基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦聯(lián)遺傳算法（BP-GA）優(yōu)化干酪乳桿菌LTL1361凍干保護(hù)劑配方

張曦予，李銳定，莫明規(guī)，梅麗華，劉玉萍，朱雯君，李全陽(yáng),

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 500004；2.柳州市康小樂(lè)牛奶有限公司，廣西柳州 545007；3.柳州市十二中學(xué)，廣西柳州 545026）

益生菌是一類人體攝入后能夠改善胃腸道功能、增強(qiáng)免疫力并且提高人體對(duì)食物營(yíng)養(yǎng)吸收的活體微生物。干酪乳桿菌是一種重要的益生菌，在2001年就被國(guó)家衛(wèi)生部公布為可食用菌株，風(fēng)靡世界的養(yǎng)樂(lè)多代田株和張猛等的Zhang都是干酪乳桿菌。研究表明，干酪乳桿菌可以很好地定植于人體腸道上皮細(xì)胞并通過(guò)代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸等，使腸道環(huán)境pH降低，從而有效地抑制相關(guān)致病菌在腸道內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖，因此與干酪乳桿菌相關(guān)的益生產(chǎn)品在市場(chǎng)上得到了廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。

真空冷凍干燥是在真空條件下，使水分直接氣化而脫離物質(zhì)，從而延長(zhǎng)物料的貯藏期并保持其活性的一種技術(shù)，也是目前制備高質(zhì)量乳酸菌制劑的重要方法之一。但在進(jìn)行真空冷凍干燥過(guò)程中，由于多種因素變化而造成菌體細(xì)胞的損傷從而導(dǎo)致菌體活性降低甚至死亡，這就需要加入相應(yīng)的凍干保護(hù)劑以此減緩冷凍干燥過(guò)程對(duì)菌體造成的損傷。凍干保護(hù)劑類型主要分為糖類、蛋白質(zhì)類、醇類、氨基酸類以及抗氧化物類，醇類與糖類可以通過(guò)替代水在菌體表面形成氫鍵，以此來(lái)保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定，減少凍干過(guò)程造成的損害；氨基酸類保護(hù)劑通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞，抑制細(xì)胞內(nèi)冰晶的生長(zhǎng)以此來(lái)減緩凍干過(guò)程對(duì)細(xì)胞的損害；蛋白質(zhì)類保護(hù)劑在細(xì)胞表面形成蛋白膜，降低加工過(guò)程對(duì)于菌體的影響。相關(guān)研究表明，依據(jù)不同類型的菌種進(jìn)行不同的保護(hù)劑組合可以提高在真空冷凍過(guò)程中菌株的活性及存活率。

選擇合適的凍干保護(hù)劑組合可以更好地提高菌種真空冷凍干燥后的存活率，但由于不同菌株在冷凍干燥過(guò)程中生理生化反應(yīng)不同，并且復(fù)配保護(hù)劑成分復(fù)雜，與菌株的凍干存活率呈現(xiàn)非線性關(guān)系，傳統(tǒng)的優(yōu)化模型不能很好地完成此類凍干保護(hù)劑的篩選工作。而人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能很好地解決復(fù)雜非線性關(guān)系的問(wèn)題，其中，誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Error Back Propagation Neural Network，BPN）作為人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Artificial Neural Network，ANN）中最具廣泛性和代表性的一種模型，該模型可以在物理結(jié)構(gòu)上對(duì)人體大腦進(jìn)行模擬。通過(guò)輸入數(shù)據(jù)即可進(jìn)行自主學(xué)習(xí)訓(xùn)練與模擬，擬合程度高，在處理非線性關(guān)系時(shí)具有顯著優(yōu)勢(shì)。遺傳算法（Genetic Algorithms，GA）是基于Darwin自然選擇學(xué)說(shuō)以及Mendel遺傳定律的全局尋優(yōu)算法，可以不需要知道目標(biāo)的具體數(shù)學(xué)模型而模擬出最優(yōu)解。研究表明，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法相結(jié)合進(jìn)行全局尋優(yōu)，與傳統(tǒng)的回歸模型相比具有更高的準(zhǔn)確性。郭慧慧利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)遺傳算法模型對(duì)蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化相比，BP-GA模型優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)孢量比響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果高出7.7%；王恒的研究發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)化馬尾松樹脂降解發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，經(jīng)過(guò)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化培養(yǎng)基的降解效率比響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果高出4.9%。目前，BP-GA已經(jīng)廣泛應(yīng)用在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方面，但對(duì)于乳酸菌的凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化方面應(yīng)用較少。

