假腸膜明串珠菌HDL-3胞外多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析

趙 丹，曹慧瑩，孫 夢，于連升，杜仁鵬,

（1.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物省高校重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150080）

乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是部分乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）在代謝生長過程中分泌到細(xì)胞外的多糖類化合物。能夠產(chǎn)EPS的乳酸菌有腸膜明串株菌（）、魏斯氏菌（）、植物乳桿菌（）、干酪乳桿菌（）、鼠李糖乳桿菌（）、嗜酸乳桿菌（）和嗜熱鏈球菌（）等菌屬。根據(jù)單糖組成不同，乳酸菌EPS可分為同型多糖和異型多糖。同型多糖僅有一種單糖組成，如葡萄糖、果糖，生物合成過程較簡單；而異型多糖由2種以上的單糖組成，生物合成過程較復(fù)雜。

近年來，隨著人們對健康的不斷重視，乳酸菌作為益生菌逐漸成為關(guān)注焦點，乳酸菌EPS作為乳酸菌所產(chǎn)的有益代謝產(chǎn)物，不僅可以促進腸道多種益生菌的生長和定殖、減少便秘；還具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血壓等作用；作為添加劑能夠增強食品的持水性、流變性和穩(wěn)定性，還可以優(yōu)化食品的質(zhì)地和口感，在食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。由于不同乳酸菌EPS的結(jié)構(gòu)存在較大差異，其結(jié)構(gòu)的差異必然導(dǎo)致生物活性的不同，EPS的分子質(zhì)量、單糖組成以及糖苷鍵類型等均影響EPS的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性，其結(jié)構(gòu)解析和構(gòu)效關(guān)系研究已成為當(dāng)前的熱點和難點。此外，乳酸菌EPS的產(chǎn)量較低，限制其大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用。目前，通過優(yōu)良高產(chǎn)菌株的篩選、改良菌株和優(yōu)化發(fā)酵條件等方法能在一定程度上提高乳酸菌EPS的產(chǎn)量。因此，分離篩選獲得更多的新型產(chǎn)EPS的乳酸菌，探究EPS的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，開發(fā)乳酸菌EPS的功能特性是目前糖生物領(lǐng)域研究的重點。本研究利用微生物學(xué)方法從東北自然酸菜發(fā)酵液中分離篩選產(chǎn)EPS的乳酸菌，并對EPS進行分離純化，研究其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，對比分析不同乳酸菌來源的EPS在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上的差異。本研究結(jié)果不僅豐富了產(chǎn)EPS的乳酸菌種質(zhì)資源，還為EPS的構(gòu)效關(guān)系研究提供理論依據(jù)，促進乳酸菌EPS的應(yīng)用范圍以及糖生物學(xué)的進一步發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東北酸菜 取自黑龍江省大興安嶺地區(qū)新林鎮(zhèn)家庭自制酸菜；葡聚糖凝膠G-100 上海源葉生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 TIANGAN股份有限公司；葡萄糖、胰蛋白胨、NaNO、CaCO、三氯乙酸、溴化鉀、苯酚、三氟乙酸等 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑科技有限公司；MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨1 g/L、牛肉膏1 g/L、酵母提取物5 g/L、無水乙酸鈉0.5 g/L、檸檬酸銨0.2 g/L、KHPO0.2 g/L、MgSO·7HO 0.058 g/L、MnSO·HO 0.025 g/L、吐溫-80 0.1 mL/L，用于乳酸菌的活化及培養(yǎng)；產(chǎn)糖MRS-S培養(yǎng)基：用20 g/L蔗糖取代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖。

ABI9700 PCR儀 美國基因公司；Alpha-1900Plus紫外-可見分光光度計 上海譜元儀器有限公司；TDA305凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC） 英國馬爾文有限公司；利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC） 島津國際貿(mào)易上海有限公司；IRAffinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀 株式會社島津制作所；AVANCE III核磁共振譜儀 瑞士Bruker公司；S-4800場發(fā)射掃描電子電鏡 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)EPS乳酸菌的分離 根據(jù)稀釋倒平板法，將稀釋后的酸菜發(fā)酵液涂布于含 1%（w/w）CaCO的MRS培養(yǎng)基上，30 ℃ 培養(yǎng) 48 h。利用接種環(huán)挑取產(chǎn)生鈣溶圈的單菌落接種于 30 mL MRS-S 液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 培養(yǎng) 36 h 后，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用苯酚硫酸法，以葡萄糖含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光值OD為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程式為y=0.0089x-0.0034，=0.9992。用于分析發(fā)酵液中EPS 的含量，選取能夠高產(chǎn) EPS 的乳酸菌用于下一步試驗。

