枯草芽孢桿菌拮抗菌的篩選鑒定及其抑菌特性研究

郭麗丹，張曉妍，周婉婷，張秀勤，陳雨瀅，楊梓璐，汪立平,2,3,

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；

2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

枯草芽孢桿菌（）是一種革蘭氏陽性菌，具有極強(qiáng)的抗逆性，一般的巴氏殺菌難以將其完全殺死。它作為一種常見的食品腐敗菌，可以引起食品的腐敗變質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致一些食源性疾病，甚至?xí)斐墒澄镏卸尽，F(xiàn)有的應(yīng)用于食品防腐領(lǐng)域的化學(xué)防腐劑，有著很大的潛在風(fēng)險(xiǎn)，國(guó)家食品防腐劑標(biāo)準(zhǔn)（GB 2760-2014）也對(duì)其使用進(jìn)行了嚴(yán)格的限制，這進(jìn)一步增加了食品防腐的難度。天然的生物防腐劑作為一種安全、高效的新型防腐劑，其相關(guān)研究已成為食品工業(yè)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

現(xiàn)有研究表明，生存于特殊生態(tài)環(huán)境的乳酸菌能夠分泌具有廣譜抑菌性的抗菌肽，它是一種具有抗菌活性的小分子多肽類物質(zhì)，其對(duì)常見腐敗菌和病原菌均具有明顯的抑制作用，且多具有良好的熱穩(wěn)定性，不會(huì)對(duì)人體造成危害，不易導(dǎo)致耐藥性。目前，廣泛應(yīng)用的乳酸菌抗菌肽為乳酸鏈球菌素（Nisin），其已被50多個(gè)國(guó)家允許添加到食品當(dāng)中，并且其也是唯一被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可的抗菌肽。近年來，雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)于乳酸菌抗菌肽的研究眾多，但鮮有研究關(guān)注于其對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用，并且隨著由枯草芽孢桿菌引起的食品污染事件的日漸增加，開發(fā)出一種對(duì)枯草芽孢桿菌具有抑制作用的新型抗菌肽就顯得尤為重要。

產(chǎn)抗菌肽乳酸菌主要來自發(fā)酵食品、胃腸道、海洋、土壤等，其中發(fā)酵泡菜富含大量乳酸菌，可以保持長(zhǎng)時(shí)間不變質(zhì)，乳酸菌產(chǎn)的抗菌肽起到了相當(dāng)大的作用。本研究以各地泡菜為原料，篩選出一株對(duì)枯草芽孢桿菌有強(qiáng)烈抑制作用的產(chǎn)抗菌肽乳酸菌，采用乙酸乙酯萃取法得到抗菌肽粗提物，并對(duì)其進(jìn)行了抑菌特性的研究。本實(shí)驗(yàn)為該乳酸菌菌株的開發(fā)利用和該抗菌肽后續(xù)的深入研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

農(nóng)家自制泡菜樣品 取自山東、上海、四川眉山、安徽、武漢、云南等地區(qū)；韓村天和腌制蘿卜樣品 山東威海；春順醬腌菜 山東青島；樂江金友邦酸菜 四川成都；巧媳婦腌制蘿卜菜 四川眉山；蜀大娘腌制蘿卜菜 四川綿陽；如意島泡菜 遼寧鐵嶺，樣品貯藏于4℃冰箱備用。

枯草芽胞桿菌（strain B39） 鎮(zhèn)沅松子地綠色食品有限公司的脹袋泡菜樣品分離所得；MRS肉湯干粉培養(yǎng)基 HKM；胰蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸氫二鉀等培養(yǎng)基成分和無水碳酸鈣 國(guó)藥集團(tuán)；溶菌酶（≥2000 U/mg）、溴化乙啶（EB）、TAE 緩沖液、瓊脂糖、Ezup柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒、PCR相關(guān)試劑 上海生工；BCA蛋白濃度試劑盒北京索萊寶；革蘭氏染色試劑盒 比克曼生物。

7200型紫外可見分光光度計(jì) UNIC；A300型梯度PCR儀 LongGene；H2050R臺(tái)式真空冷凍離心機(jī) 湖南湘儀；RV8V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 IKA；JY-SCZ2+電泳儀 北京君意東方；Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)BIO-RAD；UV-6100紫外全波長(zhǎng)掃描儀 上海美譜達(dá)儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)抗菌肽乳酸菌的篩選