為此，本試驗(yàn)以提高干酪乳桿菌LTL1361的凍干存活率為目標(biāo)，探究單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株存活率的影響，通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)找出主效應(yīng)因子，采用BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合出干酪乳桿菌LTL1361凍干保護(hù)劑的最優(yōu)復(fù)配配方，探求具有高凍干存活率的干酪乳桿菌凍干制劑，以期為干酪乳桿菌LTL1361后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌LTL1361（LTL 1361） 由本團(tuán)隊(duì)分離篩選自廣西巴馬瑤族自治縣健康百歲老人的糞便，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號(hào)：CCTCC NO：M2019018）；MRS 液體培養(yǎng)基（大豆蛋白胨10 g/L，酵母浸提粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖20 g/L,乙酸鈉5 g/L，檸檬酸銨2 g/L，磷酸氫二鉀 2 g/L，MgSO?7HO 0.58 g/L, MnSO?4HO 0.25 g/L，吐溫80 1 g/L） 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；MRS固體培養(yǎng)基（在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加15 g/L瓊脂） 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蔗糖、海藻糖、麥芽糊精、葡萄糖、谷氨酸、半胱氨酸、抗壞血酸、山梨醇、甘油、甘露醇 標(biāo)準(zhǔn)品，廣東康達(dá)生物科技有限公司；脫脂乳 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；低聚異麥芽糖、低聚木糖、水蘇糖、菊粉 山東齊魯生物科技有限公司；其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Lyo Quest真空冷凍干燥機(jī) 南京新飛達(dá)光電科學(xué)技術(shù)有限公司；DHP-9272D電熱恒溫培養(yǎng)箱上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；GR85DP立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；TG16W高速離心機(jī) 湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將保存于-80 ℃冰箱的干酪乳桿菌LTL1361冷凍菌株放置于無(wú)菌條件下，室溫解凍，菌液劃線培養(yǎng)于MRS固體培養(yǎng)基，并放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行24 h的活化培養(yǎng)。取平板上的單菌落接入MRS液體培養(yǎng)基中于37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。

1.2.2 干酪乳桿菌LTL1361的真空冷凍干燥工藝流程 參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行干酪乳桿菌LTL1361菌株真空冷凍干燥處理。首先將干酪乳桿菌LTL1361經(jīng)MRS固體培養(yǎng)基活化，并以2%的接種量接種于MRS液態(tài)培養(yǎng)基中。于37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后，4000 r/min、4 ℃離心10 min，棄去上清液并以無(wú)菌的生理鹽水洗滌兩次，得到菌泥。將菌泥與凍干保護(hù)劑按照10:1的比例均勻混合后進(jìn)行分裝，并置于-80 ℃進(jìn)行4 h的預(yù)凍，預(yù)凍結(jié)束后放入真空冷凍干燥機(jī) 24 h 的凍干（-50 ℃，真空度＜15 Pa），得到呈現(xiàn)絮狀干燥的凍干菌劑。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 研究表明，脫脂乳作為單一保護(hù)劑或者復(fù)合保護(hù)劑都對(duì)菌株有較好的保護(hù)作用，因此將其作為本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)凍干保護(hù)劑將有利于提高菌株的凍干存活率。按照1.2.2的方法制備凍干菌劑，以菌株的凍干存活率為指標(biāo)探究不同濃度脫脂乳（0%、6%、8%、10%、12%、14%）對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干后活力的影響。再以脫脂乳最佳濃度為固定條件，分別添加不同濃度的糖類（2%、4%、6%、8%、10%）、多元醇（1%、2%、3%、4%、5%）、益生元（2%、4%、6%、8%、10%）、氨基酸（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、抗壞血酸（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）等，探索不同濃度種類保護(hù)劑對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響，找出最適宜的保護(hù)劑濃度，同時(shí)設(shè)置只添加脫脂乳組作為空白對(duì)照組。

1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將濃度為10%脫脂乳作為基礎(chǔ)保護(hù)劑，同時(shí)根據(jù)2.1中的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以干酪乳桿菌LTL1361的凍干存活率為響應(yīng)值，評(píng)價(jià)海藻糖、谷氨酸、低聚木糖、抗壞血酸及甘露醇5個(gè)影響因素，篩選出影響凍干存活率的顯著因素，每個(gè)因素取最低（-1）和最高（1）兩個(gè)水平，共12組試驗(yàn)。試驗(yàn)因素和水平取值見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and level of Plackett-Burman experimental design

