茯苓渣多糖組成分析及體外抗癌、免疫活性研究

關玉婷，溫思萌, ，馮 雪，白云鵬，陳瑞瑞，沈曉勇，馮佳寧，常世敏, ，程鑫穎,

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038；2.邯鄲市天然產(chǎn)物與功能食品開發(fā)重點實驗室，河北邯鄲 056038；3.晨光生物科技集團邯鄲有限公司，河北邯鄲 056004）

茯苓（），屬于多孔菌科真菌的干菌核，為藥食兩用真菌。茯苓中的生物活性成分主要包括多糖、三萜類、氨基酸和類固醇等。茯苓已廣泛應用于制藥和食品加工領域，生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的茯苓殘渣，但暫無對茯苓殘渣中多糖活性的相關報道，提取茯苓殘渣中的多糖既可以提升茯苓殘渣的附加值，又可以降低生產(chǎn)廢料帶來的環(huán)境壓力。

茯苓多糖占茯苓干菌核中所有成分重量的84%。目前，已從茯苓中提取出34種多糖，包括茯苓聚糖、-茯苓聚糖等。茯苓多糖具有良好的抗炎、抗腫瘤及增強免疫等功效。與抗癌藥物相比，茯苓多糖對小鼠重要器官功能和肌肉力量的副作用較低。研究表明，當機體內(nèi)出現(xiàn)腫瘤細胞時，茯苓多糖可通過提升免疫細胞增殖分化的速度，提高抗體的數(shù)量，阻止腫瘤細胞進一步擴散，最終實現(xiàn)腫瘤細胞的消亡。同時，茯苓多糖可通過提高抗炎癥因子的水平減輕炎癥反應，在慢性炎癥實體試驗中，灌胃茯苓多糖減輕了小鼠耳腫癥狀，阻止大鼠皮下肉芽腫的生成。

目前國內(nèi)外已有大量提取茯苓多糖的相關研究，常用的提取方法有堿水浸提法、熱水浸提法和酶輔助提取法。由于堿水浸提法和酶輔助提取法需要引入大量溶劑造成提取的多糖安全性降低，而熱水浸提法工藝簡單，安全經(jīng)濟。有關茯苓殘渣的研究目前較少，對于茯苓殘渣中的多糖組成及生物活性未知，因此，本文對利用熱水浸提法從茯苓殘渣中提取的茯苓多糖進行單糖成分及含量測定、結(jié)構(gòu)分析，并進行抗腫瘤及免疫活性測定，以提升茯苓殘渣的利用率，為茯苓的綜合利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茯苓渣（可溶性多糖含量為0.12%） 云南省孟連縣；巨噬細胞（RAW264.7）、胃癌細胞（SGC-7901）、乳腺癌細胞（MDA-MB-231）、肝癌細胞（HepG2）上海青旗生物；半乳糖醛酸（GalA）、鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖（Glc）、葡萄糖酸（GlcA）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、巖藻糖（Fuc）標準品及DMEM培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒、IL-6細胞因子檢測試劑盒、TNF-細胞因子檢測試劑盒 深圳市達科為生物技術股份有限公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；苯酚、濃硫酸、甲醇 天津歐博凱化工有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、RPMI-1640 完全培養(yǎng)基 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；AB-8型大孔樹脂 東鴻化工有限公司。

UV1102紫外分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；LG-18N冷凍干燥機 北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司；RID-20A折射率探測器、SPD-20A紫外-可見檢測器、LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；FTIR-650紅外光譜儀 天津港東公司；Epoch2全波長酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；BX43+UC90光學顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 茯苓多糖的提取及純化 茯苓渣粉碎后過24目篩，于55 ℃干燥至恒重，在500 mL錐形瓶中加入70 g茯苓渣和300 mL 90%乙醇，進行混勻，75 ℃水浴回流2 h，抽濾，留濾渣干燥，得到茯苓粉。

精確稱1.00 g茯苓粉，加入40 mL蒸餾水，加熱，回流提取3 h后過濾，收集濾液，并將殘渣重復過濾2次，合并濾液，2500 r/min離心5 min，取上清液，抽濾，加入1/4體積的Sevage試劑（三氯甲烷與正丁醇體積比為 4:1），攪拌 30 min，4000 r/min離心10 min，取水相多次重復以上步驟，直至中間無明顯乳狀層，濃縮水相，灌注至透析袋（3.5 kD）中，流水透析24 h后，冷凍干燥，得淡黃色粉末，加蒸餾水溶解，使溶液最終濃度為5.0 mg/mL，過再生后的AB-8型大孔樹脂，多糖溶液以2 BV/h 流速上樣，吸附后將50%乙醇溶液以2 BV/h的流速進行洗脫，濃縮，冷凍干燥，得到茯苓多糖；依次使用無水乙醇、丙酮、無水乙醚對所得茯苓多糖進行洗滌，冷凍干燥，得純化后的茯苓多糖。