1.2.1.1 菌株初篩 使用無菌生理鹽水對(duì)泡菜樣品進(jìn)行梯度稀釋，制成10、10和10菌懸液，各取100 μL注入含2%碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基無菌板中，搖勻后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。然后，對(duì)產(chǎn)生溶鈣圈的菌株進(jìn)行多次篩選和純化，選取單菌落接種到10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，置于搖床中培養(yǎng)（37 ℃, 150 r/min, 24 h），得到種子液。種子液以2%接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，上述條件培養(yǎng)后得發(fā)酵液。將發(fā)酵液進(jìn)行離心（8000 r/min, 4 ℃,15 min）獲得上清液，使用0.22 μm的水濾膜對(duì)上清液進(jìn)行過濾，獲得無細(xì)胞發(fā)酵上清液（Cell free supernatants，CFS）備用。

1.2.1.2 菌株復(fù)篩 由于CFS中含有機(jī)酸、過氧化氫、抗菌肽等抑菌物質(zhì)，可能對(duì)初篩結(jié)果造成影響，因此該研究通過排除有機(jī)酸、過氧化氫的影響來進(jìn)行復(fù)篩。首先，將CFS等分為3份，一份不做任何處理；一份用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5，以排除有機(jī)酸的影響；一份在排除有機(jī)酸后，加入過氧化氫酶，調(diào)節(jié)pH至7.5，37 ℃恒溫水浴4 h后，將pH調(diào)回6.5，以排除過氧化氫的影響。將三份CFS溶液置于4 ℃保存過夜，備用。

本實(shí)驗(yàn)采用雙層瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩。首先，將枯草芽胞桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，置于搖床（37 ℃, 150 r/min）中培養(yǎng) 12 h，獲得 10CFU/mL 指示菌菌懸液；然后，向50 ℃，含0.75% 瓊脂的LB培養(yǎng)基中加入1%（v/v）的指示菌菌懸液，將兩者混勻后倒在素瓊脂上，待培養(yǎng)基凝固后，使用打孔器均勻打下直徑7 mm的圓孔，向每孔注入50 μL上述處理過的3種CFS溶液，在4 ℃條件下擴(kuò)散2 h后，置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 采用平板劃線法在MRS固體平板上多次純化菌株，并觀察其菌落形態(tài)，根據(jù)單菌落形態(tài)特征進(jìn)行初步判斷后，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄其染色情況和菌體形態(tài)。

1.2.2.2 生理生化特征 根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法，采用吲哚實(shí)驗(yàn)，過氧化氫實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、有無鞭毛以及碳水化合物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等對(duì) 1.2.1.2 抑菌實(shí)驗(yàn)中抑菌圈最大的乳酸菌菌株，進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 基因組DNA提?。喝? mL菌液置于1.5 mL離心管中，按試劑盒的操作步驟提取總DNA。以總DNA作為模板，以27F（5'-A GAGAGTTTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTAC TTGTTACG ATT-3'）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃1 min，共 35 個(gè)循環(huán)，總體系為 25 μL。將瓊脂糖凝膠電泳膠條放入EB染色液中染色20 min，觀察電泳條帶，最后將擴(kuò)增后的產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

16S rDNA序列分析：首先在NCBI使用BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，找到同源性近的模式菌株序列；然后使用MAGE-X軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。最后，向GenBank數(shù)據(jù)庫提交菌株的16S rDNA序列，獲得登錄號(hào)。

1.2.3 抗菌肽的粗提方法研究 抗菌肽常以微量級(jí)別存在于野生環(huán)境當(dāng)中，粗提方法的選擇和濃縮是純化抗菌肽的關(guān)鍵。本研究以strain B39（10CFU/mL）為指示菌，采用1.2.1.2中的雙層瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌效果。以篩選出的菌株的CFS溶液500 mL作為原料進(jìn)行抗菌肽的粗提，濃縮40倍后，探究了有機(jī)溶劑萃取法、硫酸銨沉淀法等方法的粗提效果。

1.2.3.1 有機(jī)溶劑萃取法 根據(jù)相似相容原理，使用乙酸乙酯、正丁醇對(duì)CFS進(jìn)行萃取，以得到抗菌肽粗提取物。首先，兩種有機(jī)溶劑分別與CFS溶液按1:1的比例充分混合后，提取有機(jī)相溶液，然后在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑，保留沉淀。用 5 mmol/L PBS（pH6）重懸，最終體積濃縮40倍，獲得抗菌肽粗提物溶液，置于4 ℃下，備用。

