基于紅松籽油輔酶Q10納米乳的制備、表征和藥代動(dòng)力學(xué)研究

王忠娟，李紫菡，張秀娟，劉治廷，陳小強(qiáng),3,4,5,6，張 瑩,3,4,5,

（1.森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；3.東北林業(yè)大學(xué)林業(yè)生物制劑教育部工程中心，黑龍江哈爾濱 150040；4.黑龍江省林源活性物質(zhì)生態(tài)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040；5.東北林業(yè)大學(xué)生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040；6.西藏農(nóng)牧學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，西藏林芝 860000）

輔酶 Q（Coenzyme Q，CoQ）是天然醌類化合物，別名泛醌，是細(xì)胞自身合成的具有清除作用的唯一內(nèi)源性親脂抗氧化劑。CoQ具有清除人體自由基，降低血脂，提高免疫力等作用，同時(shí)在預(yù)防和輔助治療心血管疾病、糖尿病、腫瘤等方面也具有良好的效果。CoQ在幼年時(shí)期合成量相對(duì)較低，隨著年齡的增長，含量逐漸增加并達(dá)到最大值，但在20歲以后，其含量隨著自身合成速率降低而減少。因此，外源性補(bǔ)充CoQ對(duì)維持人體正常的新陳代謝具有積極意義。但從CoQ結(jié)構(gòu)可知，它具有較長疏水性側(cè)鏈基團(tuán)，如圖1所示。因此，CoQ存在水溶性差，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、生物利用度低等問題，從而使其應(yīng)用受限。紅松籽油來源于松科松屬植物紅松（Sivb.ct Zucc）的種子紅松籽，在我國東北地區(qū)分布較廣、資源豐富，具有良好的開發(fā)利用價(jià)值。紅松籽油風(fēng)味獨(dú)特，富含對(duì)人體有益的不飽和脂肪酸，其中皮諾斂酸是紅松籽油特有的多不飽和脂肪酸，具有一定的抗氧化能力。同時(shí)，紅松籽油具有減肥降脂、免疫抗炎、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理功效。然而，由于其自身結(jié)構(gòu)的高度不飽和，使其容易被氧化，從而應(yīng)用受限。

圖1 CoQ10化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of CoQ10

納米乳液一般指液滴粒徑范圍在50～200 nm的乳液，是油相（或水相）分散于水相（或油相）中形成的多相分散體系，可以分為O/W型和W/O型，是動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定體系，制備過程中需要輸入能量。近年來，納米乳液常被用來遞送親脂性化合物，而負(fù)載CoQ的納米乳液具有很多優(yōu)勢(shì)：可以穿越細(xì)胞膜，具有靶向和緩釋雙重效果，負(fù)載率高，還能增強(qiáng)CoQ的理化穩(wěn)定性。采用納米乳負(fù)載CoQ，一方面可以使其處于一個(gè)更加穩(wěn)定的體系當(dāng)中，生物活性成分更加穩(wěn)定，另一方面納米乳粒徑小，負(fù)載活性物的能力高，使活性物更容易被機(jī)體吸收利用，從而有效提高其生物利用度。然而，近年來，在制備CoQ納米乳液過程中，對(duì)油相的選擇上大多采用合成類油脂，如中碳鏈甘油三酯或中長碳鏈甘油三酯，這些油脂僅有增大CoQ溶解度的作用且獲取途徑可能存在安全性問題，因此，選用新型的、健康的、安全的天然植物油為油相成為研究的新思路。

目前采用天然植物油紅松籽油為油相制備納米乳的研究較少。本文采用高壓均質(zhì)技術(shù)制備基于紅松籽油的CoQ納米乳（Coenzyme Qnanoemulsion，CoQ-NE）。這既能解決紅松籽油不飽和脂肪酸因高度不飽和而易被氧化的問題，同時(shí)也會(huì)解決CoQ水溶性差，生物利用度低等問題，二者的生理功效又可以發(fā)揮協(xié)同作用。本文通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了制備CoQ-NE的最佳工藝，對(duì)CoQ-NE通過透射電鏡（Transmission electron microscope，TEM）、傅立葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）、包封率、穩(wěn)定性、體外釋放行為及藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行表征和研究。為基于紅松籽油CoQ-NE的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動(dòng)物：SPF 級(jí) SD 大鼠，體重為（300～325 g），雄性，遼寧長生生物科技有限公司，合格證編號(hào)：SCXK（遼）2020-0001。所有涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)均按照中國哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理指南進(jìn)行，并經(jīng)中國黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。CoQ（純度＞98%），CoQ（純度＞98%） 西安圣青生物科技有限公司；大豆卵磷脂（20200106） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；紅松籽 哈爾濱東北特產(chǎn)有限公司；紅松籽油（純度為 97.3%，得率＞60%，Y30 R0.6，碘值為141.65±0.02 g/100 g，過氧化值為 2.62±0.04 mmol/kg，皂化值為 185.73±0.45 mg KOH/g，酸值為 0.34±0.10 mg KOH/g） 實(shí)驗(yàn)室自制；其它化學(xué)藥品均為分析純或色譜純。

