一株新分離的嗜熱藍藻及其藻藍蛋白的穩(wěn)定性研究

岳 瑤，郭桂筱，李雁群,3, ，胡雪瓊

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)海洋藥物研究所，廣東湛江 524088；3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東湛江 524088）

藍藻（Cyanobacteria），又名藍細菌、藍綠藻，是一種形態(tài)簡單的產(chǎn)氧光合原核微生物，是重要的初級生產(chǎn)者，是地球上最原始的生命形式之一，距今已有超過30億年的生活歷史。藍藻分布范圍廣、適應(yīng)性強、生長快速，幾乎棲息在所有環(huán)境中，甚至包括各種極端環(huán)境，如高溫溫泉、寒冷冰川、堿性湖泊、干旱沙漠等。藍藻應(yīng)用于食品領(lǐng)域已有很長的歷史，其包含多種生物活性成分，如天然色素、蛋白質(zhì)、脂肪酸、多糖、維生素、微量元素等，具有極高的營養(yǎng)價值；部分藍藻還因能產(chǎn)生具有抗菌、抗病毒和抗癌活性的次生代謝產(chǎn)物而被廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)。藍藻是一大門類的微藻，有大量的藻種具有各種優(yōu)良特性，但絕大多數(shù)藍藻尚未被開發(fā)研究。嗜熱藍藻是一類能在50 ℃以上生長的高溫藻，在食品領(lǐng)域的研究很少，由于其具有高溫適應(yīng)性，其細胞內(nèi)生物活性成分往往可能具有某些特殊性質(zhì)。

藻藍蛋白是藻膽蛋白家族的一員。藻膽蛋白是存在于藍藻、紅藻及隱藻等藻類中的色素蛋白，是光合作用的捕光天線。藻膽蛋白有三種類型，即藻紅蛋白（phycoerythrin, PE）、藻藍蛋白（phycocyanin,PC）和別藻藍蛋白（allophycocyanin, APC）。藻藍蛋白是天然的藍色素，其吸收波長范圍為610～630 nm，主要存在于藍藻中，由脫輔基蛋白和開鏈四吡咯發(fā)色團組成。藻藍蛋白是我國批準(zhǔn)的可以食用天然藍色色素，目前主要用作著色劑添加在食品及化妝品行業(yè)，同時還具有一定的抗氧化、抗腫瘤和增強免疫力等功能。藻藍蛋白在食品加工領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，但由于目前市場上的藻藍蛋白熱穩(wěn)定性差，即使在巴氏殺菌條件下，藻藍蛋白也不能耐受，因此現(xiàn)在主要應(yīng)用于冷飲或冷制食品中。除此以外，藻藍蛋白對光照強度及酸堿環(huán)境也非常敏感，限制了其在食品領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用。為了提高藻藍蛋白的穩(wěn)定性及拓寬其在食品加工領(lǐng)域的使用范圍，有人通過使用添加劑（糖、檸檬酸、氯化鈉、乳清蛋白等）來延長藻藍蛋白的半衰期；有人通過對蛋白質(zhì)構(gòu)象進行修飾以保持蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定從而達到穩(wěn)定色素的目的；也有人通過將藻藍蛋白微膠囊化，通過包衣保護的方式來提高穩(wěn)定性，這些方法雖然能取得一定的效果，但改善作用有限，不足以滿足食品加工的要求。因此，若能找到一種不會在嚴苛的食品加工環(huán)境中褪色的藻藍蛋白，那么將具有非常廣闊的潛在市場。

