加熱過程中蝦頭蛋白變性程度的表征方法比較

劉秋梅，王澤富，劉振洋，孫欽秀, ，魏 帥，夏秋瑜，韓宗元，吉宏武,2，施文正，劉書成,2,

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋生物制品工程重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研發(fā)中心，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江 524088；2.大連工業(yè)大學海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧大連 116034；3.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

凡納濱對蝦（），又稱南美白對蝦，是世界上最重要的經濟蝦類之一，多年來中國養(yǎng)殖產量居世界首位。凡納濱對蝦的加工主要以去頭或去殼后冷凍為主，在加工過程中會產生40%～50%的副產物（蝦頭、蝦殼和蝦尾）；蝦頭又是凡納濱對蝦加工副產物的主要組成部分，占副產物的70%～80%。

蛋白質是蝦頭中含量最多的營養(yǎng)成分，約占蝦頭的12%～18%。在食品工業(yè)中，常采用生物酶解法利用蝦頭蛋白質開發(fā)生物活性肽和蝦類調味品（蝦醬、蝦粉、蝦呈味基料）等，但在酶解過程中存在水解度低和蛋白質利用率低的問題。在實際生產中，通常選擇特異性的蛋白酶和優(yōu)化酶解條件來提高水解度和蛋白質利用率，然而改變酶解底物蛋白質結構也是提高水解度和蛋白質利用率的重要途徑之一。已有研究表明：蛋白質在酶解處理之前進行預處理適度變性，促使蛋白質肽鏈逐漸伸展，能夠暴露出更多的酶切位點，從而增加水解度和提高蛋白質利用率。熱處理是誘導蛋白質變性常用的處理方法。適度熱處理，蛋白質發(fā)生適度變性有利于酶解反應；過度熱處理，蛋白質過度變性反而會抑制酶解反應。但是，如何表征蛋白質的變性程度以及蛋白質變性到什么程度最適于酶解反應，目前還尚不明晰。因此，探索蛋白質變性程度的定性和定量表征，有助于闡明蛋白變性程度對蛋白酶解特性影響的機理。為了獲得高水解度、高蛋白質利用率的蝦頭酶解產品，可以通過控制加熱過程以防止過度變性和質量劣化。

由于不同來源蛋白質的理化特性和分子結構有較大差異，蛋白變性情況也會存在較大差異。國內外蛋白質變性程度方法的研究：一是測定蛋白質的理化特性如溶解度和熱力學特性等；二是測定分子結構包括二級結構和三級結構等；三是建立蛋白變性模型以預測蛋白的變性程度。這些方法主要是定性地分析不同預處理后蛋白的變化趨勢，但直觀定量表征蛋白質具體變性程度的研究較少。本研究以蝦頭中提取的混合蛋白為材料，在100 ℃加熱一定時間，分析蛋白質溶解度、SDS-PAGE、圓二色譜和熒光光譜特征的變化，創(chuàng)新性地選擇部分特征數據指標對蛋白質變性程度進行定性和定量表征，探索適合于表征蝦頭蛋白質變性程度的快速直觀方法，為合理控制酶解過程、提高水解度和蛋白質利用率提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活凡納濱對蝦，規(guī)格50～60尾/kg 湛江霞山水產批發(fā)市場，利用海水充氧活運至實驗室；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍染色液、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）預制膠、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，10×PBS，pH7.4） 上海碧云天生物技術有限公司；本實驗所用試劑均為分析純。

