糖蛋白得率有顯著（＜0.05）下降。較短的提取時(shí)間，使得糖蛋白提取釋放不完全，導(dǎo)致得率較低；而長時(shí)間的提取過后，蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生相互作用，使得糖蛋白產(chǎn)生凝結(jié)、聚集、沉淀，導(dǎo)致糖蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，從而導(dǎo)致得率的下降。因此，本實(shí)驗(yàn)條件下選擇5 h作為最佳提取時(shí)間。

圖1 不同提取時(shí)間對得率的影響Fig.1 Effect of different extraction time on yield of crude glycoprotein from A.davidianus mucus

2.1.2 提取溫度對大鯢黏液粗糖蛋白得率的影響從圖2可知，大鯢黏液糖蛋白的得率在60 ℃達(dá)到最大值，為5.10%。在60 ℃之前，大鯢黏液糖蛋白得率隨著提取溫度的增加而增加，在60 ℃之后，大鯢黏液糖蛋白得率有顯著（＜0.05）下降。一定的溫度條件下有助于糖蛋白的溶出，李衛(wèi)林等提取甘薯糖蛋白同樣在60 ℃得到最大得率，而繼續(xù)升溫導(dǎo)致糖蛋白變性，成為絮狀沉淀析出，最終導(dǎo)致得率的降低。考慮到溫度對蛋白質(zhì)活性的影響，以及在50 ℃和60 ℃提取率差異不顯著（＞0.05），故本實(shí)驗(yàn)條件下，選擇50 ℃作為最佳提取溫度。

圖2 不同提取溫度對得率的影響Fig.2 Effects of temperature on yield of crude glycoprotein from A.davidianus mucus

2.1.3 提取液濃度對大鯢黏液粗糖蛋白得率的影響從圖3可知，大鯢黏液糖蛋白的得率在NaOH濃度為0.3 mol/L達(dá)到最大值，為5.14%。在0.3 mol/L之前，大鯢黏液糖蛋白得率隨提取液濃度的增加而增加，在0.3 mol/L之后，大鯢黏液糖蛋白得率隨著提取液濃度增加而下降（＜0.05）。堿提取法有較高的提取效率，而過高的濃度會使糖蛋白變性，導(dǎo)致得率下降，陳淑敏等對曼氏無針烏賊纏卵腺糖蛋白提取，NaOH濃度的增加導(dǎo)致糖蛋白得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在0.4 mol/L時(shí)提取率達(dá)到最高，圖形與本文基本一致。根據(jù)不同物料糖蛋白特性不同，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文選擇0.3 mol/L提取液濃度作為最佳提取液濃度。

圖3 不同提取液濃度對得率的影響Fig.3 Effects of concentration of NaOH on yield of crude glycoprotein from A.davidianus mucus

2.1.4 料液比對大鯢黏液粗糖蛋白得率的影響 從圖4可知，大鯢黏液糖蛋白得率在料液比為1:30時(shí)達(dá)到最大值，為5.09%。當(dāng)較低料液比時(shí)，溶液量較少，提取液較快達(dá)到過飽和狀態(tài)，糖蛋白溶出效率較低，使得整個(gè)提取過程不充分進(jìn)行，而過大的料液比，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程能耗增加，伴隨一定程度的損失，使得提取效率下降。故本實(shí)驗(yàn)選擇1:30為最佳提取料液比。

圖4 不同料液比對得率的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on yield of crude glycoprotein from A.davidianus mucus

2.2 大鯢黏液粗糖蛋白的提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 將大鯢黏液粗糖蛋白得率（Y）作為響應(yīng)值，料液比（A）、溫度（B）、提取時(shí)間（C）、提取液濃度（D）四個(gè)因素為自變量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到回歸方程為Y=5.14+0.0358A+0.0525B+0.0492C+0.0442D-0.0400AB-0.0175AC+0.0300AD-0.0500BC+0.0425BD+0.0650CD-0.1571A-0.1546B-0.1371C-0.1746D。通過對表3進(jìn)行回歸模擬方差分析可知，模型值為＜0.0001，該模型具有極顯著性（＜0.01），實(shí)驗(yàn)誤差較小，說明該數(shù)學(xué)模型能夠很好的解釋糖蛋白得率的變化。而失擬項(xiàng)（＞0.05）不顯著，說明該數(shù)學(xué)模型與真是響應(yīng)面的擬合度較高。=0.9704，表示回歸方程中所有自變量的變化可以解釋97.04%因變量的變化，表明回歸方程可以很好地描述考察因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。A、B、C、D四因素對糖蛋白的得率影響也極為顯著（＜0.01），影響程度為B＞C＞D＞A，即溫度＞提取時(shí)間＞提取液濃度＞料液比。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析 從圖5-a、圖5-c、圖5-e、圖5-g、圖5-i和圖5-k可知，響應(yīng)面坡度較陡，且呈現(xiàn)處開口向下的凸形曲面，即存在最大得率。從等高線可知，在等高線呈橢圓形時(shí)，說明兩個(gè)因素之間有交互作用；等高線呈圓形時(shí)，則說明兩個(gè)因素的交互作用不明顯，其中圖5-b、圖5-h、圖5-j和圖5-l整個(gè)圖像呈現(xiàn)橢圓形，說明溫度和料液比、提取時(shí)間和溫度、溫度和提取液濃度、提取時(shí)間和提取液濃度的交互作用較為顯著，與回歸方程結(jié)果相吻合。

