低聚木糖復配凍干保護劑的優(yōu)化及其對雙歧桿菌微膠囊性能的影響

張傳偉，朱慧霞，柴佳太，彭洪草，姚日生

（合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230009）

低聚木糖（Xylo-oligosaccharide，XOS，又稱木寡糖，是由2～6個木糖以-1,4糖苷鍵連接形成的低聚物，其中木二糖含量越高，產品質量越好。低聚木糖具有多種生物學功能，被譽為“超強益生元”，可以有效刺激腸道益生菌的生長，促進短鏈脂肪酸的產生，從而改善腸道微生物種群，增強機體腸道健康。同時，低聚木糖還具有促進鈣的吸收、預防齲齒和降低血糖、膽固醇等生理功能。有研究表明，在益生菌的凍干過程中，添加適量的低聚木糖可以有效提高益生菌的凍干存活率，達到凍干保護和益生的雙重作用。

傳統(tǒng)的益生菌產品在加工和宿主胃腸道遞送過程中，活菌量會顯著下降，難以發(fā)揮益生作用。而通過微囊化技術將益生菌包埋在微囊壁材中，可以有效抵抗外界的不良環(huán)境，提高益生菌的存活率。益生菌微膠囊的制備方法主要包括擠出、乳化、凝聚等。冷凍干燥是微膠囊干燥脫水的最適宜技術，但需要加入適宜的凍干保護劑來減少菌體死亡。糖類是常用的凍干保護劑，且常以蛋白質、氨基酸和多羥基醇等與其復配。大量研究表明，功能性低聚糖在益生菌微膠囊中具有不錯的應用前景。鄒盈等研究發(fā)現(xiàn)，低聚異麥芽糖在副干酪乳桿菌微膠囊中具有良好的冷凍保護效果。何榮軍等報道中表明，在微膠囊壁材中添加黑木耳低聚糖能夠明顯增加嗜酸乳桿菌微膠囊的活菌載量以及對不良環(huán)境的抗性。同樣，Rajam等發(fā)現(xiàn)在乳清蛋白壁材中加入低聚果糖，可以有效提高植物乳桿菌凍干過程中的細胞活力。低聚木糖作為新型功能性益生元，具有良好的抗凍性能，但以其復配的凍干保護劑在微膠囊中的應用國內外研究較少。另外，微膠囊保護劑的研究通常局限于益生菌的包埋和凍干保護方面，而在胃液耐受、腸液釋放以及儲藏等方面研究尚為不足。

基于此，本文以人體重要益生菌雙歧桿菌（）為菌株，進行微膠囊包埋處理，探討了低聚木糖對雙歧桿菌微膠囊的包埋效果和凍干保護影響。在此基礎上，選用低聚木糖、谷氨酸鈉和甘油進行復配，以最終活菌負載率為指標，通過正交試驗確定最優(yōu)保護劑配比，同時還評估了添加最優(yōu)復配保護劑對微膠囊的性能影響。本研究可以解決益生菌微膠囊在生產和使用過程中活菌損失等問題，具有廣泛的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙歧桿菌（，CGMCC 1.5029）中國普通微生物菌種保藏管理中心；MRS培養(yǎng)基北京索萊寶科技有限公司；低聚木糖（純度為78%）

參照何歡方法制備；乳清蛋白、殼聚糖、胃蛋白酶（250 U/mg）、胰蛋白酶（2500 U/mg） 上海源葉生物股份有限公司；鹽酸、氯化鈣、海藻酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、甘油、谷氨酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司。

EYQX-II厭氧培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；YXQ-LS-70A立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；TF-FD冷凍干燥機 上海田楓實業(yè)有限公司；JSM-6490LV掃描電子顯微鏡 日本電子制造有限公司；D-37520冷凍高速離心機 德國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微膠囊的制備 參照周莉等的方法并略作改動，以海藻酸鈉、乳清蛋白為壁材，采用擠壓法制備微膠囊，具體方法如下：

將雙歧桿菌接種MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3次后，離心（5000 r/min，5 min）收集菌泥，用0.9%生理鹽水洗滌兩次后，重懸于生理鹽水中，使得濃縮菌液維持在10CFU/mL，采用傾注平板法對濃縮菌液進行計數(shù)。

取一定量的濃縮菌液，加入凍干保護劑，與2%海藻酸鈉和10%的乳清蛋白按1:1:1比例混勻成菌懸液，磁力攪拌30 min。采用1 mL注射器逐滴加入2%的氯化鈣中，靜置30 min，生理鹽水洗滌3次，得濕膠囊，將樣品在-80 ℃中預凍1 h后，于冷凍干燥機中凍干24 h，得凍干微膠囊。在濃縮菌液中，加入等量保護劑直接冷凍干燥后，得凍干菌粉。