1.2.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)所得結(jié)果，選擇脫脂乳濃度（A）、海藻糖濃度（B）、谷氨酸濃度（C）以及甘露醇濃度（D）作為Box-Behnken試驗(yàn)的自變量，以干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。干酪乳桿菌LTL1361的Box-Behnken設(shè)計(jì)方案如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Box-Behnken test design factors and level

1.2.6 凍干存活率的測(cè)定 將得到的凍干粉用無(wú)菌生理鹽水與凍干前等體積復(fù)水，并充分振蕩混勻，準(zhǔn)確吸取100 μL菌懸液按合適的3個(gè)稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋并分別涂布在MRS固體培養(yǎng)基后計(jì)數(shù)。凍干存活率（Lyophilisation Survival Rate，LS，%）的計(jì)算公式如式（1）所示：

式中：LS表示凍干后的存活率，%；N表示凍干后的活菌數(shù)，CFU/mL；N表示凍干前的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[21]中的方法并稍作修改，采用由輸入層、隱藏層和輸出層構(gòu)建的三層BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。將通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)確定的脫脂乳、海藻糖、谷氨酸以及甘露醇的濃度作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的輸入層神經(jīng)元，菌株的凍干存活率為輸出層神經(jīng)元，利用經(jīng)驗(yàn)公式（2）計(jì)算出隱含層的節(jié)點(diǎn)數(shù)，從而構(gòu)建4-m-1的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具體BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)行流程圖如圖1所示。選取80%的Box-Behnken數(shù)據(jù)用于訓(xùn)練，10%用于測(cè)試，10%用于驗(yàn)證，以完成BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的自我學(xué)習(xí)訓(xùn)練和預(yù)測(cè)。

圖1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)行示意圖Fig.1 Schematic diagram of BP neural network operation

式中：M表示隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)；N表示輸入層節(jié)點(diǎn)數(shù)；L表示輸出層節(jié)點(diǎn)數(shù)；a表示[1,10]的常數(shù)。

1.2.8 遺傳算法（GA）進(jìn)行凍干保護(hù)劑配方尋優(yōu) 基于1.2.7所構(gòu)建的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，將其與GA結(jié)合構(gòu)建BP-GA模型對(duì)干酪乳桿菌LTL1361的凍干保護(hù)劑配方尋優(yōu)。設(shè)置最大遺傳代數(shù)為100，變量的二進(jìn)制位數(shù)為8，變異概率為0.01，交叉概率為0.8，代溝0.25，運(yùn)行Matlab R2019b程序，得到每代種群平均適應(yīng)度變化結(jié)果，以此尋找到函數(shù)的全局最優(yōu)值。

1.2.9 響應(yīng)面與BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化模型比較依據(jù)鄒立飛等的研究方法，通過(guò)比較均方根誤差（Root mean square error，RMSE）、平均絕對(duì)偏差（Mean Absolute Error，MAE）和決定系數(shù)（）的大小來(lái)判斷模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值差異性以及模型的可靠性，當(dāng)RMSE以及MAE越小，越接近1時(shí)說(shuō)明模型的可靠性以及擬合性更強(qiáng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Design Expert V10.0.7軟件分別進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及結(jié)果分析；SPSS 25和Graphpad Prism 7.0軟件用于顯著性分析和作圖；Matlab R2019b軟件用于BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的實(shí)現(xiàn)。為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每次試驗(yàn)進(jìn)行三次平行試驗(yàn)并用其平均值進(jìn)行分析運(yùn)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 脫脂乳粉添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響 由圖2可以看出，添加了脫脂乳作為保護(hù)劑的菌株凍干存活率顯著高于未添加保護(hù)劑組的菌株凍干存活率（＜0.05）。且隨著脫脂乳濃度的增加，干酪乳桿菌LTL1361的凍干存活率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)脫脂乳濃度較低時(shí)，菌株進(jìn)行冷凍干燥處理，由于脫脂乳不足以完全覆蓋菌株細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞有一部分裸露在環(huán)境中，此時(shí)脫脂乳的保護(hù)效果不佳，菌株的凍干存活率較低。當(dāng)脫脂乳濃度過(guò)量，導(dǎo)致體系滲透壓升高，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，凍干存活率下降，過(guò)高或過(guò)低的脫脂乳含量都在一定程度上影響著菌株的凍干存活率。當(dāng)脫脂乳濃度達(dá)到10%時(shí)，干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率達(dá)到最大值43.33%±1.54%；因此，脫脂乳的最佳添加量為10%。

