低聚木糖復(fù)配凍干保護(hù)劑的優(yōu)化及其對雙歧桿菌微膠囊性能的影響

張傳偉，朱慧霞，柴佳太，彭洪草，姚日生

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

低聚木糖（Xylo-oligosaccharide，XOS，又稱木寡糖，是由2～6個(gè)木糖以-1,4糖苷鍵連接形成的低聚物，其中木二糖含量越高，產(chǎn)品質(zhì)量越好。低聚木糖具有多種生物學(xué)功能，被譽(yù)為“超強(qiáng)益生元”，可以有效刺激腸道益生菌的生長，促進(jìn)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，從而改善腸道微生物種群，增強(qiáng)機(jī)體腸道健康。同時(shí)，低聚木糖還具有促進(jìn)鈣的吸收、預(yù)防齲齒和降低血糖、膽固醇等生理功能。有研究表明，在益生菌的凍干過程中，添加適量的低聚木糖可以有效提高益生菌的凍干存活率，達(dá)到凍干保護(hù)和益生的雙重作用。

傳統(tǒng)的益生菌產(chǎn)品在加工和宿主胃腸道遞送過程中，活菌量會(huì)顯著下降，難以發(fā)揮益生作用。而通過微囊化技術(shù)將益生菌包埋在微囊壁材中，可以有效抵抗外界的不良環(huán)境，提高益生菌的存活率。益生菌微膠囊的制備方法主要包括擠出、乳化、凝聚等。冷凍干燥是微膠囊干燥脫水的最適宜技術(shù)，但需要加入適宜的凍干保護(hù)劑來減少菌體死亡。糖類是常用的凍干保護(hù)劑，且常以蛋白質(zhì)、氨基酸和多羥基醇等與其復(fù)配。大量研究表明，功能性低聚糖在益生菌微膠囊中具有不錯(cuò)的應(yīng)用前景。鄒盈等研究發(fā)現(xiàn)，低聚異麥芽糖在副干酪乳桿菌微膠囊中具有良好的冷凍保護(hù)效果。何榮軍等報(bào)道中表明，在微膠囊壁材中添加黑木耳低聚糖能夠明顯增加嗜酸乳桿菌微膠囊的活菌載量以及對不良環(huán)境的抗性。同樣，Rajam等發(fā)現(xiàn)在乳清蛋白壁材中加入低聚果糖，可以有效提高植物乳桿菌凍干過程中的細(xì)胞活力。低聚木糖作為新型功能性益生元，具有良好的抗凍性能，但以其復(fù)配的凍干保護(hù)劑在微膠囊中的應(yīng)用國內(nèi)外研究較少。另外，微膠囊保護(hù)劑的研究通常局限于益生菌的包埋和凍干保護(hù)方面，而在胃液耐受、腸液釋放以及儲(chǔ)藏等方面研究尚為不足。

基于此，本文以人體重要益生菌雙歧桿菌（）為菌株，進(jìn)行微膠囊包埋處理，探討了低聚木糖對雙歧桿菌微膠囊的包埋效果和凍干保護(hù)影響。在此基礎(chǔ)上，選用低聚木糖、谷氨酸鈉和甘油進(jìn)行復(fù)配，以最終活菌負(fù)載率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)確定最優(yōu)保護(hù)劑配比，同時(shí)還評估了添加最優(yōu)復(fù)配保護(hù)劑對微膠囊的性能影響。本研究可以解決益生菌微膠囊在生產(chǎn)和使用過程中活菌損失等問題，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙歧桿菌（，CGMCC 1.5029）中國普通微生物菌種保藏管理中心；MRS培養(yǎng)基北京索萊寶科技有限公司；低聚木糖（純度為78%）

參照何歡方法制備；乳清蛋白、殼聚糖、胃蛋白酶（250 U/mg）、胰蛋白酶（2500 U/mg） 上海源葉生物股份有限公司；鹽酸、氯化鈣、海藻酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、甘油、谷氨酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