圖5 各因素交互作用對得率的影響Fig.5 Response surface and contour plots

2.2.3 最優(yōu)試驗(yàn)方案驗(yàn)證 當(dāng)在溫度為51.492 ℃，料液比為1:30.513 g/mL，提取時(shí)間為5.188 h，提取液濃度為0.319 mol/L時(shí)，得到最大得率為5.155%，根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作情況，取溫度為51 ℃，料液比為1:30.5 g/mL，提取時(shí)間5.2 h，提取液濃度0.32 mol/L為提取條件，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。通過三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得知，大鯢黏液粗糖蛋白得率最高為5.22%±0.71%，證明響應(yīng)面模型優(yōu)化有具有可行性，能夠較好地模擬大鯢黏液糖蛋白提取過程以及預(yù)測得率。

2.3 大鯢黏液粗糖蛋白純化

大鯢黏液粗糖蛋白通過采用兩種不同的色譜柱進(jìn)一步純化。為了獲取單一組分的糖蛋白，常用柱層析的方式對樣品進(jìn)行分級，最常用的方法是陰離子交換柱層析以及凝膠柱層析。層析裝置一般連接有核酸蛋白檢測儀，監(jiān)控OD處吸光度情況。后續(xù)采用苯酚-硫酸法或是蒽酮-硫酸法繪制糖蛋白中糖部分的吸收曲線，根據(jù)重疊峰收集糖蛋白樣品。

如圖6（a）所示，紫外檢測器在280 nm處監(jiān)測到三個(gè)主要洗脫峰，分別命名為MGP1、MGP2和MGP3，其中MGP1和MGP2的吸光度值較高，MGP3的吸光度值較低，相比徐偉良采用單一濃度的洗脫方式只得到單一洗脫峰相比，梯度洗脫方式有著更廣的分離范圍，得到三種不同的洗脫峰。在后續(xù)苯酚-硫酸法測定后，苯酚-硫酸法測定的490 nm處只有兩個(gè)重疊峰，而MGP1的雙峰有較好的重疊。因此，本研究選擇MGP1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的對象，收集進(jìn)行透析、凍干。將MGP1溶解于去離子水中，在Sephadex G-100 柱上，只得到一個(gè)組分（圖6（b）），命名為 MGP。該洗脫液組分也被收集、透析和凍干作進(jìn)一步測定。

圖6 MGP色譜分離圖Fig.6 Chromatographic isolation of MGP

2.4 SDS-PAGE電泳結(jié)果

由圖7可見，其中M代表蛋白Marker，A代表純化后的大鯢黏液糖蛋白MGP。經(jīng)離子交換層析，凝膠柱層析后，粗糖蛋白得到了分離純化，在SDSPAGE上呈現(xiàn)單一條帶，證明純化后的糖蛋白為單一組分，達(dá)到電泳純，可進(jìn)行后續(xù)結(jié)構(gòu)分析實(shí)驗(yàn)。根據(jù)蛋白Marker可知，MGP分子量約為29 kDa。

圖7 SDS-PAGE電泳圖Fig.7 SDS-PAGE electrophoresis

2.5 MGP氨基酸組成分析

MGP的氨基酸組成見表4。對18種氨基酸進(jìn)行了測試，除色氨酸由于酸水解以及胱氨酸低于檢出限未列于表中。其中，總氨基酸含量81.53 g/100 g，人體必需氨基酸含量為37.21 g/100 g，藥用氨基酸含量33.39 g/100 g。MGP主要含有的三種藥用氨基酸中，Asp可用于治療心臟病、肝病、高血壓、預(yù)防和恢復(fù)疲勞。Lys具有促進(jìn)人體生長發(fā)育、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗病毒、抗脂質(zhì)氧化、緩解焦慮等積極作用。Ile能增加生長激素水平，進(jìn)而幫助燃燒體內(nèi)脂肪。這些結(jié)果表明，MGP其含有的必需氨基酸及藥用氨基酸占比較高，有著用于生物醫(yī)學(xué)以及食品工程方面的潛力。