圖2 脫脂乳粉添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響Fig.2 Effect of skim milk powder addition on survival rate of Lactobacillus casei LTL1361 during lyophilization

2.1.2 不同糖類添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響 由圖3可以看出，海藻糖對(duì)干酪乳桿菌LTL1361菌株的保護(hù)效果顯著優(yōu)于其他糖類物質(zhì)（＜0.05），并隨著海藻糖濃度的不斷增大，干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，當(dāng)海藻糖濃度為8%時(shí)，干酪乳桿菌LTL1361的凍干存活率達(dá)到最大值73.67%±2.34%，；過(guò)高濃度引起細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡，導(dǎo)致細(xì)胞脫水，而過(guò)低的海藻糖濃度不能充分代替脫去的水分子與磷脂分子結(jié)合，降低了對(duì)細(xì)胞膜穩(wěn)定性的維持效果，過(guò)高或過(guò)低濃度對(duì)菌株的凍干保護(hù)效果均不佳。當(dāng)海藻糖濃度在6%～10%范圍內(nèi)時(shí)，海藻糖能很好地維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，此時(shí)凍干保護(hù)效果最佳，因此選擇海藻糖濃度為6%～10%進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 糖類物質(zhì)添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響Fig.3 Effect of carbohydrate addition on survival rate of Lactobacillus casei LTL1361 during lyophilization

2.1.3 不同醇類添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響 從圖4可以看出，添加了多元醇作為凍干保護(hù)劑的菌株凍干存活率都顯著高于對(duì)照組（＜0.05），這可能是由于醇類物質(zhì)作為滲透性保護(hù)劑能進(jìn)入細(xì)胞抑制冰晶的生成，從而減緩了冷凍干燥過(guò)程對(duì)細(xì)胞的損傷。醇類物質(zhì)的凍干存活率均上升到最大值后緩慢下降，這可能是由于醇類物質(zhì)濃度過(guò)高時(shí)，導(dǎo)致胞內(nèi)溶質(zhì)過(guò)多，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，菌株活力下降。醇類物質(zhì)的凍干存活率均呈現(xiàn)先上升后逐步下降的變化趨勢(shì)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)甘露醇對(duì)干酪乳桿菌LTL1361的凍干保護(hù)效果顯著高于其他醇類物質(zhì)（0.05）且在添加量為3%時(shí)達(dá)到凍干存活率最大值68.4%。同時(shí)，當(dāng)甘露醇濃度在2%和4%時(shí)對(duì)菌株的保護(hù)效果均明顯高于其他濃度。綜上所述，選擇濃度范圍在2%～4%甘露醇進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖4 醇類物質(zhì)添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響Fig.4 Effects of alcohol addition on survival rate of Lactobacillus casei LTL1361 during lyophilization

2.1.4 不同益生元類添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響 由圖5可以看出，添加了益生元作為凍干保護(hù)劑的菌株凍干存活率都顯著高于對(duì)照組（＜0.05），這可能是由于益生元通過(guò)在菌株細(xì)胞膜表面形成覆蓋層，在一定程度上能維持菌株細(xì)胞膜表面溶劑化，減少菌株在冷凍干燥過(guò)程中胞內(nèi)水分外流的現(xiàn)象，保持了菌株活性。益生元濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響菌株的凍干存活率，濃度過(guò)高時(shí)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡，胞內(nèi)水分向外滲透，菌株的存活率明顯下降，而濃度過(guò)低時(shí)由于益生元不能很好地“包裹”細(xì)胞，造成細(xì)胞損傷、菌株死亡。因此，選擇合適的濃度對(duì)提高菌株存活率有重要影響。通過(guò)對(duì)比可知，低聚木糖對(duì)于菌體的保護(hù)效果顯著高于其他益生元（＜0.05），在6%的濃度時(shí)凍干存活率達(dá)到最高64.67%±1.89%，低聚木糖濃度在4%和8%時(shí)對(duì)菌株的保護(hù)作用也較為明顯。綜上，選擇濃度范圍為4%～8%的低聚木糖進(jìn)行下一步試驗(yàn)探究。