Chirascan V100圓二色光譜儀 英國Applied Photophysics公司；Varioskan Flash型全自動酶標儀

美國Thermo Fisher Scientific公司；RF-5301PC型熒光色譜儀 日本島津公司；DYY-11型電泳儀 北京市六一儀器廠；JYL-C022絞肉機 山東九陽股份有限公司；FDU551型冷凍干燥機 日本東京理化器械株式會社；JXH-200恒溫混勻儀 上海凈信實業(yè)有限公司；Sigma3-30KS臺式高速冷凍離心機 德國sigma離心機有限公司；VOPADEST450型全自動凱式定氮儀 中國廣州德資格哈特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝦頭粗蛋白的提取 凡納濱對蝦頭粗蛋白的提取參考邵虎明的方法并略作改動。在冰水中將凡納濱對蝦頭沿頭胸甲末端取下，控干水分，于4 ℃冰箱貯藏待用。取適量蝦頭用絞肉機絞碎（每絞15 s暫停10 s，防止溫度過高使蛋白變性）。取100 g絞碎蝦頭，按質量體積比1:6加入0.1 mol/L pH7.4 PBS，在冰水浴中磁力攪拌 6 h，離心 20 min（4 ℃，10000 r/min）。將離心后的沉淀按質量體積比1:4重新溶于PBS溶液，攪拌4 h后再次離心，合并兩次上清液，用紗布過濾除去雜質得到蝦頭粗蛋白溶液。將蝦頭粗蛋白溶液直接冷凍干燥成蛋白粉于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蝦頭蛋白熱處理

1.2.2.1 蝦頭粗蛋白濃度 凱式定氮法測定鮮蝦頭粗蛋白為16 g/100 g，提取的蝦頭粗蛋白溶液濃度約為12 g/100 g，其余為基質蛋白和非蛋白氮。因此，蝦頭粗蛋白含量以12 g/100 g計（折算為約120 mg/mL）。在蝦頭酶解開發(fā)活性肽或呈味基料時，通常按照料液質量體積比（1:1、1:2、1:3）加水進行酶解處理，加水后粗蛋白濃度分別約為60、40、30 mg/mL。為了與實際生產相一致，稱取蝦頭蛋白粉，加入適量蒸餾水復溶，分別配制成蛋白含量為60、40、30 mg/mL的蝦頭粗蛋白溶液。

1.2.2.2 熱處理方法 取蝦頭粗蛋白溶液2 mL于試管中，置于100 ℃恒溫混勻儀分別加熱1、2、3、4、5、6、7、8 min后立即放入碎冰中冷卻平衡。將熱處理后的蝦頭粗蛋白溶液冷凍離心15 min（4 ℃，10000 r/min），取上清液用于測試蛋白質的溶解度、SDS-PAGE、圓二色譜和熒光光譜。以未加熱處理的蝦頭粗蛋白溶液作為對照組。

1.2.3 溶解度測定 參考劉書成等的方法。用考馬斯亮藍法測熱處理后經冷凍離心上清液中的蛋白質濃度，蛋白溶解度用公式（1）計算：

式中： ρ為離心前蝦頭蛋白質濃度（mg/mL）；ρ為離心后上清液中蛋白質濃度（mg/mL）。

由圖1A結果，定義未經加熱處理的蝦頭蛋白為未變性狀態(tài)，蛋白溶解度為S；在100 ℃加熱4 min時（溶解度無顯著變化）為完全變性狀態(tài)，蛋白溶解度為 S；100 ℃加熱 0～4 min的蝦頭蛋白溶解度為S。用公式（2）表征蝦頭蛋白的變性程度Δ：

1.2.4 SDS-PAGE電泳分析 將1.2.2加熱處理后的蛋白質溶液稀釋至1 mg/mL。取10 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）和40 μL樣品混勻后沸水浴加熱 5 min，即為電泳樣品，上樣量為 15 μL。SDSPAGE：分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，電極緩沖液（pH8.9）。電泳結束后，膠片用考馬斯亮藍染色液染色 90 min，再用脫色液（醋酸:無水乙醇:水=1:4:5）脫至條帶清晰。用10～180 kDa的分子量標記校準觀察，分析膠片中蛋白質條帶變化。