目前，國內(nèi)外對藻藍蛋白的研究主要集中在中溫藻，關(guān)于利用高溫藻提取藻藍蛋白的研究較少，高溫藻由于生長環(huán)境特殊，其藻藍蛋白可能具有某些獨特的性質(zhì)。本文從湖南一處高溫溫泉采集的樣品中分離純化得到一株嗜熱微藻，初步試驗表明其生長溫度范圍為40～65 ℃，具有很好的高溫適應(yīng)性。本研究擬采用形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)分類研究的方法，確定所分離藻株的生物學(xué)分類地位。通過提取該藻的藻藍蛋白，研究其溫度、光照及酸堿穩(wěn)定性，為該藻的潛在應(yīng)用提供研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藻株來源 2019年8月，從湖南一處溫泉中采集了藻液樣本，采樣時水溫為70 ℃，采樣地點位于東經(jīng) 11354′59.05′、北緯 2532′6.86′；BG11 培養(yǎng)基：NaNO1.5 g/L， KHPO0.04 g/L， MgSO·7HO 0.075 g/L，CaCl·2HO 0.036 g/L，檸檬酸 0.006 g/L，檸檬酸鐵銨0.006 g/L，乙二胺四乙酸二鈉0.001 g/L，NaCO0.02 g/L，HBO2.86×10g/L，MnCl·4HO 1.81×10g/L，ZnSO·7HO 0.22×10g/L，NaMoO·2HO 0.39×10g/L， CuSO·5HO 0.79×10g/L，Co（NO）·6HO 0.49×10g/L；2×Taq Master Mix、DL2000 DNA marker、6×Loading buffer、植物 DNA提取試劑盒 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；瓊脂糖、50×TAE緩沖液 生工生物工程（上海）股份有限公司；Gold View Ⅰ型核酸染色劑 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

HZQ-F280恒溫搖床培養(yǎng)箱 江蘇省金壇市萬花實驗儀器廠；DV320光學(xué)顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；752紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；X-30R 高速冷凍離心機貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；SC300梯度PCR儀 上海啟前科技有限公司；DYY-8C型電泳儀北京市六一儀器廠；EVOS XL Co凝膠成像儀 廣州譽為生物科技有限公司；Scientz-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藻種的分離純化 先將從溫泉采集的水樣用濾紙過濾掉雜質(zhì)，再將其接種至BG11培養(yǎng)基中，置于溫度50 ℃，光照強度4000 lux，轉(zhuǎn)速150 r/min，光照周期12 h：12 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液逐漸變成藍綠色即富集培養(yǎng)完成，取少量樣品采用稀釋涂布平板法接種于加入瓊脂的BG11固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后，挑取綠色的單藻落，再采用劃線分離法接種于新鮮固體培養(yǎng)基上，待藻落長出，挑取長勢優(yōu)良的單藻落接種于96孔板，然后逐步擴大培養(yǎng)，按10%的接種量進行接種，全過程均在50 ℃條件下培養(yǎng)，直至最終完成藻種的分離純化。

1.2.2 分離藻株的形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期的藻液50 μL，置于光學(xué)顯微鏡下觀察，并拍照記錄。根據(jù)《中國淡水藻類——系統(tǒng)、分類及生態(tài)》進行初步分類鑒定。

1.2.3 DNA提取、PCR擴增及測序 取適量對數(shù)生長期的藻液，3500 r/min離心5 min，棄上清，用液氮將藻泥凍結(jié)后研磨成藻粉，采用植物DNA提取試劑盒提取微藻DNA，具體步驟按試劑盒說明書進行。

以提取的微藻DNA為模板，PCR擴增16S rRNA基因 DNA 序列片段，引物序列為：27f（5’-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3’），1492r（5’-GGTTACCTTGT TACGACTT-3’）， PCR 反應(yīng)體系為：模板 2.5 μL、引物 1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，用 ddHO將體系補至25 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min、94 ℃ 變性 30 s、55 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸30 s，30 個循環(huán)，72 ℃ 再延伸 10 min。

擴增完成后，擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠，100 V電泳25 min，電泳完成后，將其置于凝膠成像儀中觀察結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物公司進行測序。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 測序完成后，用DNAMAN 8.0軟件將測序結(jié)果進行序列拼接，并于NCBI網(wǎng)站上（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行 Blast同源性比對分析，選取同源序列，使用MEGA7.0軟件進行序列比對分析，并采用M-L法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值1000次重復(fù)計算以評估分支可信度。

1.2.5 藻粉的制備 取1.2.1中分離的藻種，按10%接種量接種至BG11培養(yǎng)基，以0.4 L/min的恒定流量連續(xù)通氣并攪拌培養(yǎng)物，在50 ℃、通入含15% CO的空氣、4000 lux光照條件下培養(yǎng)，在指數(shù)生長期結(jié)束時（第5 d）收集藻液，4500 r/min離心5 min，收集藻體，用去離子水洗去殘留的鹽分，經(jīng)冷凍干燥48 h后獲得藻粉。