1.2.2 高產(chǎn)EPS乳酸菌的16S rDNA鑒定 取菌株MRS發(fā)酵液2 mL，12000 r/min離心1 min，獲得菌體沉淀。利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。利用引物5’-TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3’和 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證正確后，于上海生工生物公司測序，將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有核苷酸序列進行同源比對，并提交至NCBI數(shù)據(jù)庫。下載與獲得的16S rDNA核苷酸序列同源性高的模式菌株核苷酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)同源性鑒定菌株的種屬水平。

1.2.3 EPS的提取、純化及純度檢測 以2%（v/v）的接種量將種子液接入到MRS-S產(chǎn)糖培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min 培養(yǎng) 36 h，發(fā)酵液 4 ℃、12000 r/min離心30 min后，向其中加入80%（w/v）的三氯乙酸使其終濃度為 4%（w/v）。4 ℃靜置過夜后，4 ℃、12000 r/min離心30 min去除蛋白，向上清液中加入三倍體積95%預(yù)冷乙醇，4 ℃靜置過夜沉淀EPS，4 ℃、12000 r/min離心20 min獲得沉淀，將沉淀溶于適量的去離子中，并裝入截留分子量為8000～12000 Da的透析袋中，4 ℃透析2 d，每8 h換一次水，將透析后的EPS樣品加入到Sephadex G-100凝膠過濾層析柱中，上樣量為1～2 mL，利用蒸餾水為洗脫液，流速為0.2 mL/min。根據(jù)洗脫圖上出峰時間接洗脫液，將收集到的洗脫液真空冷凍干燥，獲得純EPS。利用去離子水中配置成濃度為1 mg/mL的EPS溶液，經(jīng)紫外分光光度計進行全波長掃描，檢測純度。

1.2.4 EPS的結(jié)構(gòu)測定

1.2.4.1 分子量測定 將 2.0 mg EPS溶于 1 mL 0.1 mol/L NaNO溶液中，并以0.1 mol/L NaNO溶液作為洗脫劑，流速為0.5 mL/min，利用GPC測定EPS的分子量。以不同分子量的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，上機檢測，根據(jù)洗脫峰保留時間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程式為 y=-0.201x+1.385，=0.993。

1.2.4.2 單糖組成測定 將2 mg的EPS樣品溶于含1 mol/L HCl的無水甲醇中，80 ℃下水解16 h，加入2 mol/L三氟乙酸后于120 ℃下水解1 h，所得水解產(chǎn)物經(jīng)丙二醇甲醚丙酸酯衍生后，利用LC-15C HPLC測定EPS的單糖組成。以葡萄糖、甘露糖、半乳糖及半乳糖醛酸等為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)衍生化后上機檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間進行比對。

1.2.4.3 官能團組成測定 將干燥的EPS與溴化鉀混合并充分研磨后，壓制成薄片，利用傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR），在分辨率4 cm，波數(shù)范圍 400～4000 cm條件下，測定EPS的官能團組成。

1.2.4.4 鍵鏈接方式測定 取30 mg凍干的EPS充分溶解于重水（DO），在25 ℃條件下利用400 M核磁共振（Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）測定H-NMR、C-NMR譜圖。

1.2.4.5 結(jié)晶構(gòu)型測定 將干燥的EPS研磨后平鋪于樣品池中，利用X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD）測定結(jié)晶結(jié)構(gòu)，測試速率為2°/min。

1.2.4.6 表面形態(tài)觀察 將凍干的EPS樣品固定在導(dǎo)電膠上，鍍金后，利用掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）在電壓為10 kV，放大倍數(shù)為400×條件下，觀察EPS的表面結(jié)構(gòu)。

1.2.5 EPS的性質(zhì)測定

1.2.5.1 水溶性測定 取45 mg EPS樣品充分溶解于0.5 mL去離子水中，12000 r/min離心40 min得到沉淀進行凍干，凍干樣品稱質(zhì)量記為M（mg）。水溶性（Water solubility index，WSI）計算公式如下：

1.2.5.2 持水性測定 取45 mg烘干后的EPS充分溶解于0.5 mL去離子水中，12000 r/min離心40 min得到沉淀，用濾紙小心擦掉沉淀表面水分并稱質(zhì)量，記為W（mg），稱量冷凍干燥后的沉淀質(zhì)量，記為W（mg）。EPS 持水性（Water holding capacity，WHC）計算公式如下：