EYQX-II厭氧培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；YXQ-LS-70A立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；TF-FD冷凍干燥機(jī) 上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；JSM-6490LV掃描電子顯微鏡 日本電子制造有限公司；D-37520冷凍高速離心機(jī) 德國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微膠囊的制備 參照周莉等的方法并略作改動(dòng)，以海藻酸鈉、乳清蛋白為壁材，采用擠壓法制備微膠囊，具體方法如下：

將雙歧桿菌接種MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3次后，離心（5000 r/min，5 min）收集菌泥，用0.9%生理鹽水洗滌兩次后，重懸于生理鹽水中，使得濃縮菌液維持在10CFU/mL，采用傾注平板法對濃縮菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)。

取一定量的濃縮菌液，加入凍干保護(hù)劑，與2%海藻酸鈉和10%的乳清蛋白按1:1:1比例混勻成菌懸液，磁力攪拌30 min。采用1 mL注射器逐滴加入2%的氯化鈣中，靜置30 min，生理鹽水洗滌3次，得濕膠囊，將樣品在-80 ℃中預(yù)凍1 h后，于冷凍干燥機(jī)中凍干24 h，得凍干微膠囊。在濃縮菌液中，加入等量保護(hù)劑直接冷凍干燥后，得凍干菌粉。

1.2.2 含低聚木糖復(fù)配凍干保護(hù)劑的設(shè)計(jì)

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 低聚木糖添加量的篩選：分別按照濃縮菌液的 0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%加入低聚木糖，充分混勻后進(jìn)行制備凍干微膠囊，并測定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。

甘油添加量的篩選：在最佳低聚木糖含量的基礎(chǔ)上，分別加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的甘油于濃縮菌液中，充分混勻后制備微膠囊，并測定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。

谷氨酸鈉添加量的篩選：在最佳低聚木糖含量的基礎(chǔ)上，分別加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的谷氨酸鈉于濃縮菌液中，充分混勻后制備微膠囊，并測定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。

1.2.2.2 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，以雙歧桿菌最終活菌載率為考察指標(biāo)，確定復(fù)配保護(hù)劑的最佳配比。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 包埋率、凍干存活率和最終活菌載率計(jì)算取1 g濕（凍干）微膠囊于錐形瓶中，加入10 mL無菌 PBS緩沖液（pH=7.4），于37 ℃ 振蕩1 h，用 0.9%滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，使用傾注平板法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)。包埋率、凍干存活率以及最終活菌載率計(jì)算公式如下：

式中 N：原菌懸液總的活菌數(shù)（CFU）；N：濕膠囊中總的活菌數(shù)（CFU），每克濕膠囊中的活菌量乘以總的濕膠囊質(zhì)量；N：凍干微膠囊中總的活菌數(shù)（CFU），每克凍干膠囊中的活菌量乘以總的凍干膠囊質(zhì)量。

1.2.4 微膠囊的掃描電子顯微鏡分析 用JSM-6490LV儀器拍攝雙歧桿菌微膠囊掃描電子顯微照片，以未添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊為對照。

1.2.5 微膠囊在模擬胃液中的耐酸試驗(yàn) 模擬胃液配制：參照Dehkordi等的方法，將8.5 g的NaCl和3.0 g的胃蛋白酶懸浮在 7.0 mL的濃HCl中，并用蒸餾水稀釋至1 L，使得溶液pH為2.0。分別取1 g添加保護(hù)劑和未添加保護(hù)劑的微膠囊置于錐形瓶中，并加入10 mL的模擬胃液，于37 ℃下振蕩2 h，分別在 0、10、30 min，1、2 h取樣離心（5000 r/min，5 min）收集微膠囊，并加入10 mL的無菌PBS緩沖液（pH=7.4），于37 ℃下振蕩1 h，使用傾注平板法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，以初始微膠囊中的活菌數(shù)為基準(zhǔn)，計(jì)算其存活率，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對照。