FSH-2高速勻漿機(jī) 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；AH100D高壓均質(zhì)機(jī) 上海陽溢生物科技有限公司；FA114A 0880電子分析天平 上海奔普儀器科技有限公司；ZetaPALS激光粒度儀 美國Brookhaven公司；JEM-2100透射顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；IRAffitiny-1傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；MICRO 220R高速低溫離心機(jī) 德國Hettich科學(xué)儀器公司；TCQF-3800氮?dú)獯蹈蓛x 北京通德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CoQ標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取20 mg純度為99.0%的CoQ，用無水乙醇溶解定容于100 mL的容量瓶中，配置濃度為0.2 mg/mL的CoQ乙醇溶液，并將其作為母液。從母液中分別移取3.125、6.250、9.375、12.50、15.625 mL體積至 25 mL容量瓶中，無水乙醇定容并混合均勻，得到濃度梯度分別為 0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過液相色譜HPLC測(cè)定CoQ的濃度和峰面積之間的關(guān)系。HPLC進(jìn)樣操作條件為：色譜柱為Symmetry C（250 mm×4.6 mm，5 μm；美國 Waters公司）柱；流動(dòng)相甲醇∶乙醇（V/V，10:90）；流速1 mL/min；檢測(cè)波長 275 nm；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。以CoQ濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性擬合方程為：Y=25961X-85.55，=0.9995，線性范圍為 0.025～0.125 mg/mL。

1.2.2 CoQ納米乳的制備 以30 mg CoQ于紅松籽油中加熱至完全溶解為油相，以0.35 g表面活性劑大豆卵磷脂和0.05 g助表面活性劑無水乙醇于蒸餾水中加熱至完全溶解為水相，水相和油相混合后于高速勻漿機(jī)以8000 r/min勻漿3 min，得到初乳液，將得到的初乳液以均質(zhì)壓力800 bar，循環(huán)次數(shù)為6次，進(jìn)行高壓均質(zhì)，得到CoQ納米乳。將30 mg CoQ溶解于生理鹽水中，得到CoQ混懸液。

以0.12 g紅松籽油為油相，以0.35 g表面活性劑大豆卵磷脂和0.05 g助表面活性劑無水乙醇于蒸餾水中加熱至完全溶解為水相，水相和油相混合后于高速勻漿機(jī)以8000 r/min勻漿3 min，得到初乳液，將得到的初乳液以均質(zhì)壓力800 bar，循環(huán)次數(shù)為6次，進(jìn)行高壓均質(zhì)，得到空白納米乳。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 固定CoQ與混合表面活性劑質(zhì)量比為3:30，CoQ和紅松籽油的質(zhì)量比為1:4，均質(zhì)壓力為800 bar，循環(huán)次數(shù)為6次。在上述工藝條件下，以平均粒徑和PDI為考察指標(biāo)，分別探討CoQ與混合表面活性劑質(zhì)量比3:10、3:20、3:30、3:40、3:50；CoQ與紅松籽油質(zhì)量比 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7；均質(zhì)壓力 400、600、800、1000、1200 bar；循環(huán)次數(shù)3、6、9、12、15次，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇CoQ與混合物表面活性劑（大豆卵磷脂和無水乙醇）的質(zhì)量比、CoQ與紅松籽油的質(zhì)量比、均質(zhì)壓力和循環(huán)次數(shù)4因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)CoQ納米乳的粒徑參數(shù)工藝進(jìn)行優(yōu)化，如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experiment factor and level