1.2.2 含低聚木糖復配凍干保護劑的設計

1.2.2.1 單因素實驗 低聚木糖添加量的篩選：分別按照濃縮菌液的 0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%加入低聚木糖，充分混勻后進行制備凍干微膠囊，并測定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。

甘油添加量的篩選：在最佳低聚木糖含量的基礎上，分別加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的甘油于濃縮菌液中，充分混勻后制備微膠囊，并測定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。

谷氨酸鈉添加量的篩選：在最佳低聚木糖含量的基礎上，分別加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的谷氨酸鈉于濃縮菌液中，充分混勻后制備微膠囊，并測定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。

1.2.2.2 正交試驗 在單因素實驗的基礎上，按表1進行正交試驗，以雙歧桿菌最終活菌載率為考察指標，確定復配保護劑的最佳配比。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 包埋率、凍干存活率和最終活菌載率計算取1 g濕（凍干）微膠囊于錐形瓶中，加入10 mL無菌 PBS緩沖液（pH=7.4），于37 ℃ 振蕩1 h，用 0.9%滅菌生理鹽水進行梯度稀釋，使用傾注平板法進行精確計數(shù)。包埋率、凍干存活率以及最終活菌載率計算公式如下：

式中 N：原菌懸液總的活菌數(shù)（CFU）；N：濕膠囊中總的活菌數(shù)（CFU），每克濕膠囊中的活菌量乘以總的濕膠囊質量；N：凍干微膠囊中總的活菌數(shù)（CFU），每克凍干膠囊中的活菌量乘以總的凍干膠囊質量。

1.2.4 微膠囊的掃描電子顯微鏡分析 用JSM-6490LV儀器拍攝雙歧桿菌微膠囊掃描電子顯微照片，以未添加復配保護劑的微膠囊為對照。

1.2.5 微膠囊在模擬胃液中的耐酸試驗 模擬胃液配制：參照Dehkordi等的方法，將8.5 g的NaCl和3.0 g的胃蛋白酶懸浮在 7.0 mL的濃HCl中，并用蒸餾水稀釋至1 L，使得溶液pH為2.0。分別取1 g添加保護劑和未添加保護劑的微膠囊置于錐形瓶中，并加入10 mL的模擬胃液，于37 ℃下振蕩2 h，分別在 0、10、30 min，1、2 h取樣離心（5000 r/min，5 min）收集微膠囊，并加入10 mL的無菌PBS緩沖液（pH=7.4），于37 ℃下振蕩1 h，使用傾注平板法進行精確計數(shù)，以初始微膠囊中的活菌數(shù)為基準，計算其存活率，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對照。

1.2.6 微膠囊在模擬腸液中的釋放試驗 模擬腸液的配制：參照 Shafizadeh等的方法，取6.8 g的KHPO和10 g的胰蛋白酶溶于適量的蒸餾水中，用1 mol/L NaOH將pH調至7.5±0.1后，稀釋至1 L備用。分別取 1 g添加及未添加冷凍保護劑的微膠囊置于錐形瓶中，隨后加入10 mL的模擬腸液，于37 ℃恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)3 h，依次在20、40 min，1、2、3 h取樣，使用傾注平板法進行精確計數(shù)，以最大活菌釋放量為基準，計算其釋放率，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對照。

1.2.7 微膠囊貯存穩(wěn)定性試驗 將添加及未添加保護劑的凍干微膠囊分別在4和25 ℃下避光貯存35 d，每隔7 d取1 g樣品，加入10 mL的無菌PBS緩沖液，于37 ℃下振蕩1 h，使用傾注平板法測定雙歧桿菌活菌數(shù)，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均進行3組平行試驗，結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 低聚木糖添加量對凍干微膠囊活菌載率的影響 添加不同質量分數(shù)的低聚木糖對凍干微膠囊活菌載率的影響如圖1所示，在一定范圍內，低聚木糖可以顯著提高微膠囊的活菌載率，在質量分數(shù)為4%時，達到最大，為63.4%。低聚木糖可以增加微膠囊壁材的黏度，減小了孔徑并形成了更加緊密的網(wǎng)絡，從而減少了益生菌的損失。同時，功能性低聚糖還可以替代水分子與細胞膜磷酸基團發(fā)生氫鍵作用，從而在避免凍干過程中細胞脫水造成細胞膜破損，降低菌體死亡。因此，如圖1所示，適量的低聚木糖加入可以同時提高微膠囊的包埋效果和雙歧桿菌的抗凍性。而當?shù)途勰咎翘砑恿砍^4%時，微膠囊的最終活菌載率逐漸降低，這是由于低聚糖含量過高，會增加微相分離，產生較大的孔徑，使得菌體流失，從而降低微膠囊的包埋率。綜上，選擇2%～6%的低聚木糖添加量進行后續(xù)正交試驗。