1.2.2 茯苓多糖單糖組成分析 根據(jù)參考文獻[18-19]的方法并進行適當修改，精密稱取純化后的茯苓多糖10 mg，加蒸餾水制備成濃度為1 mg/mL的溶液，加入2 mol/L的三氟乙酸2 mL，攪拌6 h，濃縮，取100 μL加入5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液為溶劑，加入同體積的0.5 mo1/L PMP/甲醇溶液，在70 ℃下反應100 min，加入鹽酸調(diào)節(jié) pH至7.0，加入l mL蒸餾水及1 mL氯仿，振蕩后取水相，重復多次，5000 r/min離心2 min，稀釋，過0.22 μL有機膜，備用。

標準品溶液：半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、葡萄糖酸、木糖、甘露糖、巖藻糖9種對照標準品，分別稱取 10、10、20、10、20、10、10、10、10 mg，加蒸餾水溶解，定容至 10 mL，配制成混合對照品，吸取100 μL，進行衍生化，備用。

色譜條件：色譜柱為 COSMOSIL 5C-PAQ（4.6 mm×250 mm），洗脫液為 80.8% PBS溶液（0.1 mol/L，pH7.0），19.2% 乙腈（v/v），洗脫方式為連續(xù)流動，柱溫為 35 ℃，進樣量為 10 μL，流速為1.0 mL/min，檢測器為SPD-20A紫外-可見檢測器，紫外檢測波長為245 nm。

1.2.3 茯苓多糖紅外光譜分析 參考楊大俏等的方法，精密稱取純化后的水提茯苓多糖樣品0.01 g，加入0.5 g溴化鉀混合均勻，研磨，稱取0.2 g混合物進行壓片，利用紅外光譜儀在400～4000 cm范圍內(nèi)掃描分析，繪制紅外吸收圖譜。

1.2.4 茯苓多糖抗腫瘤活性測定 通過CCK-8法分析水提茯苓多糖對SGC-7901（胃癌細胞），MDAMB-231（人乳腺癌細胞）、HepG2（肝癌細胞）的抑制作用。分別將細胞懸液移入裝有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，“8”字法搖勻，置于含5% CO的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，選對數(shù)期細胞在96孔板內(nèi)進行接種，每孔接種濃度為5×10個/mL的細胞100 μL，接種孔數(shù)以每個藥物每個濃度設置3個復孔，設置空白組（培養(yǎng)基）、藥物處理組（培養(yǎng)基+細胞+藥物），DMSO孔（含2.5‰ DMSO的培養(yǎng)基）每組3個復孔，96孔板最外圈加PBS，減少不同位置因水分蒸發(fā)造成的細胞生長差異。接種培養(yǎng)后，次日細胞貼壁加入5-氟尿嘧啶溶液（0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL）和茯苓多糖溶液（0、100、200、400、800、1600 μg/mL）。

CCK-8試劑為10:1的比例配制反應液。細胞經(jīng)藥物處理48 h后，棄去96孔板中的液體，每孔添加100 μL的CCK-8反應液。將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。利用酶標儀于450 nm處記錄吸光度。

1.2.5 小鼠脾淋巴細胞增殖試驗 茯苓多糖樣品溶液配制：稱0.1000 g樣品，加入5 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基溶解后，配制成濃度為2000 μg/mL的樣品母液，對樣品母液稀釋，得到濃度為50、100、200、500、1000 μg/mL 的樣品溶液。

以100 μL/孔的體積將細胞濃度為1×10個/mL的小鼠脾淋巴細胞懸液接種到96孔板上，每孔再加入100 μL不同濃度的茯苓多糖溶液，濃度分別為0、50、100、200、500、1000 μg/mL，每組設 5個復孔，置于含有5% CO、溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23 h后取出，每孔加入 10 μL CCK-8，混合均勻，放入培養(yǎng)箱中孵育1 h，于450 nm波長處記錄各孔（空白孔：RPMI-1640 完全培養(yǎng)基；陽性孔：100 μL 細胞懸液+100 μL含有5% ConA的RPMI-1640完全培養(yǎng)基）OD值。