1.2.5 粒徑和多分散系數(shù)的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)激光散射（Dynamic light scattering，DLS），使用的儀器為ZetaPALS激光粒度儀，測(cè)試溫度為25 ℃，測(cè)試角度為90°，平衡條件為90 s，測(cè)定結(jié)果以平均粒徑和多分散系數(shù)（Polydispersity Index，PDI）為指標(biāo)。將納米乳的稀釋液進(jìn)行測(cè)定，待測(cè)樣品用去離子水稀釋200倍，稀釋成透明狀態(tài)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.6 包封率的測(cè)定 將1 mL CoQ納米乳稀釋10倍，取稀釋液1 mL，渦旋2 min，超聲破乳10 min，5000 r/min離心10 min，得到CoQ破乳液。上清液0.22 μm濾膜過濾后，取20 μL進(jìn)行分析，根據(jù)所得峰面積計(jì)算出總的CoQ量（W）。

將1 mL CoQ納米乳稀釋10倍，取稀釋液1 mL，置于超濾管內(nèi)室，4 ℃條件下5000 r/min離心20 min，將外室的濾液用乙醇定容至1 mL，0.22 μm濾膜過濾后，取20 μL進(jìn)行分析，根據(jù)所得峰面積計(jì)算出CoQ量（W）。

根據(jù)公式（1），計(jì)算得到包封率（Encapsulation efficiency，EE）：

1.2.7 透射電鏡（Transmission electron microscope，TEM）的測(cè)定 根據(jù)最優(yōu)配方得到的CoQ納米乳，稀釋50倍，滴加到銅網(wǎng)表面，用濾紙吸取多余的液體，用磷鎢酸負(fù)染2 min，濾紙吸取多余液體，自然晾干，用透射電鏡觀察CoQ納米乳的微觀形貌。

1.2.8 傅立葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）測(cè)定 采用IRAffitiny-1傅立葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）進(jìn)行紅外光譜分析。采用KBr壓片法對(duì)CoQ原藥、冷凍干燥后的空白納米乳和CoQ-NE在25 MPa壓力條件下進(jìn)行壓片，設(shè)置分辨率為4 cm，掃描范圍為 500～4000 cm。

1.2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)主要通過以下四個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其穩(wěn)定性。

加速離心實(shí)驗(yàn)：分別取15 mL納米乳液于離心管中，于轉(zhuǎn)速8000 r/min分別離心5、10、15、20 min，觀察樣品是否分層，以平均粒徑和PDI作為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

常溫靜止穩(wěn)定試驗(yàn)：將15 mL納米乳液儲(chǔ)存室溫下，分別于30、60、90和120 d取出樣品，以平均粒徑和PDI作為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

低溫靜置穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)：分別將5份15 mL的納米乳放入4 ℃冰箱中分別冷處理20、40、60、80和100 min，以平均粒徑和PDI作為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

凍融升溫穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)：分別將6份15 mL的納米乳放入不同溫度-20、-10、0、10、20和 30 ℃ 的條件下放置3 h，以平均粒徑和PDI作為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.10 體外釋放實(shí)驗(yàn) 采用透析袋法對(duì)藥物的體外釋放行為進(jìn)行考察，以300 mL 0.5%十二烷基硫酸鈉溶液（pH=6.8）為溶出介質(zhì)，在溫度37 ℃條件下于燒杯中攪拌振蕩，轉(zhuǎn)速為50 r/min。分別精密量取適量的CoQ混懸液和CoQ-NE（相當(dāng)于CoQ10 mg）置于事先處理過的透析袋（MWCO：3500 g/mol）中，并捆扎好兩側(cè)，置于溶出介質(zhì)中，分別于10、20、30、60、90、120、180、240 min吸取溶出介質(zhì) 5 mL，同時(shí)向燒杯中補(bǔ)加相同體積的空白介質(zhì)，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，吸取濾液20 μL，按1.2.1色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算CoQ的累積釋放量。

1.2.11 大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

1.2.11.1 動(dòng)物分組及血樣采集 SD雄性大鼠12只，體重300～325 g，實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于單獨(dú)的金屬籠中，室溫 25±1 ℃，相對(duì)濕度 50%±5%，明暗循環(huán)12 h，大鼠隨意喂食食物和水。