1.2.5.3 黏度穩(wěn)定性測定 利用粘度計測定，pH自然、室溫條件下，濃度（20、40、60 mg/mL）對 EPS 黏度的影響；pH 自然，不同溫度（20、30、40 ℃）對 EPS（20 mg/mL）黏度的影響；室溫條件下，不同 pH（4、6、8）對 EPS（20 mg/mL）溶液黏度的影響。

1.2.5.4 乳化性測定 分別取2.5 mL汽油、柴油、橄欖油、豆油、葵花籽油和苯與2.5 mL濃度為2 mg/mL的EPS溶液混勻，充分振蕩5 min后，在24和48 h時測定混合液乳化層。計算公式如下：

1.2.5.5 抗氧化性能測定 DPPH自由基清除能力的測定：將2 mL（濃度范圍0.5～5 mg/mL）EPS溶液與2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液混勻，暗反應(yīng)30 min后，以V為陽性對照，測定OD。DPPH自由基清除能力計算公式如下：

式中：A：水與 DPPH反應(yīng)；A：樣品與 DPPH反應(yīng)；A：水與樣品反應(yīng)，以排除樣品自身對試驗的干擾。

ABTS自由基清除能力的測定：將2 mL（濃度范圍0.5～5 mg/mL）EPS溶液與4 mL 7 mmol/L的ABTS工作液充分混勻，室溫條件下反應(yīng)6 min后，以V為陽性對照，測定OD。ABTS自由基清除能力計算公式如下：

式中：A：水與 ABTS 反應(yīng)；A：樣品與 ABTS 反應(yīng)；A：水與樣品反應(yīng)，以排除樣品自身對試驗的干擾。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)EPS乳酸菌的分離與鑒定

從酸菜發(fā)酵液中共分離得到4株產(chǎn)EPS的乳酸菌，其中菌株 HDL-3 能夠產(chǎn)（60.94±2.01）g/L 的 EPS，明顯高于其他3株菌。HDL-3在MRS平板上呈白色、圓形、不透明、表面光滑的菌落形態(tài)（圖1A）；在MRS-S平板上菌落較大，表面附著黏稠性液體（圖1B），符合一般產(chǎn)EPS乳酸菌的菌落形態(tài)特征。16S rDNA序列分析表明，菌株HDL-3部分序列長1478 bp，NCBI數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)，該菌株與多株基因序列的親緣關(guān)系最近，其中與3818同源性達到99%（圖1C）。因此，將HDL-3鑒定為，并命名為HDL-3。序列提交至NCBI，獲得登錄號為MZ959413。

圖1 菌株HDL-3菌落形態(tài)圖及系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Colony morphology of strain HDL-3 and phylogenetic tree

2.2 EPS的分離純化及純度分析

HDL-3發(fā)酵液經(jīng)去菌體、除蛋白、沉淀EPS、凝膠過濾層析后，在檢測器上呈現(xiàn)單一對稱的洗脫峰，表明獲得相對分子量相對均一的純品EPS。EPS溶液經(jīng)全波長掃描后，在260和280 nm處未出現(xiàn)吸收峰，表明EPS中無核酸和蛋白污染。純化后，EPS的濃度為（50.73±1.84）g/L，高于XG5（35.5 g/L），但低于XG-3 EPS（97.5±1.1 g/L）。經(jīng)冷凍干燥后，該EPS呈現(xiàn)白色棉花狀固體。

2.3 EPS結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 EPS的分子量及單糖組成分析 GPC洗脫峰呈現(xiàn)單一對稱峰（圖2A），表明EPS樣品純度較高。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出EPS的分子量為1.581×10Da，與YF32 EPS（5.54×10Da）相符合，但是高于SJ14 EPS（7.12×10Da）， 低 于DRP-5 EPS（6.23×10Da）。EPS 的分子質(zhì)量與其理化特性及益生功能密切相關(guān)，低分子量的EPS具有較好的溶解性和相對舒展的糖鏈構(gòu)象，具有更好的生物學(xué)活性。HPLC測定EPS的單糖組成，對比不同標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時間，表明HDL-3 EPS是由葡萄糖組成的同型多糖（圖2B）。同樣，XG-3 EPS和L2 EPS也是由葡萄糖組成的同型多糖。