灰度分析：將凝膠成像的電泳圖，用Image J軟件進行灰度分析。蛋白質電泳條帶的相對灰度用公式（3）計算：

式中：A為未加熱處理蛋白質電泳條帶的灰度值；B為加熱處理后蛋白質電泳條帶的灰度值。

1.2.5 圓二色譜（Circular dichroism，CD）分析 采用Chirascan V100圓二色光譜儀進行二級結構分析。用去離子水將蛋白質溶液的濃度調節(jié)至0.04 mg/mL，置于0.05 cm光徑的石英樣品池中，以100 nm/min在遠紫外區(qū)（190～260 nm）進行掃描，測蛋白質的橢圓率。

1.2.6 內源熒光光譜測定 參考Sun等的方法并略作修改。用去離子水將蛋白質溶液的濃度調節(jié)至0.04 mg/mL，用RF-5301PC型熒光色譜儀進行掃描，激發(fā)波長280 nm，掃描范圍300～450 nm，狹縫寬度為5 nm。

1.3 數據處理

試驗重復3批次，每批次3個平行處理，數據以平均值±標準差表示。采用JMP統(tǒng)計軟件進行單因素方差和Tukey HSD多重比較分析，以95%置信水平確定差異顯著性；用Image J分析SDS-PAGE電泳條帶灰度；用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 蝦頭蛋白溶解度與變性程度

溶解度在一定程度上可以代表總可溶性蛋白含量，也是蛋白質變性程度的一個重要表征指標。圖1A是不同濃度蝦頭蛋白在加熱過程中的溶解度變化。加熱前4 min，隨著加熱時間延長，蝦頭蛋白的溶解度逐漸下降。因為加熱使蛋白質肽鏈展開，包埋在蛋白質內部的疏水性基團暴露，親水性基團相對減少，蛋白質疏水性增加，導致部分蛋白質發(fā)生聚集沉淀，使蛋白溶解度降低。也有研究發(fā)現(xiàn)在熱處理過程中蛋白質容易發(fā)生氧化，使蛋白質交聯(lián)增加，導致蛋白質溶解度降低。與未加熱蝦頭蛋白相比，加熱處理4 min時，蝦頭蛋白溶解度降低了約90%；在加熱時間4 min后，再延長加熱時間，蝦頭蛋白的溶解度不再有顯著變化（＞0.05）。這主要是由于蝦頭的可溶性蛋白在加熱過程中逐漸變性沉淀，在加熱到4 min時可溶性蛋白變性沉淀達到最大值。羅嫚利用SDS-PAGE電泳圖譜得出豬肉蛋白經過75 ℃水浴加熱3～5 min時接近完全變性，與本研究結果相似。

圖1 加熱過程中蝦頭蛋白溶解度（A）和變性程度（B）的變化Fig.1 Changes in the solubility (A) and denaturation degree (B)of shrimp head protein during heating

以溶解度表征蝦頭蛋白的變性程度，按照公式（2）計算，結果見圖1B。在加熱0～4 min時，隨著加熱時間增加，蝦頭蛋白的變性程度顯著增加（＜0.05），在4 min時變性程度達到最大值；在加熱4 min以后，蝦頭蛋白的變性程度不再顯著增加且趨于平穩(wěn)（0.05），這說明蝦頭蛋白在加熱4 min時已達到完全變性。

2.2 蝦頭蛋白SDS-PAGE電泳與變性程度

圖2中A、B和C分別為60、40、30 mg/mL蝦頭蛋白熱處理后的SDS-PAGE電泳圖譜。由圖2A、2B和2C可知，蝦頭蛋白的分子質量分布在25～100 kDa，但主要集中在75 kDa附近。這說明75 kDa附近的蛋白質是蝦頭的主要蛋白，記75 kDa附近的電泳條帶區(qū)域為AB帶。由圖2A、2B和2C可知，隨著加熱時間的增加，三種濃度蝦頭蛋白的電泳圖譜中AB帶的灰度均逐漸變淺，尤其在4 min后，AB帶的灰度不再有明顯變化。這說明AB帶的蛋白質在加熱過程中逐漸變性，在加熱4 min時達到完全變性。加熱處理會使蛋白質變性聚集而沉淀，變性蛋白留在沉淀中，而電泳樣品是加熱處理后離心的上清液，因此變性蛋白的電泳條帶灰度會隨變性程度的增加而逐漸變淺，甚至消失。在本實驗的加熱過程中，AB帶的灰度變化最明顯，因此可用AB帶來指示蝦頭蛋白加熱過程中的變性程度。