1.2.6 藻藍蛋白的提取 稱取0.1 g藻粉于50 mL離心管，加入10 mL水，浸泡2 h，使用超聲破碎儀在冰水浴中破碎細胞，超聲功率550 W，超聲2 s，間隔3 s，總時間15 min，超聲完畢后，藻液在8000 r/min離心10 min（4 ℃），收集上清液即為藻藍蛋白粗提液。整個實驗過程保持樣品避光。

1.2.7 藻藍蛋白色價 將上述藻藍蛋白粗提液經(jīng)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉。準(zhǔn)確稱取0.025 g藻藍蛋白粉，用磷酸鹽緩沖液（pH6.8）溶解并定容至10 mL，稀釋10倍后，測定620 nm的吸光值。將測定結(jié)果帶入式（1），計算色價值：

1.2.8 藻藍蛋白穩(wěn)定性試驗

1.2.8.1 溫度穩(wěn)定性試驗 取上述1.2.6中提取得到的藻藍蛋白粗提液（濃度為1.137 mg/mL），分別置于4、30、40、50、60、70、80 ℃ 下，避光放置，每隔 0.5 h取樣，每組3個平行，測定其在620 nm下的吸光度。

1.2.8.2 光照穩(wěn)定性試驗 取上述1.2.6中提取得到的藻藍蛋白粗提液（濃度為1.137 mg/mL），分別置于 1000、2000、3000、4000、5000和 6000 lux的光照強度下，室溫放置，每隔1 d取樣，每組3個平行，測定其在620 nm下的吸光度。

1.2.8.3 酸堿穩(wěn)定性試驗 用0.01 mol/L的HCl和0.01 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)藻藍蛋白粗提液的pH，調(diào)節(jié) pH 為 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，在 4 ℃避光放置，每隔0.5 h取樣，每組3個平行，測定其在620 nm下的吸光度。

1.2.9 藻藍蛋白分析方法 在280、620、650 nm處測定粗提液的吸光值（A），由式（2）～（4）分別計算藻藍蛋白純度（P）、濃度（C）和得率（Q）。

式中：P為藻藍蛋白純度；C為藻藍蛋白濃度，mg/mL；Q為藻藍蛋白得率，%；K為樣品稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積，mL；m為原料質(zhì)量，mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)三次，采用SPSS 23.0和Excel 2010對數(shù)據(jù)進行分析處理，實驗數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用GraphPad Prism 8.0.2 和Origin 2018進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離藻株的形態(tài)觀察

本研究室將從湖南高溫溫泉采集樣品中分離得到的微藻進行純培養(yǎng)，建立起株系，將其命名為HN-54。經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察，藻細胞為細長桿狀的單細胞，直或有時彎曲，細胞繁殖的方式為二分裂，如圖1所示。

圖1 光學(xué)顯微鏡圖Fig.1 Optical micrographs

2.2 PCR擴增

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，經(jīng)PCR擴增出的16S rRNA基因目的片段是單一條帶，片段大小在1500 bp左右，結(jié)果如圖2。

圖2 微藻的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA of the alga

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

采用雙向測序的方法得到的序列長度為1395 bp，完整序列在NCBI網(wǎng)站上經(jīng)Blast同源性比對，再使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree constructed based on the 16S rDNA sequence

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示其與WFW（KC621876.1）、BP-1（MF191714.1）、NIES-2134（MF191712.1）同源性最高，該分離藻株與藍藻門中的嗜熱聚球藻屬最為接近，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果分析，應(yīng)將其定為嗜熱聚球藻屬的一支，將其命名為sp.HN-54（NCBI登錄號：ON212490）。由于 16S rRNA 基因在整個遺傳進化過程中相對保守，不足以提供關(guān)于不同藻株之間關(guān)系的充足信息，無法鑒定至種水平，因此種一級的分類學(xué)地位鑒定尚需要依賴于進一步的研究結(jié)果。

2.4 藻藍蛋白的提取得率和純度

在超聲輔助條件下從HN-54中得到的色素粗提物中藻藍蛋白純度為0.941，得率為11.37%，相較于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)螺旋藻藻藍蛋白的含量10%～20%而言，HN-54藻藍蛋白含量較高，可以作為提取藻藍蛋白的來源。