給藥前禁食12 h后，將大鼠隨機(jī)分成兩組，每組六只。兩組大鼠分別灌胃60 mg/kg CoQ混懸液（分散于0.9%生理鹽水中）和CoQ-NE。給藥后于 0.08、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0和 24.0 h通過眼眶穿刺取血收集全血樣本，將血液置于含有肝素鈉的抗凝管中，立即在4 ℃下以12000 r/min離心10 min，血漿樣品在-20 ℃下儲(chǔ)存直至分析。

1.2.11.2 血漿中CoQ含量的測(cè)定 大鼠血漿分析：在1.0 mL離心管中混合80 μL大鼠血漿、300 μL甲醇和 20 μL 內(nèi)標(biāo) CoQ（20 μg/mL）。將混合物渦旋3 min，以10000 r/min離心10 min，收集上清液并在真空termovap樣品濃縮器下干燥，將殘留物溶解在100 μL流動(dòng)相中。將20 μL試樣注入HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析，CoQ與CoQ的峰面積比值用于CoQ的定量。按照上述“1.2.1”完成色譜進(jìn)樣操作。

1.2.11.3 大鼠血漿分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及方法學(xué)驗(yàn)證 CoQ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：精密稱取CoQ標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置50 mL容量瓶中，用色譜級(jí)乙醇定容，得濃度100 μg/mL CoQ儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱中保存，臨用時(shí)稀釋至所需濃度。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的配制：精密稱取CoQ標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，置50 mL容量瓶中，用色譜級(jí)乙醇定容，得到濃度20 μg/mL CoQ儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱中保存，臨用時(shí)稀釋至所需濃度。

首先配制不同濃度的血漿生物樣品，精密移取大鼠空白血漿80 μL，分別加入系列濃度CoQ對(duì)照品溶液 20 μL，得一系列濃度梯度，20、10、5、0.6250、0.3125和0.0391 μg/mL的血漿生物樣品，然后血漿生物樣品處理方法按“1.2.11.2”進(jìn)行處理，色譜進(jìn)樣條件按“1.2.1”進(jìn)行分析，記錄每個(gè)血漿樣品濃度記為C。

回收率實(shí)驗(yàn)：配制5份CoQ濃度為低（0.0391 μg/mL）、中（0.6250 μg/mL）以及高（10 μg/mL）的血漿生物樣品。按“1.2.11.2”進(jìn)行處理，按“1.2.1”進(jìn)樣分析，記錄CoQ和CoQ內(nèi)標(biāo)的峰面積比值。

精密度實(shí)驗(yàn)：在SD大鼠空白血漿80 μL中加入20 μL的CoQ對(duì)照品溶液，渦旋混勻，得到低（0.0391 μg/mL）、中（0.6250 μg/mL）、高（10 μg/mL）濃度的血漿生物樣品，按“1.2.11.2”進(jìn)行處理，-20℃冷藏。每個(gè)濃度6份，連續(xù)三天每天同時(shí)按“1.2.1”色譜條件分析，記錄CoQ和CoQ內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用正交設(shè)計(jì)助手II V3.1軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，使用DAS 2.0 軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析。每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)置3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示，采用Origin 2019b進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖像處理并生成圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

如圖2a所示，隨著CoQ與混合表面活性劑質(zhì)量比的變化，平均粒徑呈先減小后增加的趨勢(shì)，質(zhì)量比為3:30時(shí)平均粒徑為最小值298.1 nm，多分散系數(shù)為0.153。這可能是因?yàn)楸砻婊钚詣┛梢暂^好的降低油/水界面張力，形成界面膜而促使納米乳的形成。而在納米乳液形成過程中加入適量的助表面活性劑，可以降低界面膜彎曲應(yīng)力，使界面膜獲得足夠彈性，從而促進(jìn)納米乳的形成，使納米乳液粒徑更小，更加穩(wěn)定。Kaci等研究發(fā)現(xiàn)，添加表面活性劑會(huì)得到粒徑更小的納米乳液，乳化率大大提高，與本文研究結(jié)果相似。因此，確定CoQ和混合表面活性劑的質(zhì)量比為3:30。

圖2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of single factor experiments