圖5 益生元類物質(zhì)添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響Fig.5 Effects of prebiotics addition on survival rate of Lactobacillus casei LTL1361 during lyophilization

2.1.5 不同氨基酸類添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響 通過(guò)圖6可知，添加氨基酸類物質(zhì)作為保護(hù)劑的菌株存活率顯著高于對(duì)照組菌株存活率（＜0.05），這可能是由于氨基酸類物質(zhì)能更好地與菌株細(xì)胞中的蛋白質(zhì)相結(jié)合，當(dāng)進(jìn)行脫水處理時(shí)能較好地穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，避免因環(huán)境失水造成的蛋白質(zhì)凝集現(xiàn)象，從而起到對(duì)菌株的保護(hù)作用。隨著氨基酸濃度的上升，凍干存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這可能是由于進(jìn)入胞內(nèi)的氨基酸類物質(zhì)過(guò)多而造成細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致菌株死亡。相較谷氨酸與半胱氨酸，谷氨酸的冷凍保護(hù)效果顯著高于（0.05）半胱氨酸并在0.8%濃度時(shí)保護(hù)效果最好，凍干存活率達(dá)到69.47%±0.76%。同時(shí)，當(dāng)半胱氨酸濃度在0.6%和1.0%時(shí)對(duì)菌株保護(hù)效果也較好，綜合選擇0.6%～1.0%濃度的谷氨酸進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖6 氨基酸類物質(zhì)添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響Fig.6 Effect of amino acid addition on survival rate of Lactobacillus casei LTL1361 during lyophilization

2.1.6 抗壞血酸不同添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響 由圖7可以看出，添加了抗壞血酸作為保護(hù)劑的菌株凍干存活率顯著高于對(duì)照組（＜0.05），這可能是由于抗壞血酸屬于滲透性小分子保護(hù)劑，同時(shí)具有抗氧化功能，能減少冷凍干燥過(guò)程對(duì)菌株造成的氧化損傷，維持菌株活性。隨著抗壞血酸濃度不斷上升，在1.0%濃度時(shí)達(dá)到最大的凍干存活率66.43%±1.67%，之后菌株凍干存活率有所下降，這是由于抗壞血酸濃度過(guò)高會(huì)影響菌株自身內(nèi)部的代謝，從而影響菌株存活率。對(duì)比可知，當(dāng)抗壞血酸濃度在0.5%和1.5%時(shí)，菌株的凍干存活率也較高，對(duì)菌株的保護(hù)效果較好。因此，選擇0.5%～1.5%濃度范圍的抗壞血酸作為凍干保護(hù)劑進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖7 抗壞血酸不同添加量對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響Fig.7 Effects of ascorbic acid addition on survival rate of Lactobacillus casei LTL1361 during lyophilization

綜上所述，本試驗(yàn)選擇海藻糖、抗壞血酸、甘露醇、谷氨酸以及低聚木糖進(jìn)行下一步的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 影響干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的關(guān)鍵因素的確定

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及結(jié)果如表3所示。采用Design Expert V10.0.7軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到以LTL1361凍干存活率為響應(yīng)值的最優(yōu)方程為式（3）。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 3 Factors and level of Plackett-Burman experimental design

式中：Y表示凍干存活率，%；X表示海藻糖濃度，%；X表示低聚木糖濃度，%；X表示谷氨酸濃度，%；X表示抗壞血酸濃度，%；X表示甘露醇濃度，%。

由表4可以看出，此模型的值小于0.01，表明該擬合模型極顯著。通過(guò)顯著性分析結(jié)果可知，海藻糖、谷氨酸以及甘露醇這三種物質(zhì)的＞＜0.01說(shuō)明這三個(gè)因素對(duì)菌株凍干存活率的影響極顯著，且對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率的影響大小排序?yàn)椋汉Ｔ逄牵竟劝彼幔靖事洞?，均為正向效?yīng)。因此，在響應(yīng)面優(yōu)化及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化試驗(yàn)中重點(diǎn)考察上述三個(gè)因素及基礎(chǔ)保護(hù)劑（脫脂乳）之間的交互作用對(duì)干酪乳桿菌LTL1361菌株凍干存活率的影響。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance result of Plackett-Burman experimental