2.5 藻藍蛋白色價

經(jīng)計算，藻藍蛋白的色價為196.53，與賓美生物科技有限公司中產(chǎn)品藻藍蛋白E18的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（E618 nm≥180）相比，達到其色值指標(biāo)，說明本研究的藻藍蛋白可以達到目前市場上同類產(chǎn)品的色值標(biāo)準(zhǔn)。

2.6 藻藍蛋白穩(wěn)定性試驗

2.6.1 熱穩(wěn)定性試驗 環(huán)境溫度對藻藍蛋白穩(wěn)定性的影響如圖4所示。以藻藍蛋白溶液在620 nm處的吸光值為指標(biāo)來表達色值的高低，通過A的變化來反應(yīng)藻藍蛋白的穩(wěn)定性，從圖4的結(jié)果可見HN-54的藻藍蛋白在60 ℃以內(nèi)的溫度條件下非常穩(wěn)定，吸光值隨著時間的延長基本保持不變。但在70和80 ℃時，藻藍蛋白的吸光值隨著時間的延長不斷下降，2 h后逐漸趨于穩(wěn)定。溫度越高，色值下降越迅速，當(dāng)溫度為70 ℃時吸光度下降了26.7%；而在80 ℃時吸光度下降了75.4%。歐瑜等研究發(fā)現(xiàn)，鈍頂螺旋藻藻藍蛋白在溫度升高到50 ℃時穩(wěn)定性就會降低，60 ℃時保持3.5 h吸光值下降約66.7%，70 ℃時幾乎完全褪色。Martelli等在鈍頂螺旋藻藻藍蛋白溶液中添加62%的果糖，在80 ℃時加熱1 h后色值也只能保留50%，HN-54藻藍蛋白在未添加任何穩(wěn)定劑的情況下經(jīng)80 ℃時加熱1 h色值仍能保留39%。由此可知，HN-54藻藍蛋白耐熱性能良好，與市場上所使用的藻藍蛋白耐熱性相比有較明顯的優(yōu)勢，這一特性很可能與HN-54藻株具有高溫適應(yīng)性有關(guān)，在高溫狀態(tài)時其細胞內(nèi)蛋白質(zhì)非常穩(wěn)定，因此藻藍蛋白發(fā)色團的整體構(gòu)象在高溫時也能保持穩(wěn)定狀態(tài)。

圖4 HN-54藻藍蛋白在不同溫度下的穩(wěn)定性Fig.4 The stability of the phycocyanin of HN-54 at different temperatures

2.6.2 光照穩(wěn)定性試驗 光照對藻藍蛋白色值穩(wěn)定性的影響如圖5所示。光照強度不同，對藻藍蛋白色值穩(wěn)定性的影響不同。當(dāng)光照強度為1000和2000 lux時，藻藍蛋白的吸光值在7 d的保存期內(nèi)基本保持不變。當(dāng)光照強度為3000和4000 lux時，吸光值在第3 d時有所下降隨后逐漸趨于穩(wěn)定，吸光值分別保留了94.1%和94.8%。當(dāng)光照強度為5000和6000 lux時，吸光值在第7 d時均保留了91.4%。由此可見，在7 d的觀察時間內(nèi)，藻藍蛋白對光照較為穩(wěn)定，沒有發(fā)生嚴重的褪色現(xiàn)象。張巖等研究表明，螺旋藻藻藍蛋白置于室內(nèi)自然光環(huán)境下2 d吸光值就下降了約50.0%。Wu等將鈍頂螺旋藻藻藍蛋白連續(xù)暴露于 100 μmol/m·s 環(huán)境下 36 h，最終藻藍蛋白濃度下降約21.6%，且光照強度越高，降解程度越高?？梢奌N-54藻藍蛋白在光照穩(wěn)定性方面與其他藻藍蛋白相比具有更好的表現(xiàn)。藻藍蛋白吸光度的降低可能是因為當(dāng)藻藍蛋白置于強光下或是長期暴露在光照下，會導(dǎo)致其失去發(fā)色團，從而導(dǎo)致其穩(wěn)定性降低，藍色逐漸消失。因此，為延長藻藍蛋白的保存時間，最好避光放置，以防止藻藍蛋白結(jié)構(gòu)被光破壞。

圖5 HN-54藻藍蛋白在不同光照強度下的穩(wěn)定性Fig.5 The stability of the phycocyanin of HN-54 at different illumination strength