由圖2b所示，隨著CoQ和紅松籽油的質(zhì)量比的增加，平均粒徑整體呈逐漸減小的趨勢(shì)，在質(zhì)量比為1:7時(shí)，平均粒徑為138.8 nm。而多分散系數(shù)呈先減小后增大的變化趨勢(shì)，在質(zhì)量比為1:4時(shí)PDI為0.098。這可能是因?yàn)?，隨著油相比例的增加，藥物在油相中的溶解性提高，油相在水相中的分散更好，有利于納米乳的形成，平均粒徑逐漸減小。但是當(dāng)油相比例過高，粘度增加，反而不利于納米乳的形成，影響納米乳的均一性。Kommuru等研究不同組成和比例的油脂對(duì)納米乳的影響，當(dāng)油脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，納米乳平均粒徑和分散性最小，納米乳的穩(wěn)定性和生物利用度最高。因此，綜合平均粒徑和PDI的整體變化，最終確定CoQ和紅松籽油的質(zhì)量比為1:4。

由圖2c所示，隨著均質(zhì)壓力的增加，均質(zhì)壓力對(duì)平均粒徑和多分散系數(shù)有顯著影響。平均粒徑隨著均質(zhì)壓力的增大呈先減小后增加的趨勢(shì)，在均質(zhì)壓力為800 bar時(shí)，平均粒徑為182.5 nm，多分散系數(shù)為0.155，當(dāng)均質(zhì)壓力上升到1000 bar和1200 bar時(shí)，平均粒徑增大到203.7 nm和248.2 nm，這是可能因?yàn)殡S著均質(zhì)壓力的增大，體系溫度升高，納米乳液顆粒發(fā)生聚集，粒徑隨后又增大，PDI也增大。因此選擇均質(zhì)壓力為800 bar為最佳值。

由圖2d所示，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，平均粒徑呈先減小后增加而后又減小的趨勢(shì)，循環(huán)次數(shù)為6次時(shí)，平均粒徑和多分散系數(shù)分別為200.4 nm，PDI為 0.165。循環(huán)次數(shù)為9、12、15次時(shí)，平均粒徑分別增加到212.4、243.8、218.5 nm。過多的循環(huán)次數(shù)導(dǎo)致體系溫度升高，納米乳顆粒開始發(fā)生聚集，平均粒徑變大，PDI也有一定變大趨勢(shì)，出現(xiàn)粒徑不均一的現(xiàn)象。因此選擇循環(huán)次數(shù)為6次為最佳值。

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表1為A、B、C、D四因素三水平試驗(yàn)的正交設(shè)計(jì)編號(hào)，正交軟件設(shè)計(jì)了9組試驗(yàn)，試驗(yàn)正交結(jié)果如下表2所示。在正交試驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)，9組正交試驗(yàn)的PDI值均表明納米乳具有良好的均一性，為了下一步統(tǒng)計(jì)學(xué)上S值、K值及極差R計(jì)算方便，因此，本正交試驗(yàn)只以平均粒徑為考察指標(biāo)。從表2可以得出，CoQ納米乳的粒徑范圍在151.4 nm到228.8 nm。對(duì)正交軟件得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過極差R確定因素的主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，即四個(gè)因素影響的主次順序分別為CoQ與紅松籽油的質(zhì)量比，循環(huán)次數(shù)，CoQ與混合表面活性劑的質(zhì)量比，均質(zhì)壓力。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，最佳組合為ABCD，分別為CoQ和混合表面活性劑的質(zhì)量比3:40，CoQ和紅松籽油的質(zhì)量比為1:4，均質(zhì)壓力為800 bar，循環(huán)次數(shù)為6次。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)及包封率的測(cè)定

通過單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)，得到的最佳參數(shù)為：CoQ與混合表面活性劑的質(zhì)量比3:40，CoQ與紅松籽油的質(zhì)量比為1:4，均質(zhì)壓力為800 bar，循環(huán)次數(shù)為6次。為了驗(yàn)證最佳條件下制備的平均粒徑，在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到平均粒徑為 150.30±1.43 nm，多分散系數(shù)為 0.234±0.012的CoQ-NE，達(dá)到預(yù)期。

包封率的測(cè)定：納米乳液包封率高低與活性物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)、制備方法等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用超濾離心法檢測(cè)包封率。CoQ-NE的包封率為87.48%±0.59%，表明大部分CoQ已被成功包裹到納米結(jié)構(gòu)載體中。這與研究酚類化合物納米乳的包封率所得到的結(jié)果相似。