1.2.6 微膠囊在模擬腸液中的釋放試驗(yàn) 模擬腸液的配制：參照 Shafizadeh等的方法，取6.8 g的KHPO和10 g的胰蛋白酶溶于適量的蒸餾水中，用1 mol/L NaOH將pH調(diào)至7.5±0.1后，稀釋至1 L備用。分別取 1 g添加及未添加冷凍保護(hù)劑的微膠囊置于錐形瓶中，隨后加入10 mL的模擬腸液，于37 ℃恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)3 h，依次在20、40 min，1、2、3 h取樣，使用傾注平板法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，以最大活菌釋放量為基準(zhǔn)，計(jì)算其釋放率，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對照。

1.2.7 微膠囊貯存穩(wěn)定性試驗(yàn) 將添加及未添加保護(hù)劑的凍干微膠囊分別在4和25 ℃下避光貯存35 d，每隔7 d取1 g樣品，加入10 mL的無菌PBS緩沖液，于37 ℃下振蕩1 h，使用傾注平板法測定雙歧桿菌活菌數(shù)，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 低聚木糖添加量對凍干微膠囊活菌載率的影響 添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的低聚木糖對凍干微膠囊活菌載率的影響如圖1所示，在一定范圍內(nèi)，低聚木糖可以顯著提高微膠囊的活菌載率，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，達(dá)到最大，為63.4%。低聚木糖可以增加微膠囊壁材的黏度，減小了孔徑并形成了更加緊密的網(wǎng)絡(luò)，從而減少了益生菌的損失。同時(shí)，功能性低聚糖還可以替代水分子與細(xì)胞膜磷酸基團(tuán)發(fā)生氫鍵作用，從而在避免凍干過程中細(xì)胞脫水造成細(xì)胞膜破損，降低菌體死亡。因此，如圖1所示，適量的低聚木糖加入可以同時(shí)提高微膠囊的包埋效果和雙歧桿菌的抗凍性。而當(dāng)?shù)途勰咎翘砑恿砍^4%時(shí)，微膠囊的最終活菌載率逐漸降低，這是由于低聚糖含量過高，會(huì)增加微相分離，產(chǎn)生較大的孔徑，使得菌體流失，從而降低微膠囊的包埋率。綜上，選擇2%～6%的低聚木糖添加量進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖1 低聚木糖添加量對微膠囊的包埋率、凍干存活率和最終活菌載率的影響Fig.1 Effects of XOS content on embedding rate, freeze-drying survival rate and final active bacteria loading rate of microcapsules

2.1.2 甘油添加量對凍干微膠囊活菌載率的影響保持低聚木糖添加量為4%，甘油添加量對凍干微膠囊的活菌載率影響如圖2所示。隨著甘油量的增加，微膠囊的活菌載率先增高后降低，在添加量為2%時(shí)，達(dá)到最大值，為67.5%。主要原因是甘油作為優(yōu)良的凍干保護(hù)劑，不僅可以減少冷凍過程中的冰晶產(chǎn)生，還可以與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，減少菌體死亡。但過多甘油加入，會(huì)使得微膠囊的包埋效果降低，從而減少微膠囊的最終活菌載率。綜上，選擇1%～3%的甘油添加量進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖2 甘油添加量對微膠囊的包埋率、凍干存活率和最終活菌載率的影響Fig.2 Effects of glycerol content on embedding rate, freezedrying survival rate and final active bacteria loading rate of microcapsules