1.2.3.2 醇沉水提法 采用醇沉水提法提取抗菌肽。首先，將CFS在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（45 ℃）中濃縮10倍，向濃縮液中加入95%無水乙醇并攪拌均勻，保證最終溶液中無水乙醇的濃度為75%，然后在4 ℃ 下醇沉 12 h。最后，離心（4 ℃, 8000 r/min, 10 min）保留上清液，并在45 ℃條件下旋蒸濃縮4倍獲得抗菌肽粗提物溶液，置于4 ℃下，備用。

1.2.3.3 硫酸銨沉淀法 根據(jù)4 ℃下硫酸銨飽和度表，向CFS中添加硫酸銨粉末至飽和度為60%、70%、80%、90%、100%。冰水浴攪拌溶解后，在4 ℃條件下，攪拌過夜。然后，離心（8000 r/min, 30 min）收集沉淀，向沉淀中加入5 mmol/L PBS（pH6），濃縮40倍，獲得抗菌肽粗提物。

1.2.4 抗菌肽的特性研究

1.2.4.1 全波長(zhǎng)掃描 使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定抗菌肽溶液濃度，然后用無菌蒸餾水配制0.5 mg/mL經(jīng)乙酸乙酯萃取的抗菌肽粗提物溶液，于200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行紫外光譜掃描分析。

1.2.4.2 抗菌肽產(chǎn)量與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系 將所得菌株按接種量2%（v/v）接種于MRS培養(yǎng)基，在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)24 h，每2 h取一次樣，通過記錄OD值，完成菌株生長(zhǎng)曲線的繪制，同時(shí)記錄pH的變化。使用strain B39作為指示菌，采用1.2.1.2中的雙層瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)各階段抑菌效果，并繪制抑菌活性曲線。通過繪制菌體生長(zhǎng)曲線與抑菌活性曲線，評(píng)價(jià)抗菌肽的產(chǎn)量與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系。

1.2.4.3 MIC的測(cè)定 采用二倍稀釋法測(cè)定抗菌肽對(duì)枯草芽胞桿菌的最小抑菌濃度（The minimum inhibitory concentration, MIC）。MIC 具體的測(cè)定方法如下：首先，將512 μg/mL純化的抗菌肽溶液用超純水進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋，以獲得不同濃度的稀釋液。然后，分別吸取不同濃度的稀釋液50 μL等體積添加到含strain B39懸浮液（10CFU/mL）的96孔板中，37 ℃下培養(yǎng)12 h。具有最小抑菌效果的稀釋液所對(duì)應(yīng)的濃度即為最小抑菌濃度MIC。

1.2.4.4 時(shí)間殺菌曲線的繪制 將抗菌肽加入到strain B39懸浮液的對(duì)數(shù)中期（OD=0.6）溶液中，獲得濃度為3 MIC的溶液, 以不加入抗菌肽的樣品作為空白對(duì)照。將含有抗菌肽的菌懸液在37 °C下培養(yǎng)12 h，每小時(shí)取一次樣，使用紫外-可見分光光度計(jì)在600 nm處記錄菌體生長(zhǎng)的變化，同時(shí)進(jìn)行平板菌落活菌計(jì)數(shù)（CFU/mL），樣品用無菌生理鹽水稀釋后，涂布PCA瓊脂板上，于37 ℃下培養(yǎng)12 h，觀察并統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上所測(cè)數(shù)據(jù)均設(shè)置3個(gè)平行，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式呈現(xiàn)。利用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分別對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，Origin 9.0 軟件繪制主成分圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)抗菌肽乳酸菌的篩選

本研究共從泡菜樣品中分離得到168株菌株，在經(jīng)過篩選后，有8株菌株對(duì)枯草芽胞桿菌表現(xiàn)出明顯的抑制效果，不同菌株的抑制效果如表1所示。在排除有機(jī)酸的影響后，抑菌圈均有些許的減小，但仍具有顯著的抑菌活性。去除過氧化氫后，發(fā)酵液抑菌直徑?jīng)]有明顯變化。其中，WUH3具有最強(qiáng)的抑制效果，CFS抑菌圈直徑最大，在排除有機(jī)酸和過氧化氫的影響后，抑菌效果仍明顯，抑菌直徑可達(dá)25.13±0.10 mm。故選取WUH3作為目的菌株，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 優(yōu)勢(shì)菌對(duì)枯草芽胞桿菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of dominant bacteria on B.subtilis strain B39