2.4 TEM的測(cè)定

圖3是1 μm 和500 nm尺寸下的TEM微觀形貌，如圖所示，CoQ-NE呈圓形，大小均勻，無粘連，成型性好。CoQ-NE的形態(tài)與Fathordoobady等研究的納米乳液觀察到的形態(tài)相似。此外，TEM形貌觀察的圖像與Wu等研究使用丙泊酚的納米乳液非常相似。

圖3 CoQ10納米乳形貌圖Fig.3 TEM morphology of CoQ10 nanoemulsion

2.5 FT-IR測(cè)定

采用FT-IR探討CoQ納米乳液中分子間相互作用的形式。如圖4所示，從上到下分別為CoQ-NE、空白納米乳和原料藥CoQ的紅外圖譜。CoQ在2960 cm是乙烯基的振動(dòng)峰，2850 cm是烷基伸縮振動(dòng)峰，1260 cm是醚基團(tuán)的伸縮振動(dòng)峰。從CoQ-NE中還可以找到相應(yīng)的特征峰，但發(fā)生了偏移，說明CoQ只是分散在載體中，并沒有在載體化后發(fā)生化學(xué)性質(zhì)變化。CoQ-NE中并沒有出現(xiàn)和CoQ在同樣波段之間的特征峰，且與空白納米乳液的紅外譜圖基本一致，這說明CoQ被完全包埋在納米乳液體系當(dāng)中。這與椰子油中含有姜黃素的納米乳劑的研究結(jié)果相似。

圖4 CoQ10原藥、CoQ10-NE和空白納米乳的紅外光譜圖Fig.4 Fourier infrared spectrum of CoQ10, CoQ10-NE and blank nanoemulsion

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

如圖5a所示，與初始納米乳液相比，平均粒徑隨著離心時(shí)間的變化沒有發(fā)生顯著變化（＞0.05），因此體系是穩(wěn)定的，離心后也沒有發(fā)生明顯的分層現(xiàn)象，表明納米乳液具有良好的穩(wěn)定性。

如圖5b所示，在室溫下，隨著考察天數(shù)的延長，納米乳液的平均粒徑雖有略微的上浮，由150.4 nm到161.9 nm，但整體沒有發(fā)生顯著變化（＞0.05），表明納米乳隨著靜置時(shí)間的變化保持良好的穩(wěn)定性。

為了考察在較低的溫度下，納米乳液仍具有良好的穩(wěn)定性，將納米乳液放置在低溫4 ℃下保存，對(duì)其平均粒徑和PDI進(jìn)行測(cè)定。如圖5c所示，與初始納米乳液相比，隨著考察天數(shù)的變化，平均粒徑和PDI沒有發(fā)生顯著變化（＞0.05），說明納米乳液穩(wěn)定性良好。

考察不同溫度下納米乳的穩(wěn)定性對(duì)當(dāng)儲(chǔ)存溫度超過正常室溫儲(chǔ)存的突發(fā)狀況有很大的意義。如圖5d所示，溫度從-20 ℃到30 ℃變化，平均粒徑?jīng)]有顯著變化（＞0.05）。尤其在納米乳冷凍后，在室溫下放置恢復(fù)到原來的狀態(tài)后，平均粒徑和PDI均沒有發(fā)生顯著變化（＞0.05）。因此，在不同的溫度下，納米乳液具有良好的穩(wěn)定性。觀察到的結(jié)果與先前的研究發(fā)現(xiàn)一致，即納米乳液可穩(wěn)定長達(dá)數(shù)月。

圖5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of stability experiments

納米乳的穩(wěn)定性取決于脂類、乳化劑和水體系的性質(zhì)和濃度。乳化劑在液滴周圍形成一層膜，降低界面能，為納米乳的聚集提供機(jī)械屏障，從而提高納米乳的穩(wěn)定性。Chutia等在研究高壓均質(zhì)得到的淀粉納米顆粒用于開發(fā)類胡蘿卜素富集粉納米乳中，發(fā)現(xiàn)富含類胡蘿卜素的納米乳劑對(duì)熱和凍融處理穩(wěn)定。同時(shí)，開發(fā)的納米乳液在儲(chǔ)存期間顯示出良好的物理穩(wěn)定性，與本文的研究結(jié)果相似。

2.7 體外釋放實(shí)驗(yàn)