2.1.3 谷氨酸鈉添加量對凍干微膠囊活菌載率的影響 保持低聚木糖添加量為4%，谷氨酸鈉添加量對微膠囊的活菌載率影響如圖3所示，當(dāng)谷氨酸鈉添加量為1%時(shí)，谷氨酸鈉可以顯著增強(qiáng)微膠囊的活菌載率。由于谷氨酸鈉具有還原性，可以延展乳清蛋白的結(jié)構(gòu)，使得菌體更好與壁材接觸，從而提高微膠囊的包埋效果，而且谷氨酸鈉還可以防止凍干過程中細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性，增強(qiáng)益生菌的抗凍性能。但過多的谷氨酸鈉會(huì)導(dǎo)致單位質(zhì)量微膠囊中菌含量減少，降低微膠囊的包埋率，同時(shí)谷氨酸鈉濃度過高也會(huì)造成胞內(nèi)滲透壓增加，不利于低溫保存。因此，當(dāng)繼續(xù)增加谷氨酸鈉時(shí)，微膠囊的最終活菌載率逐漸降低。綜上，為進(jìn)一步研究谷氨酸鈉在復(fù)配保護(hù)劑中的協(xié)同效果，選擇1%～3%的谷氨酸鈉添加量進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖3 谷氨酸鈉添加量對微膠囊的包埋率、凍干存活率和最終活菌載率的影響Fig.3 Effects of sodium glutamate content on embedding rate,freeze-drying survival rate and final active bacteria loading rate of microcapsules

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，以最終活菌載率為基準(zhǔn)，確定低聚木糖、甘油、谷氨酸鈉3種保護(hù)劑的復(fù)配濃度，試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表2、表3。

由表2、表3可知，影響微膠囊最終活菌量的因素主要次序是低聚木糖＞谷氨酸鈉＞甘油，其中低聚木糖的值小于0.05，說明低聚木糖含量對微膠囊的最終活菌載量具有顯著性影響。根據(jù)K值，確定最佳配方為ABC，即低聚木糖4.0%，甘油2.0%，谷氨酸鈉1.0%。經(jīng)驗(yàn)證，最佳配方下的雙歧桿菌微膠囊包埋率為81.5%±0.7%，凍干存活率為88.1%±0.3%。此時(shí)微膠囊的最終活菌負(fù)載率為71.8%±0.2%，優(yōu)于正交試驗(yàn)表中的結(jié)果，因此認(rèn)為正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果有效。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 The variance analysis of orthogonal experiment

2.3 微膠囊的表觀形態(tài)分析

凍干微膠囊的掃描電鏡觀察結(jié)果如圖4所示。微膠囊粒徑大小約為1 mm左右，表面呈皺縮塌陷，凹凸不平的現(xiàn)象，這是由于冷凍干燥過程中脫水造成的。添加4%低聚木糖保護(hù)劑的微膠囊（圖b）相對于對照組（圖a），表面孔徑較少，沒有明顯的裂縫。低聚木糖具有低分子量的短鏈結(jié)構(gòu)，能夠填充于由海藻酸鈉與乳清蛋白相互作用產(chǎn)生的分子空間，產(chǎn)生更具凝聚力的結(jié)構(gòu)，從而提高包埋效果。由于復(fù)配保護(hù)劑的凍干保護(hù)效果更佳，可以更有效地減緩凍干過程中冰晶的升華，因此，添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊（圖c）更加圓潤包滿，且表面平整致密。

圖4 雙歧桿菌微膠囊的掃描電鏡觀察結(jié)果Fig.4 SEM results of Bifidobacterium microcapsules

2.4 微膠囊在模擬胃液中的耐酸性能

如圖5所示，未包埋的益生菌粉經(jīng)模擬胃液處理2 h后，菌體幾乎全部死亡，而經(jīng)包埋的益生菌存活率下降了49.4%，說明益生菌微膠囊化可以有效抵抗胃酸等不良環(huán)境。此外，添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊經(jīng)模擬胃液處理2 h后，其活菌數(shù)只下降了34.1%，說明保護(hù)劑可以提高雙歧桿菌微膠囊的耐酸性，一方面低聚木糖的加入使得微膠囊結(jié)構(gòu)更加致密，減少酸的滲入，另一方面，低聚木糖與低聚果糖的性能類似，與乳清蛋白形成的壁材具有一定緩沖能力，在抗酸方面也發(fā)揮了重要作用。此外，谷氨酸鈉的添加也會(huì)誘導(dǎo)某些與菌體生物膜及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白表達(dá)發(fā)生改變，從而有利于其在酸性環(huán)境中生存。