2.6.3 酸堿穩(wěn)定性試驗 酸堿對藻藍蛋白穩(wěn)定性影響結(jié)果如圖6所示。在pH6.0和pH8.0時，藻藍蛋白吸光值基本保持不變，藻藍蛋白非常穩(wěn)定。在酸性條件下，pH4.0時藻藍蛋白吸光值比中性條件下的吸光值高14.8%；pH2.0時，藻藍蛋白在3.5 h后吸光值下降了28.8%。在堿性條件下，pH10.0時在1 h吸光值下降了10.6%，此后直至3.5 h基本保持穩(wěn)定；pH12.0時吸光值明顯下降，在3.5 h后吸光值下降了65.3%。結(jié)果表明，藻藍蛋白在pH4.0～10.0的范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，但在極端酸性和堿性條件下穩(wěn)定性較差，特別是在堿性條件下對色值影響較大。劉楊等研究表明，鈍頂螺旋藻藻藍蛋白在中性環(huán)境下（pH7.0～8.0）穩(wěn)定性良好，超出此范圍穩(wěn)定性開始下降；在堿性環(huán)境下，HN-54藻藍蛋白與鈍頂螺旋藻藻藍蛋白類似，穩(wěn)定性下降較明顯。pH是影響藻藍蛋白在溶液中以單體、三聚體、六聚體形式聚集比例的主要因素。藻藍蛋白的穩(wěn)定性依賴于蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)，有報道表明，六聚體是最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，能避免藻藍蛋白發(fā)生變性，而在較高或較低的pH下，這種結(jié)構(gòu)很容易解離，從而導(dǎo)致穩(wěn)定性降低，發(fā)生褪色。本試驗表明，該藻藍蛋白在pH4.0～8.0范圍內(nèi)高度穩(wěn)定，可能是溶液中六聚體占主導(dǎo)地位，從而導(dǎo)致觀察到較高的穩(wěn)定性。因此，為了保護藻藍蛋白的高溶解度和吸光度，最好在弱酸性和中性的環(huán)境下使用。

圖6 HN-54藻藍蛋白在不同pH條件下的穩(wěn)定性Fig.6 The stability of the phycocyanin of HN-54 at different pH

圖7是藻藍蛋白溶液在不同pH條件下的吸收光譜圖，從圖中可見，藻藍蛋白的特征吸收峰波長在較強酸堿條件下發(fā)生了偏移，pH4.0、pH6.0、pH8.0的特征吸收峰保持在620 nm，pH2.0的吸收峰紅移到625 nm，pH10.0的吸收峰藍移到615 nm，該結(jié)果表明pH會影響藻藍蛋白特征吸收峰的位置，另外，從特征吸收峰的吸收強度可以看出，在強酸和強堿環(huán)境下，藻藍蛋白發(fā)生了較明顯的褪色。

圖7 HN-54藻藍蛋白在不同pH條件下的吸收光譜Fig.7 The absorption spectrum of the phycocyanin of HN-54 at different pH

3 結(jié)論

本研究從湖南一處溫泉分離得到的藻株為嗜熱聚球藻屬（）的一支，但其種一級的分類學(xué)地位尚不能確定。該藻為桿狀單細胞結(jié)構(gòu)，直或有時彎曲，二分裂殖。該藻可以得到純度為0.941、色價為196.53的藻藍蛋白粗提物，得率為11.37%（對藻干物質(zhì)）。該藻所含藻藍蛋白具有良好的熱、光和酸堿穩(wěn)定性。在60 ℃保持3.5 h色值不變，在70 ℃處理3.5 h仍保留73.3%的吸光值，在6000 lux光照7 d，色值可保持91.4%，在pH4.0～8.0保持3.5 h色值穩(wěn)定，該藻藍蛋白在食品加工領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

熱不穩(wěn)定是藻藍蛋白市場開發(fā)應(yīng)用最主要的限制條件之一，HN-54藻藍蛋白表現(xiàn)出比市場上絕大多數(shù)藻藍蛋白更好的耐熱性，可以作為耐熱性藻藍蛋白的一個潛在來源，盡管目前的熱穩(wěn)定水平尚需要進一步提高才能滿足食品工業(yè)更廣泛的應(yīng)用，但是其在較高熱穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上具備更好的條件進一步優(yōu)化以滿足嚴苛的食品加工條件。