通過HPLC檢測(cè)CoQ混懸液和CoQ-NE的體外累積釋放量。如圖6所示，CoQ-NE累計(jì)釋放量高于混懸液，30 min內(nèi)CoQ混懸液的累積釋放量分別為4.17%、5.32%、8.30%，CoQ-NE的累積釋放量分別為46.61%、51.15%、52.17%。兩者在30 min內(nèi)都呈上升趨勢(shì)，CoQ-NE上升更為明顯。60 min時(shí)，CoQ-NE的累積釋放量達(dá)到63.41%，而混懸液的只有11.83%，隨后兩者累積釋放量均緩慢上升，120 min后基本保持不變。在300 min時(shí)，CoQ混懸液的累積釋放量為18.01%，CoQ-NE為84.66%，是混懸液的4.7倍。這可能是藥物的釋放量與溶解度和比表面積有關(guān)，納米乳的比表面積較大以及表面活性劑的存在均提高了藥物的釋放量。這與陳家鈴等研究發(fā)現(xiàn)的高壓均質(zhì)制備水楊酸納米乳的體外釋放量顯著提高的結(jié)果相似。

圖6 體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of in vitro release experiments

2.8 大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.8.1 體內(nèi)分析方法的建立結(jié)果 血漿中CoQ的濃度測(cè)定采用內(nèi)標(biāo)法。選擇內(nèi)標(biāo)法是為了抵消上樣體積、流動(dòng)相以及檢測(cè)器的影響。操作過程中樣品和內(nèi)標(biāo)物混合一起注入色譜柱，因此，只要混合溶液中被測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)的量的比值是恒定的，上樣體積的變化不影響定量的結(jié)果。本文選擇和CoQ保留時(shí)間接近但不重疊的CoQ為內(nèi)標(biāo)，它與CoQ是同系物，且具有一致的色譜行為和相應(yīng)特征。在色譜分析條件下，CoQ內(nèi)標(biāo)物與樣品各組分充分分離。方法專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖7表明，內(nèi)標(biāo)峰CoQ和CoQ峰型良好，兩者的保留時(shí)間分別為9.86和12.37 min，且血漿中內(nèi)源物質(zhì)不干擾實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。

圖7 方法專屬性考察Fig.7 Result of chromatographic method specificity investigation

標(biāo)準(zhǔn)曲線以待測(cè)物濃度C為橫坐標(biāo)，待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值R為縱坐標(biāo)，得到直線回歸方程為 R=0.7307C-0.041，=0.9996，表明 CoQ在0.0391～20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度實(shí)驗(yàn)表明，低、中、高濃度的日間精密度分別為5.15%、2.35%、1.33%，日內(nèi)精密度分別為7.80%、2.65%、1.80%?；厥諏?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低、中、高濃度的回收率分別為99.23%、101.73%、100.67%。以上結(jié)果均表明，該方法靈敏度好、準(zhǔn)確度高，符合方法學(xué)要求。

2.8.2 藥時(shí)曲線的繪制 如圖8所示，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，CoQ-NE組的血藥濃度均高于CoQ混懸液組。CoQ-NE和CoQ混懸液組的血漿濃度分別在0～2.0 h和0～4.0 h之間趨于增加，屬于吸收分布過程。CoQ混懸液的達(dá)到最大血藥濃度的時(shí)間T是 CoQ-NE的 2倍，可知 CoQ-NE在體內(nèi)更快達(dá)到峰濃度。CoQ混懸液組的濃度從4.0～24.0 h趨于下降，而CoQ-NE組的濃度從2.0～24.0 h趨于下降，屬于代謝排泄過程。CoQ混懸液組4.0 h時(shí)血樣中 CoQ濃度為 0.850±0.024 μg/mL，CoQ-NE 組 2.0 h時(shí)為 2.450±0.040 μg/mL。CoQ-NE 組的最大血藥濃度C是CoQ混懸液的2.80倍，說明CoQ-NE在體內(nèi)的血藥濃度更高。

圖8 CoQ10-NE和CoQ10混懸液在體內(nèi)吸收曲線的比較Fig.8 Comparison of in vivo absorption profiles of CoQ10-NE and CoQ10 suspension