圖1 低聚木糖添加量對微膠囊的包埋率、凍干存活率和最終活菌載率的影響Fig.1 Effects of XOS content on embedding rate, freeze-drying survival rate and final active bacteria loading rate of microcapsules

2.1.2 甘油添加量對凍干微膠囊活菌載率的影響保持低聚木糖添加量為4%，甘油添加量對凍干微膠囊的活菌載率影響如圖2所示。隨著甘油量的增加，微膠囊的活菌載率先增高后降低，在添加量為2%時，達到最大值，為67.5%。主要原因是甘油作為優(yōu)良的凍干保護劑，不僅可以減少冷凍過程中的冰晶產生，還可以與細胞膜上的蛋白質結合，從而維持細胞結構的完整性，減少菌體死亡。但過多甘油加入，會使得微膠囊的包埋效果降低，從而減少微膠囊的最終活菌載率。綜上，選擇1%～3%的甘油添加量進行后續(xù)正交試驗。

圖2 甘油添加量對微膠囊的包埋率、凍干存活率和最終活菌載率的影響Fig.2 Effects of glycerol content on embedding rate, freezedrying survival rate and final active bacteria loading rate of microcapsules

2.1.3 谷氨酸鈉添加量對凍干微膠囊活菌載率的影響 保持低聚木糖添加量為4%，谷氨酸鈉添加量對微膠囊的活菌載率影響如圖3所示，當谷氨酸鈉添加量為1%時，谷氨酸鈉可以顯著增強微膠囊的活菌載率。由于谷氨酸鈉具有還原性，可以延展乳清蛋白的結構，使得菌體更好與壁材接觸，從而提高微膠囊的包埋效果，而且谷氨酸鈉還可以防止凍干過程中細胞內蛋白質的變性，增強益生菌的抗凍性能。但過多的谷氨酸鈉會導致單位質量微膠囊中菌含量減少，降低微膠囊的包埋率，同時谷氨酸鈉濃度過高也會造成胞內滲透壓增加，不利于低溫保存。因此，當繼續(xù)增加谷氨酸鈉時，微膠囊的最終活菌載率逐漸降低。綜上，為進一步研究谷氨酸鈉在復配保護劑中的協(xié)同效果，選擇1%～3%的谷氨酸鈉添加量進行后續(xù)正交試驗。

圖3 谷氨酸鈉添加量對微膠囊的包埋率、凍干存活率和最終活菌載率的影響Fig.3 Effects of sodium glutamate content on embedding rate,freeze-drying survival rate and final active bacteria loading rate of microcapsules

2.2 正交試驗結果

在單因素實驗的基礎上，進行正交試驗，以最終活菌載率為基準，確定低聚木糖、甘油、谷氨酸鈉3種保護劑的復配濃度，試驗結果和方差分析見表2、表3。

由表2、表3可知，影響微膠囊最終活菌量的因素主要次序是低聚木糖＞谷氨酸鈉＞甘油，其中低聚木糖的值小于0.05，說明低聚木糖含量對微膠囊的最終活菌載量具有顯著性影響。根據(jù)K值，確定最佳配方為ABC，即低聚木糖4.0%，甘油2.0%，谷氨酸鈉1.0%。經驗證，最佳配方下的雙歧桿菌微膠囊包埋率為81.5%±0.7%，凍干存活率為88.1%±0.3%。此時微膠囊的最終活菌負載率為71.8%±0.2%，優(yōu)于正交試驗表中的結果，因此認為正交試驗優(yōu)化結果有效。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗方差分析Table 3 The variance analysis of orthogonal experiment

2.3 微膠囊的表觀形態(tài)分析

凍干微膠囊的掃描電鏡觀察結果如圖4所示。微膠囊粒徑大小約為1 mm左右，表面呈皺縮塌陷，凹凸不平的現(xiàn)象，這是由于冷凍干燥過程中脫水造成的。添加4%低聚木糖保護劑的微膠囊（圖b）相對于對照組（圖a），表面孔徑較少，沒有明顯的裂縫。低聚木糖具有低分子量的短鏈結構，能夠填充于由海藻酸鈉與乳清蛋白相互作用產生的分子空間，產生更具凝聚力的結構，從而提高包埋效果。由于復配保護劑的凍干保護效果更佳，可以更有效地減緩凍干過程中冰晶的升華，因此，添加復配保護劑的微膠囊（圖c）更加圓潤包滿，且表面平整致密。