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在 MRS 固體培養(yǎng)基上用劃線稀釋法分離乳酸菌菌株。將接種后的培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基表面形成的乳酸菌的形態(tài)，其結(jié)果如圖1所示，菌落顏色為白色，形狀為圓形，邊緣為全緣，凸起，菌落直徑在1～2 mm范圍內(nèi)。

圖1 WUH3的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological features of WUH3

2.2.2 生理生化特征 對(duì)菌株WUH3 進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，結(jié)果見表2。該菌株過氧化氫實(shí)驗(yàn)陰性、吲哚陰性、不產(chǎn)氣、無鞭毛、不運(yùn)動(dòng)、不液化明膠、不還原硝酸鹽；可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、乳糖和木糖。將鑒定結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》中對(duì)乳桿菌的生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果相對(duì)比，可初步鑒定所分離的菌株WUH3為乳桿菌屬。

表2 菌株WUH3生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain WUH3

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 如圖2所示，WUH3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳中于1000～2000 bp處形成1條清晰的擴(kuò)增條帶。以乳桿菌屬（spp.）中的模式菌株為參考菌，采用MAGE-X軟件構(gòu)建WUH3的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，WUH3與植物乳桿菌（）在同一分支，同時(shí)與戊糖乳桿菌（）親緣關(guān)系最近, 其次為植物乳桿菌阿根廷亞種（subsp.）。

圖2 菌株WUH316S rRNA基因的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Electrophoresis pattern of PCR products of strain WUH3 16S rRNA gene

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的WUH3系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of WUH3 based on 16S rRNA gene sequence

通過菌落形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，表明菌株WUH3為，已獲得其GeneBank數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)為MZ751052.1。

2.3 抗菌肽的粗提方法研究

為了濃縮并最大程度地保留WUH3 CFS中抑菌物質(zhì)的活性，本研究探索了不同的粗提方法。以strain B39為指示菌研究不同方法的粗提效果，其結(jié)果如表3所示。由表可知，乙酸乙酯的萃取效果最好，水相中僅有少部分抑菌活性物質(zhì)殘留，乙醇和正丁醇萃取過程中，抑菌物質(zhì)活性損失較大，且有機(jī)相中保留的活性較低。在飽和硫酸銨沉淀實(shí)驗(yàn)中，濃度為70%和80%時(shí)沉淀效果最好，但還有一大部分抑菌物質(zhì)殘留在上清液中，未被提取出來。綜合對(duì)比，抑菌物質(zhì)提取率最大的是有機(jī)溶劑乙酸乙酯萃取法，其最大程度地保留了抑菌物質(zhì)的活性，故本實(shí)驗(yàn)選擇乙酸乙酯萃取作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)抗菌肽的粗提方法。

表3 不同粗提方法處理CFS后保留的抑菌活性Table 3 Reserved antibacterial activity of CFS treated by different crude extraction methods

2.4 抗菌肽的特性研究

2.4.1 全波長(zhǎng)掃描 BCA蛋白濃度標(biāo)曲為y=1.5314-0.0032，=0.9996。對(duì)粗提得到的抗菌肽進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，其結(jié)果如圖4所示。WUH3所產(chǎn)抗菌肽在280 nm附近有單的強(qiáng)吸收峰，這是肽鍵在遠(yuǎn)紫外區(qū)特有的吸收特征。進(jìn)一步蛋白酶敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在經(jīng)蛋白酶處理過后，粗提物抑菌活性消失，說明該抑菌物質(zhì)具有蛋白類物質(zhì)的特性，故證明所得抗菌肽為一種蛋白或多肽類物質(zhì)。

圖4 L.plantarum WUH3所產(chǎn)抗菌肽粗提物的紫外全波長(zhǎng)掃描圖Fig.4 Ultraviolet full wavelength scanning of crude extracted AMP produced by L.plantarum WUH3