2.8.3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析 本實(shí)驗(yàn)通過DAS 2.0軟件對(duì)大鼠藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行房室模型擬合，所得的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表3所示。依照擬合度及赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike's Information Criterion，AIC）進(jìn)行模型判斷，擬合度越接近1、AIC越小，模型擬合越好。由軟件分析可知，混懸組和納米乳組的大鼠藥代動(dòng)力學(xué)均屬于二室模型，權(quán)重系數(shù)分別為1和1/cc。藥時(shí)曲線下面積（AUC）是判斷藥物吸收程度的重要指標(biāo)之一。CoQ-NE的藥時(shí)曲線下面積 A UC是 CoQ混懸液組的 3.25倍，CoQ-NE組藥時(shí)曲線下面積AUC更大，這表明CoQ-NE生物利用度明顯提高，吸收更好。對(duì)于二室模型來說，V1和V2分別表示中央室和外周室分布容積，CL表示從中央室向外藥物的清除率，F(xiàn)為生物利用度。從藥物在體內(nèi)的平均滯留時(shí)間M RT和清除率CL/F可以看出，CoQ-NE的 M RT是 CoQ的 1.14倍，CoQ混懸組的CL/F是CoQ-NE的3.04倍。說明CoQ-NE比CoQ在體內(nèi)滯留時(shí)間更長，清除速率更慢。綜上所述，這些不同可能是由于藥物被納米乳負(fù)載后，納米乳粒徑變小，比表面積變大，且被負(fù)載的藥物結(jié)構(gòu)良好，給藥后，藥物釋放量提高，藥物與胃腸壁接觸面積變大，在體內(nèi)作用時(shí)間變長，更容易被機(jī)體吸收，生物利用度顯著提高。統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示，以上參數(shù)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Belhaj等制備的一種由鮭魚油、鮭魚卵磷脂、CoQ組成的納米乳液，和大豆油和CoQ組成的油性混合物相比較，納米乳液的生物利用度提高了2倍，這與本文得出相似的結(jié)論。

表3 灌胃給藥CoQ10-NE和CoQ10混懸液后CoQ10的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=6）Table 3 Pharmacokinetic parameters of CoQ10 after intragastric administration of CoQ10-NE and CoQ10 suspension (n=6)

3 結(jié)論

本文以CoQ為原料藥，采用高壓均質(zhì)技術(shù)制備基于紅松籽油CoQ的納米乳，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交優(yōu)化確定CoQ-NE的最佳工藝。對(duì)最佳工藝條件下制備得到的CoQ-NE分別進(jìn)行TEM、包封率實(shí)驗(yàn)、FT-IR、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、體外釋放行為等表征。同時(shí)，對(duì)CoQ-NE在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在CoQ與混合表面活性劑的質(zhì)量比3:40，CoQ與紅松籽油的質(zhì)量比為1:4，均質(zhì)壓力為800 bar，循環(huán)次數(shù)為6次的最佳工藝條件下，得到平均粒徑為150.30±1.43 nm，多分散系數(shù)為 0.234±0.012的 CoQ-NE。在 1 μm和500 nm條件下，CoQ-NE大小均勻，成型性良好；FT-IR實(shí)驗(yàn)表明CoQ被完全包裹在納米乳液中且CoQ沒有在載體化后發(fā)生化學(xué)性質(zhì)的改變；CoQ-NE的包封率為87.48%±0.59%，表明大部分CoQ已被成功包裹到納米結(jié)構(gòu)載體中；此外，在加速離心和儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)中，CoQ-NE的平均粒徑和PDI變化不顯著（＞0.05），CoQ-NE維持了良好的穩(wěn)定性；同時(shí)，CoQ-NE的體外累積釋放量高達(dá)84.66%，約是CoQ混懸液的4.7倍，累計(jì)釋放量顯著提高。大鼠藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明：由最高血藥濃度C和達(dá)到最高血藥濃度所需時(shí)間T可知，CoQ-NE組的C比CoQ混懸組提高了 1.80倍，T縮短了1倍，這表明納米乳組比混懸組更快達(dá)到最大血藥濃度。兩組分別經(jīng)灌胃給藥后，CoQ-NE組的體內(nèi)平均滯留時(shí)間MRT和藥時(shí)曲線下面積AUC相對(duì)于CoQ混懸組均顯著提高（＜0.05），結(jié)果表明，CoQ-NE較混懸液更易被吸收，且在體內(nèi)的作用時(shí)間更長，生物利用度顯著提高。本研究為探索CoQ新劑型的研發(fā)及提高其生物利用度奠定了良好的基礎(chǔ)。