1.2.6 茯苓多糖對巨噬細胞增殖的影響 在細胞培養(yǎng)瓶中加入RAW264.7細胞懸液和適量的DMEM完全培養(yǎng)基置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，1～2 d更新一次培養(yǎng)基。將消化所獲取的RAW264.7細胞懸液置于滅菌的離心管中，血球計數(shù)板計數(shù)，稀釋，以獲得濃度為1×10個/mL的RAW264.7細胞懸液。按照100 μL每孔的體積將濃度為1×10個/mL的RAW264.7細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁24 h，丟棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL不同濃度的茯苓多糖溶液，濃度分別為 0、50、100、200、500、1000 μg/mL，放于細胞培養(yǎng)箱中干預培養(yǎng)24 h后，將原培養(yǎng)基棄去，加入100 μL含10% CCK-8染色劑的無酚紅DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h后取出，450 nm處記錄吸光度值，通過計算巨噬細胞存活率，分析水提茯苓多糖對巨噬細胞存活率的影響。

1.2.7 茯苓多糖對炎癥因子IL-6和TNF-的影響 按照2×10個/孔的細胞濃度接種RAW264.7細胞于六孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)3 h，細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，加入10 μg/mL LPS的DMEM培養(yǎng)基1 mL，加入不同濃度茯苓多糖溶液1 mL，濃度分別為 0、50、100、200、500、1000 μg/mL 及同時設定LPS對照組和空白組，培養(yǎng)24 h，上清液1000 r/min離心10 min，棄去沉淀，200 μL/管分裝于滅菌后的0.5 mL離心管中，供ELISA分析檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組試驗均重復三次，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析，采用均值±標準誤差進行表示，采用GraphPad Prism5進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單糖組成分析

單糖組成和純度是決定多糖理化特性和生物活性的重要因素。本研究利用苯酚硫酸法測定茯苓多糖中多糖含量為76%，標準曲線y=8.1149x+0.0106（=0.9993）。圖1和表1為單糖標準品的高效液相色譜圖及茯苓殘渣水提多糖（PCOS）的單糖組成表，從茯苓渣中提取的多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖組成，其物質(zhì)的量之比為1:0.107:0.079:0.018，還有微量的阿拉伯糖和木糖，其中葡萄糖的含量為82.40 mol%。

圖1 單糖標準品的HPLC-UV色譜圖Fig.1 HPLC-UV chromatogram of monosaccharide standard

表1 茯苓多糖的單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of enzymatic Poria cocos polysaccharide

2.2 紅外光譜分析

傅利葉紅外光譜（FTIR）是檢測多糖化學結(jié)構(gòu)的常用方法，它可以通過分子中振動能級和旋轉(zhuǎn)能級的轉(zhuǎn)變檢測多糖官能團吸收峰的位置和強度，從而反映多糖的特性。如圖2可知，PCOS有明顯糖類特征吸收峰，在3362 cm處出現(xiàn)強吸收峰，是分子間O-H收縮振動引起，在2926 cm處出現(xiàn)多糖特征吸收峰，是亞甲基（-CH-）中C-H 伸縮振動引起，1655 cm處是由O-H變角振動造成的，在1240 cm處有硫酸基S=O鍵信號，在1078 cm處的吸收峰為吡喃糖結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，在870 cm附近為-糖苷鍵的特征吸收峰。

圖2 水提茯苓多糖紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of water extracted Poria cocos polysaccharide

2.3 茯苓多糖對腫瘤活性的影響

PCOS和5-氟尿嘧啶對三種腫瘤細胞的影響如圖3、圖4所示，PCOS 的濃度在 0～800 μg/mL 時，對肝癌細胞無抑制作用，在1600 μg/mL時，對肝癌細胞有抑制作用，但未到半抑制作用，5-氟尿嘧啶對肝癌細胞有抑制作用，在濃度為40 μg/mL時達到半抑制，IC=7.56 μg/mL。PCOS 濃度在 0～100 μg/mL時，人乳腺癌細胞的存活率增加，隨著PCOS濃度的增加，在100～1600 μg/mL，人乳腺癌細胞的存活率逐漸降低，PCOS對人乳腺癌細胞的抑制作用逐漸提升，IC=1174 μg/mL，證實了 PCOS對人乳腺癌細胞增殖有抑制作用，細胞存活率前期上升可能是由于PCOS濃度過低，而5-氟尿嘧啶的半抑制濃度為5.03 μg/mL，PCOS并不能替代5-氟尿嘧啶作為治療藥物。胃癌細胞經(jīng)過PCOS的干預后，在0～100 μg/mL時，細胞存活率呈現(xiàn)上升趨勢，此時的PCOS濃度還不足以抑制胃癌細胞生長，在100～400 μg/mL時，細胞存活率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，在400～1600 μg/mL時，細胞存活率急劇下降，IC=1096 μg/mL，茯苓多糖濃度為1600 μg/mL時，抑制作用最強。

圖3 5-氟尿嘧啶對肝癌細胞、人乳腺癌細胞及胃癌細胞的影響Fig.3 Effects of 5-fluorouracil on hepatocellular carcinoma,human breast cancer and gastric cancer cells