圖5 原菌粉和微膠囊在模擬胃液中的存活率Fig.5 Survival rate of Bifidobacterium powders and microcapsules in SGF

2.5 微膠囊在模擬腸液中的釋放性能

微膠囊在模擬腸液中的釋放性能如圖6所示，經(jīng)包埋的益生菌微膠囊具有一定緩釋作用，在60 min幾乎全部釋放，其活菌數(shù)約10CFU/mL，其中添加含低聚木糖復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊在前60 min的釋放量高于未添加的微膠囊。原因可能是添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊，活菌載量更高，而且低聚木糖作為功能性益生元，可以充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)刺激促進(jìn)雙歧桿菌的生長。因此，添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊能夠較好地在人工腸液中崩解，并且達(dá)到益生元和益生菌的協(xié)同作用。

圖6 原菌粉和微膠囊在模擬腸液中的釋放率Fig.6 Release rate of Bifidobacterium powders and microcapsules in SIF

2.6 微膠囊的儲(chǔ)存性能

由圖7、圖8可知，在4 ℃和25 ℃貯藏一定時(shí)間后，經(jīng)微膠囊化的益生菌存活率顯著高于凍干菌粉（＜0.05），說明微膠囊技術(shù)提高了雙歧桿菌的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。微膠囊壁材可以作為物理屏障，阻隔空氣中氧和水分等不良因素，增強(qiáng)雙歧桿菌的抵抗能力。添加低聚木糖復(fù)配劑的微膠囊，在4 ℃和25 ℃下貯藏35 d后，活菌量分別為8.1和7.0 lg CFU/g，相對未添加保護(hù)劑的微膠囊儲(chǔ)藏性更好，且符合《益生菌類保健食品申報(bào)與審評規(guī)定（試行）》，原因可能是復(fù)配保護(hù)劑中低聚木糖和谷氨酸鈉具有一定還原性，可以更有效減少菌體細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化，維持雙歧桿菌的穩(wěn)定性。

圖7 雙歧桿菌菌粉和微膠囊在4 ℃的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of Bifidobacterium powders and microcapsules at 4 ℃

圖8 雙歧桿菌菌粉和微膠囊在25 ℃的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of Bifidobacterium powders and microcapsules at 25 ℃

3 結(jié)論

本研究表明在以海藻酸鈉和乳清蛋白為壁材制備的雙歧桿菌微膠囊中，添加以低聚木糖復(fù)配的凍干保護(hù)劑可以提高凍干微膠囊的活菌載率，最佳配方為低聚木糖4.0%、甘油2.0%、谷氨酸鈉1.0%，此時(shí)微膠囊的活菌載率為71.8%±0.2%，與未添加組相比提高了約21.6%；添加以低聚木糖復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊表面更佳平整致密，經(jīng)模擬胃液處理2 h后，活菌量相對于對照組提高約15.3%，同時(shí)在腸液中前60 min的釋放率也明顯高于未添加組。經(jīng)4 ℃和25 ℃儲(chǔ)藏35 d后，加入保護(hù)劑的微膠囊活菌量相比與未添加組分別提高了約0.41 lg CFU/g和0.42 lg CFU/g。因此，低聚木糖復(fù)配保護(hù)劑可以提高雙歧桿菌微膠囊的胃液耐酸性、腸液釋放性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。本研究結(jié)果不僅為低聚木糖作為保護(hù)劑在益生菌凍干制劑的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也為雙歧桿菌凍干微膠囊的制備提供理論和實(shí)踐意義。