2.3.2 FT-IR分析 FT-IR可以鑒別EPS中不同的單糖，確定糖苷鍵構(gòu)型。如圖2C所示，在3423.17 cm處有一較寬且強烈的特征吸收峰，這歸因于O-H鍵的伸縮振動，在2923.12 cm處的吸收峰，則歸因于C-H鍵的伸縮振動，這兩個吸收峰是多糖類物質(zhì)的特征峰。在1645.22和1356.49 cm處出現(xiàn)的特征信號峰則是由C=O伸縮振動引起的，在1015.23 cm處有一個較強的信號峰，是由C-O振動引起的。548.30 cm處的信號峰歸因于-D-吡喃糖的存在。HDL-3 EPS是由葡萄糖組成葡聚糖，與單糖測定結(jié)果相一致。

圖2 HDL-3 EPS的GPC（A）、HPLC（B）和 FT-IR（C）譜圖Fig.2 GPC (A), HPLC (B)和 FT-IR (C) spectrum of HDL-3 EPS

2.3.3 NMR分析 NMR分析可以進一步揭示EPS的糖單元種類、糖苷鍵構(gòu)型和連接方式。H NMR結(jié)果顯示（圖3），在4.89 ppm有一個明顯的特征信號峰，表明 HDL-3 EPS 由-（1,6）糖苷鍵連接。C NMR譜 中 73.365、 71.385、 70.215、 69.496、65.416 ppm處出現(xiàn)的信號峰分別對應(yīng)吡喃糖環(huán)上C3、C2、C5、C4和 C6的信號峰。此外，在 101和105 ppm之間無吸收峰，表明HDL-3 EPS的糖苷鍵類型為構(gòu)型。因此，根據(jù)FT-IR和NMR分析表明，HDL-3 EPS是由-（1,6）糖苷鍵連接而成的線性葡聚糖。

圖3 HDL-3 EPS 1H NMR和13C NMR光譜圖Fig.3 1H NMR and 13C NMR chromatograms of the HDL-3 EPS

2.3.4 XRD分析 EPS的結(jié)晶結(jié)構(gòu)與溶解性、膨脹性及一些物理特性息息相關(guān)，XRD技術(shù)可以有效的解析EPS的無定形或結(jié)晶特性。HDL-3 EPS呈現(xiàn)出一種無定形狀態(tài)，只在2為20°時出現(xiàn)強衍射峰（圖4），這是因為該EPS中含有大量的無定形區(qū)域，少量的結(jié)晶區(qū)隱藏在無定形區(qū)域內(nèi)，整體上呈現(xiàn)出一種相對無定形的狀態(tài)。此結(jié)果與XG-3 EPS和C19 EPS相符。

圖4 HDL-3 EPS的XRD光譜圖Fig.4 XRD chromatograms of HDL-3 EPS

2.3.5 SEM測定 SEM可用來觀察EPS的形貌，已成為研究大分子生物多糖表觀形貌的有力工具。結(jié)果如圖5所示，HDL-3 EPS展現(xiàn)出表面光滑、有光澤且緊湊的片狀結(jié)構(gòu)。WLPL04 EPS也呈現(xiàn)緊湊的片狀結(jié)構(gòu)，而AR307 EPS呈現(xiàn)分支化狀鏈結(jié)構(gòu)。片狀緊湊的結(jié)構(gòu)使EPS具有良好的機械穩(wěn)定性，光滑、有光澤的結(jié)構(gòu)使EPS具備制成可塑性膜材料的潛力，應(yīng)用于醫(yī)藥、化工及食品等領(lǐng)域。

圖5 HDL-3 EPS的SEM顯微形態(tài)（400×）Fig.5 Microscopic morphology under SEM of HDL-3 EPS (400×)

2.4 EPS性質(zhì)分析

2.4.1 水溶性及持水性分析 HDL-3 EPS的溶解率和持水率分別為 98.63%1.03%、401.30%±4.92%，其中溶解性顯著高于、持水性低于L2 EPS（分別為 91.90%±2.45% 和 509.45%±28.59%）。較高的溶解率是歸因于EPS含有大量羥基的葡萄糖單元，可與氫鍵形成大量的水。HDL-3 EPS展現(xiàn)良好的親水性和保水能力，可作為生物表面活性劑和穩(wěn)定劑應(yīng)用于化工及食品等領(lǐng)域。