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，進(jìn)行了N=29的四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，所得的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表5與表6。以干酪乳桿菌LTL1361的凍干存活率為響應(yīng)值，對(duì)試驗(yàn)所得的結(jié)果進(jìn)行擬合分析，得到二元多次項(xiàng)回歸方程如下：Y=84.67+0.47A+2.17B+0.38C+2.57D+5.57AB+1.64AC+2.29AD-0.27BC-2.28BD+0.07CD-7.75A-4.83B-6.54C-1.73D，式中Y表示凍干存活率。由表6可知模型的＜0.01，說(shuō)明模型中多元回歸關(guān)系極顯著，失擬項(xiàng)值為0.1472（＞0.05）失擬不顯著，說(shuō)明方程擬合充分，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以較好的表現(xiàn)響應(yīng)值與各因素間的關(guān)系。該模型=0.9148，說(shuō)明回歸方程與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合程度達(dá)到91.48%。綜上所述，該回歸方程可以用來(lái)確定凍干保護(hù)劑的最優(yōu)配比。通過(guò)Design Expert V 10.0.7軟件進(jìn)行計(jì)算，得到最佳配比為脫脂乳10.529%、海藻糖8.212%、谷氨酸0.807%及甘露醇3.842%時(shí)，干酪乳桿菌LTL1361的凍干存活率到達(dá)最大為86.84%，驗(yàn)證條件為脫脂乳10.50%、海藻糖8.20%、谷氨酸0.80%和甘露醇3.8%，在此條件下進(jìn)行三次試驗(yàn)驗(yàn)證，得到實(shí)際凍干存活率為85.93%±0.45%。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平Table 5 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

表6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)的回歸模型及方差分析Table 6 Regression model and variance analysis of Box-Behnken response surface test

2.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與結(jié)果

2.4.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Matlab R2019b軟件對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析，以“tansig”、“purelin”函數(shù)分別作為輸入層與隱含層的傳遞函數(shù)以及隱含層和輸出層之間的傳遞函數(shù)，“trainlm”作為訓(xùn)練函數(shù)，構(gòu)建三層BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。以脫脂乳、海藻糖、谷氨酸以及甘露醇的濃度作為4個(gè)輸入神經(jīng)元，中間一個(gè)隱藏層，以凍干存活率作為一個(gè)輸出神經(jīng)元。其中，隱藏層神經(jīng)元數(shù)M由式（2）賦予其實(shí)際意義，得取值范圍為[3,13]。經(jīng)過(guò)10000次訓(xùn)練，訓(xùn)練步長(zhǎng)為10，動(dòng)量因子為0.1，訓(xùn)練到目標(biāo)誤差為0.0001時(shí)停止訓(xùn)練，得到隱藏層中含有12個(gè)神經(jīng)元時(shí)測(cè)試集MSE最小和最大。由此得到本試驗(yàn)構(gòu)建最佳的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為4-12-1，如圖8所示。

圖8 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Fig.8 BP neural network topology

2.4.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 利用上述構(gòu)建的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)集進(jìn)行訓(xùn)練，其中，相關(guān)系數(shù)值表示BP人工神經(jīng)網(wǎng)路模型與輸出結(jié)果的擬合度。在最佳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的基礎(chǔ)上，將試驗(yàn)的實(shí)際測(cè)試值與模型訓(xùn)練、驗(yàn)證值進(jìn)行比較。由圖9可以看出試驗(yàn)真實(shí)值與訓(xùn)練、驗(yàn)證值得擬合效果以及相關(guān)性系數(shù)，訓(xùn)練數(shù)據(jù)、驗(yàn)證數(shù)據(jù)、測(cè)試數(shù)據(jù)以及所有數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)分別為0.9980、0.9983、0.9446以及0.9874。上述四種樣本的相關(guān)系數(shù)都達(dá)到0.90以上，說(shuō)明構(gòu)建的BP模型對(duì)于訓(xùn)練、驗(yàn)證、測(cè)試樣本都具有很好的擬合能力。綜上所述，構(gòu)建的BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果有良好的預(yù)測(cè)性，因此可以用此模型對(duì)干酪乳桿菌LTL1361凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行優(yōu)化。

圖9 訓(xùn)練、驗(yàn)證、測(cè)試以及所有數(shù)據(jù)與BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)仿真輸出值的擬合效果Fig.9 Training, validation, testing and fit of all data to the BP neural network simulation output values