圖4 雙歧桿菌微膠囊的掃描電鏡觀察結果Fig.4 SEM results of Bifidobacterium microcapsules

2.4 微膠囊在模擬胃液中的耐酸性能

如圖5所示，未包埋的益生菌粉經模擬胃液處理2 h后，菌體幾乎全部死亡，而經包埋的益生菌存活率下降了49.4%，說明益生菌微膠囊化可以有效抵抗胃酸等不良環(huán)境。此外，添加復配保護劑的微膠囊經模擬胃液處理2 h后，其活菌數(shù)只下降了34.1%，說明保護劑可以提高雙歧桿菌微膠囊的耐酸性，一方面低聚木糖的加入使得微膠囊結構更加致密，減少酸的滲入，另一方面，低聚木糖與低聚果糖的性能類似，與乳清蛋白形成的壁材具有一定緩沖能力，在抗酸方面也發(fā)揮了重要作用。此外，谷氨酸鈉的添加也會誘導某些與菌體生物膜及信號轉導有關的蛋白表達發(fā)生改變，從而有利于其在酸性環(huán)境中生存。

圖5 原菌粉和微膠囊在模擬胃液中的存活率Fig.5 Survival rate of Bifidobacterium powders and microcapsules in SGF

2.5 微膠囊在模擬腸液中的釋放性能

微膠囊在模擬腸液中的釋放性能如圖6所示，經包埋的益生菌微膠囊具有一定緩釋作用，在60 min幾乎全部釋放，其活菌數(shù)約10CFU/mL，其中添加含低聚木糖復配保護劑的微膠囊在前60 min的釋放量高于未添加的微膠囊。原因可能是添加復配保護劑的微膠囊，活菌載量更高，而且低聚木糖作為功能性益生元，可以充當營養(yǎng)物質刺激促進雙歧桿菌的生長。因此，添加復配保護劑的微膠囊能夠較好地在人工腸液中崩解，并且達到益生元和益生菌的協(xié)同作用。

圖6 原菌粉和微膠囊在模擬腸液中的釋放率Fig.6 Release rate of Bifidobacterium powders and microcapsules in SIF

2.6 微膠囊的儲存性能

由圖7、圖8可知，在4 ℃和25 ℃貯藏一定時間后，經微膠囊化的益生菌存活率顯著高于凍干菌粉（＜0.05），說明微膠囊技術提高了雙歧桿菌的儲存穩(wěn)定性。微膠囊壁材可以作為物理屏障，阻隔空氣中氧和水分等不良因素，增強雙歧桿菌的抵抗能力。添加低聚木糖復配劑的微膠囊，在4 ℃和25 ℃下貯藏35 d后，活菌量分別為8.1和7.0 lg CFU/g，相對未添加保護劑的微膠囊儲藏性更好，且符合《益生菌類保健食品申報與審評規(guī)定（試行）》，原因可能是復配保護劑中低聚木糖和谷氨酸鈉具有一定還原性，可以更有效減少菌體細胞膜脂質的氧化，維持雙歧桿菌的穩(wěn)定性。

圖7 雙歧桿菌菌粉和微膠囊在4 ℃的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of Bifidobacterium powders and microcapsules at 4 ℃

圖8 雙歧桿菌菌粉和微膠囊在25 ℃的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of Bifidobacterium powders and microcapsules at 25 ℃

3 結論

本研究表明在以海藻酸鈉和乳清蛋白為壁材制備的雙歧桿菌微膠囊中，添加以低聚木糖復配的凍干保護劑可以提高凍干微膠囊的活菌載率，最佳配方為低聚木糖4.0%、甘油2.0%、谷氨酸鈉1.0%，此時微膠囊的活菌載率為71.8%±0.2%，與未添加組相比提高了約21.6%；添加以低聚木糖復配保護劑的微膠囊表面更佳平整致密，經模擬胃液處理2 h后，活菌量相對于對照組提高約15.3%，同時在腸液中前60 min的釋放率也明顯高于未添加組。經4 ℃和25 ℃儲藏35 d后，加入保護劑的微膠囊活菌量相比與未添加組分別提高了約0.41 lg CFU/g和0.42 lg CFU/g。因此，低聚木糖復配保護劑可以提高雙歧桿菌微膠囊的胃液耐酸性、腸液釋放性和儲藏穩(wěn)定性。本研究結果不僅為低聚木糖作為保護劑在益生菌凍干制劑的應用奠定了良好的基礎，同時也為雙歧桿菌凍干微膠囊的制備提供理論和實踐意義。