2.4.2 粘度穩(wěn)定性分析 HDL-3 EPS的粘度穩(wěn)定性分析如圖6所示，隨轉(zhuǎn)速的增加EPS溶液的粘度逐漸減小，即表現(xiàn)出非牛頓流體的剪切稀釋特征。在室溫條件下，EPS溶液粘度與濃度呈正相關(guān)。濃度的增加提高了多糖鏈之間的相互作用，使得部分EPS分子發(fā)生聯(lián)結(jié)，聚合程度增加。在pH自然、不同溫度條件下，EPS溶液粘度與溫度呈負(fù)相關(guān)，這可能是因為溫度升高，EPS分子運動加劇，分子間相互作用力不足以約束分子運動，致使粘度下降。此外，較高的pH會使EPS溶液粘度下降，這可能是因為堿性條件下EPS的組成及結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化。因此，HDL-3 EPS可作為食品添加劑提高牛奶、酸奶、乳酪等食品的粘度，改善食品質(zhì)地。

圖6 濃度（A）、溫度（B）、pH（C）對 HDL-3 EPS 流變學(xué)特性的影響Fig.6 Effect of concentration (A), temperature (B), pH (C) on the rheological properties of HDL-3 EPS

2.4.3 乳化性分析 乳化劑能夠?qū)煞N不相溶解的液相體系保持穩(wěn)定性，廣泛應(yīng)用在化學(xué)、食品、醫(yī)藥及石油等領(lǐng)域。HDL-3 EPS對不同油類及烴類物質(zhì)的乳化能力如表1所示，整體的乳化趨勢為：大豆油＞苯＞葵花籽油＞汽油＞柴油＞橄欖油，其中對大豆油、葵花籽油和苯的乳化能力均超過60%此外，隨著時間的延長，HDL-3 EPS對汽油和柴油的乳化能力呈現(xiàn)少量增強的趨勢，而對橄欖油、大豆油、葵花籽油和苯的乳化能力呈現(xiàn)降低的趨勢。此結(jié)果與H2 EPS相一致?？赡苁且驗镋PS與不同的油類和烴類發(fā)生特異性結(jié)合，使得EPS的分子質(zhì)量、鍵合方式、氫鍵、糖殘基、支化度和靜電斥力等發(fā)生變化，從而導(dǎo)致不同的乳化能力。

表1 HDL-3 EPS對不同油類和烴類化合物的乳化能力Table 1 Emulsifying activity of HDL-3 EPS for different oils and hydrocarbons

2.4.4 抗氧化性分析 大多數(shù)乳酸菌EPS無論在體內(nèi)還是體外均具有抗氧化功能，能夠參與自由基清除，從而作為天然的安全抗氧化劑發(fā)揮作用。HDL-3 EPS對DPPH和ABTS自由基的清除能力如圖7所示，隨著EPS濃度的增加，清除能力呈現(xiàn)先增加后保持穩(wěn)定的趨勢，在5.0 mg/mL時，清除率最高，分別為 36.58%±1.04%和 34.21%±0.27%，高于Y3 EPS。EPS抗氧化活性與多種因素有關(guān)，包括分子質(zhì)量、單糖組成、官能團類型及EPS提取方法等。研究發(fā)現(xiàn)，EPS的抗氧化能力與糖醛酸的含量有關(guān)，相較V，HDL-3 EPS不具備強的氧化能力，可能是因為其僅由葡萄糖組成。

圖7 HDL-3 EPS的DPPH（A）和ABTS（B）自由基清除能力Fig.7 The scavenging activity of DPPH (A) and ABTS (B) of HDL-3 EPS

3 結(jié)論

本研究從自然酸菜發(fā)酵液中分離得到一株產(chǎn)EPS的乳酸菌，經(jīng)鑒定該菌株為，并命名為HDL-3。以該菌株為發(fā)酵劑發(fā)酵產(chǎn)EPS，并分離純化，得到高純度 EPS，其產(chǎn)量為（50.73±1.84）g/L。該 EPS 由葡萄糖構(gòu)成，分子量為1.581×10Da。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該EPS是由-（1,6）糖苷鍵連接而成的線性葡聚糖，呈表面光滑、有光澤且緊湊的片狀結(jié)構(gòu)。HDL-3 EPS溶解率和持水率分別為98.63%1.03%和401.30%±4.92%。該EPS的粘度隨著溫度和pH的升高而降低，對大豆油、葵花籽油和苯有良好的乳化能力，DPPH和ABTS自由基的清除能力可分別達到36.58%±1.04%和34.21±0.27%。因此，HDL-3 EPS可作為作為天然食品添加劑、增稠劑、乳化劑或抗氧化劑應(yīng)用在食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域。