2.5 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果

在上述工作的基礎(chǔ)上，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)函數(shù)的適應(yīng)度，并以干酪乳桿菌LTL1361的凍干存活率作為輸出值，將BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法進(jìn)行耦聯(lián)對(duì)凍干保護(hù)劑配比進(jìn)行全局尋優(yōu)，依據(jù)試驗(yàn)方法1.2.8來(lái)設(shè)置遺傳算法尋優(yōu)過(guò)程的參數(shù)，尋優(yōu)過(guò)程如圖10，圖中最優(yōu)價(jià)值為凍干存活率（%）的倒數(shù)。從圖中可知，進(jìn)行遺傳算法模擬生物在進(jìn)化過(guò)程中所經(jīng)歷的自然選擇壓力，適應(yīng)度曲線在遺傳模擬進(jìn)行近80代之后趨于平穩(wěn)，得到最優(yōu)價(jià)值為0.011252，經(jīng)計(jì)算干酪乳桿菌LTL1361凍干存活率最大預(yù)測(cè)值88.87%。此時(shí)的最佳凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳10.32%、海藻糖6.73%、谷氨酸0.84%和甘露醇3.98%。驗(yàn)證試驗(yàn)選擇保護(hù)劑濃度為10.3%、6.7%、0.8%以及4.0%，測(cè)得凍干存活率為89.56%±1.83%。

圖10 遺傳算法100次迭代尋優(yōu)結(jié)果Fig.10 Results of optimization with 100 iterations of genetic algorithm

2.6 響應(yīng)面與BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化模型比較

2.6.1 響應(yīng)面法與BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)能力的比較通過(guò)表7可知，響應(yīng)面的RMSE、MAE、分別為1.4489、1.1411、0.9148，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的RMSE、MAE、分別為0.8565、0.6035、0.9650。模型中的RMSE、MAE以及能較好地反映模型的擬合程度，RMSE、MAE值越小、值越大時(shí)，模型的擬合效果越好，擬合誤差越小。通過(guò)對(duì)比可知，BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的RMSE以及MAE均明顯小于響應(yīng)面對(duì)應(yīng)值，且神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的值高于響應(yīng)面的值。因此，BPGA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化模型比響應(yīng)面優(yōu)化模型的擬合效果更好，預(yù)測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。該結(jié)果與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、響應(yīng)面法在不同領(lǐng)域應(yīng)用結(jié)果類似。

表7 響應(yīng)面法與BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)能力的比較Table 7 Comparison of prediction ability between response surface method and BP-GA neural network

2.6.2 響應(yīng)面法與BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值比較 由表8可知，BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值分別比響應(yīng)面優(yōu)化模型對(duì)應(yīng)值高出2.03%與3.63%，且BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的相對(duì)誤差明顯低于響應(yīng)面模型，這說(shuō)明用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化保護(hù)劑配方結(jié)果比響應(yīng)面優(yōu)化模型結(jié)果更貼近實(shí)際值，BPGA模型的仿真性更高、試驗(yàn)更精確。

表8 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法與響應(yīng)面優(yōu)化模型下的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值比較Table 8 Comparison of the predicted and actual values of BPGA and RSM

綜上所述，BP-GA人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型與響應(yīng)面優(yōu)化模型相比更適用于干酪乳桿菌LTL1361的凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化試驗(yàn)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)創(chuàng)新性的采用BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行干酪乳桿菌LTL1361凍干保護(hù)劑配方的優(yōu)化，通過(guò)29組BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練數(shù)據(jù)使模型的擬合度達(dá)到0.90以上。與響應(yīng)面模型作對(duì)比，利用BP人工網(wǎng)絡(luò)耦聯(lián)遺傳算法優(yōu)化的凍干存活率預(yù)測(cè)值以及實(shí)際值分別提高了2.03%和3.63%，使用BP-GA神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化模型能有效減少仿真誤差并提高菌株的凍干存活率。因此，本研究以提高干酪乳桿菌LTL1361的凍干存活率為目標(biāo)，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合遺傳算法進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)的凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳10.3%、谷氨酸0.8%、海藻糖6.7%和甘露醇4.0%，此時(shí)的凍干存活率達(dá)到89.56%，較高程度地維持了菌株活性，提高干酪乳桿菌LTL1361在真空冷凍干燥過(guò)程中的存活率。綜上所述，認(rèn)為本試驗(yàn)運(yùn)用到的理論與技術(shù)對(duì)乳酸菌凍干制劑工藝優(yōu)化有一定的創(chuàng)新和借鑒價(jià)值。