2.4.2 抗菌肽產(chǎn)量與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系 為確定WUH3生長(zhǎng)過程中抗菌肽產(chǎn)量的變化，連續(xù)24 h監(jiān)測(cè)菌體在MRS培養(yǎng)基中的吸光度值、pH和抗菌肽的抑菌活性。由圖5可知，WUH3菌體在第6 h開始產(chǎn)生抗菌肽，之后，隨時(shí)間的增加，其抑菌活性不斷增加，在第18 h抑菌活性開始保持平穩(wěn)。此時(shí)，通過OD監(jiān)測(cè)得知，菌體的生長(zhǎng)進(jìn)入了穩(wěn)定期。在菌體生長(zhǎng)期間，整個(gè)菌體發(fā)酵液的pH不斷地下降，證明WUH3在生長(zhǎng)過程中會(huì)不斷產(chǎn)生酸類物質(zhì)直至穩(wěn)定期。該結(jié)果表明，在菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)，為抗菌肽的最佳收獲時(shí)期。

圖5 L.plantarum WUH3的抗菌肽產(chǎn)量與菌株生長(zhǎng)時(shí)間的相關(guān)性Fig.5 Correlation between the yield of AMP and the growth time of L.plantarum WUH3

2.4.3 MIC MIC是評(píng)價(jià)抑菌物質(zhì)抑菌能力的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過二倍稀釋法測(cè)定了所得抗菌肽的MIC值。將抗菌肽溶液進(jìn)行連續(xù)的2倍稀釋后，使用稀釋液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示，連續(xù)稀釋5次后，抑菌效果依然明顯，OD均為0。在大于5次的稀釋倍數(shù)下，抗菌肽抑制效果減弱，指示菌strain B39濁度逐漸增加。通過BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定其MIC蛋白濃度為16 μg/mL。

圖6 不同濃度的抗菌肽對(duì)B.subtilis strain B39的抑制作用Fig.6 Inhibition effect of the AMP with different concentrations on B.subtilis strain B39

2.4.4 時(shí)間殺菌曲線 抗菌肽作用方式通常包括抑菌和殺菌兩種，為探究WUH3所產(chǎn)抗菌肽的作用機(jī)制，向枯草芽胞桿菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期培養(yǎng)液中加入抗菌肽，獲得終濃度為 48 μg/mL（3 MIC）的混合溶液，以未添加抗菌肽培養(yǎng)液作為對(duì)照，分別測(cè)定兩者的OD，并進(jìn)行平板菌落活菌計(jì)數(shù)，其結(jié)果如圖7所示。在strain B39生長(zhǎng)至第3.5 h時(shí)加入抗菌肽，與對(duì)照組相比，可以明顯觀察到加入抗菌肽后，溶液的吸光度不再發(fā)生變化。通過菌體平板計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入抗菌肽后，活菌數(shù)驟減，且在第9 h時(shí)，在PCA計(jì)數(shù)板上已經(jīng)觀察不到任何strain B39菌體的生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明，該抗菌肽的作用方式為殺菌。

圖7 時(shí)間殺菌曲線Fig.7 Time-killing curve

3 結(jié)論

乳酸菌作為一種公認(rèn)的食品安全菌，其所生產(chǎn)的抗菌肽的抑菌能力得到了廣泛的認(rèn)可。本研究以農(nóng)家泡菜樣品作為原料，在排除有機(jī)酸和過氧化氫的影響后，采用雙層瓊脂擴(kuò)散法篩選出1株對(duì)枯草芽胞桿菌有明顯抗菌作用的乳酸菌菌株——WUH3。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用乙酸乙酯進(jìn)行萃取可以獲得最好的抗菌肽粗提效果，紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示該物質(zhì)肽類特征吸收峰顯著，其在菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期（18～24 h）時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)量。進(jìn)一步的研究表明，該抗菌肽的最小抑菌濃度MIC為16 μg/mL，且其在3 MIC條件下，對(duì)枯草芽孢桿菌具有殺菌作用。

綜上所述，WUH3對(duì)常見腐敗菌——枯草芽胞桿菌具有明顯的抑制效果，具有成為新型的天然防腐劑的潛在價(jià)值。本試驗(yàn)研究了使用乳酸菌抗菌肽進(jìn)行抑菌，為摒棄傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑抑菌方法，開發(fā)抑制枯草芽胞桿菌的新型防腐劑提供了一定的參考價(jià)值。