圖4 茯苓多糖對肝癌細胞、人乳腺癌細胞及胃癌細胞的影響Fig.4 Effects of Poria cocos polysaccharides on hepatocellular carcinoma, human breast cancer and gastric cancer cells

從PCOS對三種癌細胞的抑制結(jié)果可以看出PCOS對三種癌細胞都有不同程度的抑制，但不足以替代5-氟尿嘧啶成為治療藥物。先前研究以黃芪多糖、人參多糖等作為注射液，對小鼠體內(nèi)的癌細胞進行干預治療，對小鼠體內(nèi)癌細胞的抑制效果更佳，可能是由于PCOS分子量較大，細胞對其的吸收率較低，造成PCOS對癌細胞的抑制能力較低。

2.4 茯苓多糖對脾淋巴細胞增殖的影響

淋巴細胞的增殖率可以反映出機體免疫應答的強度及機體免疫系統(tǒng)的狀態(tài)，因此，可用來評價藥物是否具有免疫功效。由圖5可知，在給藥濃度為0～1000 μg/mL范圍內(nèi)時，隨著PCOS濃度的提升，小鼠脾淋巴細胞的增殖率逐漸增加，且隨著濃度的增加，小鼠脾淋巴細胞出現(xiàn)了對PCOS干預的濃度依賴，與濃度成正相關性，這也表明了PCOS的抗腫瘤作用靶點可能不是在腫瘤細胞，而是通過提升脾淋巴細胞的增殖率，從而提升免疫應答的強度，最終抑制腫瘤細胞的生長。

圖5 脾淋巴細胞增殖試驗結(jié)果Fig.5 Results of splenic lymphocyte proliferation test

2.5 茯苓多糖對巨噬細胞毒性的影響

巨噬細胞可識別致病物質(zhì)，對其進行直接清除，是免疫系統(tǒng)中的關鍵組成部分。由圖6可知，在50～1000 μg/mL濃度范圍內(nèi)，PCOS與空白對照組差異不明顯，即對巨噬細胞抑制無明顯影響，表明PCOS對于巨噬細胞無細胞毒性和抑制作用。

圖6 茯苓多糖對巨噬細胞存活率的影響Fig.6 Effect of Poria cocos polysaccharide on the survival rate of macrophages

2.6 茯苓多糖對炎癥因子IL-6和TNF-α的影響

活化的巨噬細胞可以產(chǎn)生炎癥因子（IL-6、TNF-等）來對抗癌細胞和病原體。因此，選擇IL-6和TNF-作為PCOS對免疫調(diào)節(jié)作用的指標。由圖7可 知 ， 在 PCOS 濃度 為 0～1000 μg/mL時 ，IL-6、TNF-炎癥因子的表達量都呈上升趨勢，但IL-6、TNF-炎癥因子的表達量組內(nèi)無顯著性差異（＞0.05），表明 PCOS 對 IL-6、TNF-炎癥因子無顯著抑制作用（＞0.05），即PCOS的免疫應答能力暫未有抗炎作用。PCOS雖然對巨噬細胞無抑制作用，但是可能由于巨噬細胞受到PCOS刺激，提升了IL-6、TNF-的分泌量。

圖7 茯苓多糖對IL-6和TNF-α的影響Fig.7 Effect of Poria cocos polysaccharide on IL-6 and TNF-α

3 結(jié)論

通過高效液相色譜測定PCOS的單糖組成，結(jié)果表明PCOS主要含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖和巖藻糖，還含有微量的阿拉伯糖和木糖。紅外光譜表明茯苓渣提取的多糖有明顯的糖類特征吸收峰；體外抗腫瘤和免疫實驗表明，PCOS對胃癌細胞、人乳腺癌細胞和肝癌細胞的增殖都有不同程度的抑制作用，其中，對胃癌細胞的抑制效果最佳，IC=1096 μg/mL，對巨噬細胞無抑制作用，對小鼠脾淋巴細胞、炎癥因子IL-6和TNF-都有促進作用，因此，PCOS具有應用于抗腫瘤及免疫疾病的治療潛力。但多糖的物理性質(zhì)、化學結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)在抗腫瘤活性方面存在較大差異，如溶解度、一級結(jié)構(gòu)（平均分子量、單糖殘基、糖苷鍵的位置和單糖殘基的序列）和溶液構(gòu)象（三重螺旋、單螺旋和隨機螺旋）等，本研究尚未測定從茯苓渣中提取多糖的分子量及溶液構(gòu)象，需要在體內(nèi)外進一步研究PCOS結(jié)構(gòu)與免疫調(diào)節(jié)活性的結(jié)構(gòu)-功能關系。