表4 MGP氨基酸組成分析Table 4 Amino acid composition of MGP

2.6 紫外全波長掃描以及糖肽鍵檢測分析

MGP的紫外光譜如圖8（a）所示，在215 nm處有較強(qiáng)的吸收，表明該多肽的存在。280 nm的弱吸收表明MGP含有蛋白質(zhì)，這與苦蕎糖蛋白的紫外全波長吸收圖譜基本一致，說明具有典型的糖蛋白特征。

圖8 MGP 紫外全波長掃描圖（a）和 MGP β-消除反應(yīng)實(shí)驗(yàn)（b）Fig.8 UV spectra of MGP (a) and UV spectrum profiles of βelimination before and after alkali treatment (b)

經(jīng)過堿處理和未經(jīng)過堿處理的MGP的紫外掃描光譜如圖8（b）所示。N型糖肽鍵在堿性環(huán)境中非常穩(wěn)定，而O型糖肽鍵則相反。與對照樣品相比，在240 nm處的吸光度值明顯升高，說明發(fā)生了-消除反應(yīng)，確定了MGP中O型糖肽鍵的存在。

2.7 大鯢黏液糖蛋白紅外表征

由圖9所示，MGP在 3185、2965、1637、1400和1040 cm附近出現(xiàn)了吸收峰。如表5所示，這些峰屬于蛋白和多糖等吸收特征峰，這與劉曉飛所得到的發(fā)芽糙米糖蛋白FTIR圖譜類似，具有典型的糖蛋白特征。3185.88 cm處為-NH/NH/-NH的N-H鍵之間的伸縮振動(dòng)，并且存在氫鍵作用。3000～2800 cm之間為飽和烴基（如-CH或-CH）間C-H伸縮振動(dòng)峰。1637.06 cm與1551.18 cm分別屬于C=O鍵的伸縮振動(dòng)與N-H角振動(dòng)，對應(yīng)糖蛋白中羧基和酰胺基的振動(dòng)。在1400.59 cm處，C-H產(chǎn)生的變角振動(dòng)吸收是蛋白質(zhì)分子肽鍵的特征吸收峰。1137.06 cm與1040 cm處產(chǎn)生的吸收峰是吡喃糖環(huán)中醚鍵和羥基的典型吸收峰。889.41 cm處產(chǎn)生的吸收峰說明，MGP含有-糖苷鍵。

圖9 MGP紅外光譜圖Fig.9 Infrared image of MGP

表5 MGP紅外光譜分析結(jié)果Table 5 Results of FTIR analysis of MGP

紅外圖譜上通過分析1700～1600 cm處的紅外吸收圖譜，能夠分析得出MGP中糖蛋白二級結(jié)構(gòu)的特征。通過Peakfit 4.12軟件，對酰胺Ⅰ帶圖譜進(jìn)行分析，通過去卷積處理，二階導(dǎo)數(shù)多次擬合，使得擬合結(jié)果大于0.986，通過計(jì)算，得到MGP二級結(jié)構(gòu)含量列于表6。酰胺Ⅰ帶在1600～1640 cm內(nèi)為-折疊，1640～1650 cm內(nèi)為無規(guī)卷曲，1650～1660 cm內(nèi)為-螺旋，1660～1700 cm內(nèi)為-轉(zhuǎn)角。通過表6得知，MGP中主要含有的是-折疊結(jié)構(gòu)占比約為87%。

表6 MGP在酰胺Ⅰ帶的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量Table 6 Content of secondary structure of active peptide and amide Ⅰ-band protein in MGP

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化大鯢黏液粗糖蛋白提取工藝，根據(jù)分析結(jié)果結(jié)合實(shí)際操作得出大鯢黏液粗糖蛋白最佳提取工藝為：溫度51 ℃，料液比1:30.5 g/mL，提取時(shí)間5.2 h，提取液濃度0.32 mol/L。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。通過三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得知，大鯢黏液粗糖蛋白的得率最高為5.22%±0.71%。

在最優(yōu)工藝條件下，對大鯢黏液粗糖蛋白進(jìn)行分離純化，得到一種大鯢黏液糖蛋白MGP，凍干后為白色粉末，經(jīng)SDS-PAGE分析達(dá)到電泳純，分子量約為29 kDa。對其進(jìn)行表征，MGP中必需氨基酸及藥用氨基酸含量分別為37.21 g/100 g和33.39 g/100 g；MGP有典型的糖蛋白結(jié)構(gòu)的紫外全波長吸收圖像；含有O型糖肽鍵，吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)和-糖苷鍵，其糖蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由87%-折疊構(gòu)成，為后續(xù)深入探究大鯢黏液糖蛋白生物活性提供一定基礎(chǔ)。