由圖2A、2B和2C可知，加熱過程中蛋白質在SDS-PAGE圖譜中分子量約75 kDa附近的電泳條帶變化最明顯，將該區(qū)域條帶表示為AB。定義未經加熱處理的蝦頭蛋白為未變性狀態(tài)，AB條帶的相對灰度值為AB；在100 ℃加熱4 min時（AB條帶完全消失）為完全變性狀態(tài)，AB條帶的相對灰度值為AB；100 ℃加熱0～4 min的蝦頭蛋白AB條帶相對灰度值為AB。用公式（4）表征蝦頭蛋白的變性程度 ΔSDS-PAGE：

以AB帶相對灰度值變化表征蝦頭蛋白的變性程度，按照公式（4）計算，結果見圖2D。同一濃度下，在加熱1 min時，蝦頭蛋白變性程度出現(xiàn)負值，這是因為初始加熱使部分小分子蛋白（小于75 kDa）發(fā)生聚集生成了約75 kDa的聚集體，從而使AB帶相對灰度值增加。加熱1～4 min時，蝦頭蛋白的變性程度顯著上升（＜0.05），在4 min時變性程度達到最大值，這是因為持續(xù)加熱使蛋白質變性聚集而沉淀。加熱4 min后，蝦頭蛋白的變性程度在最大值趨于平穩(wěn)（＞0.05）。這也說明蝦頭蛋白在加熱4 min時已達到完全變性。

圖2 加熱過程中蝦頭蛋白的SDS-PAGE圖譜和變性程度的變化Fig.2 Changes in the SDS-PAGE and denaturation degree of shrimp head protein during heating

2.3 蝦頭蛋白圓二色譜與變性程度

圓二色光譜常用來表征蛋白質的二級結構，紫外區(qū)段（190～240 nm）的生色基團主要是肽鏈。蛋白質的-螺旋在190 nm出現(xiàn)正吸收峰，在208 nm和222 nm出現(xiàn)負吸收峰；-折疊在195 nm出現(xiàn)強正吸收峰，在216 nm出現(xiàn)負吸收峰；-轉角在180～190 nm出現(xiàn)強負吸收峰，在205 nm出現(xiàn)正吸收峰，在220～230 nm出現(xiàn)弱負吸收峰；無規(guī)則卷曲在198 nm附近出現(xiàn)負吸收峰，在220 nm附近出現(xiàn)小而寬的正吸收峰。

從未加熱蝦頭蛋白的圓二色譜圖（圖3A、3B、3C）可以看出，在190 nm附近有正吸收峰，在222 nm和208 nm附近有兩個弱的負吸收峰，這是-螺旋的特征吸收峰；在196 nm有正吸收峰，在216 nm有負吸收峰，這是-折疊的特征吸收峰。蝦頭蛋白二級結構主要以-螺旋和-折疊為主。隨著加熱時間的增加，190 nm的正吸收峰（-螺旋）逐漸消失并轉為190 nm 負吸收峰（-轉角），196 nm 的正吸收峰（-折疊）也逐漸消失并轉為強的負吸收峰（無規(guī)則卷曲）。這是因為加熱破壞了蛋白質分子內氫鍵，暴露出分子內的大量基團如巰基和疏水基團等，從而破壞了蝦頭蛋白原有的二級結構，使不同的二級結構間發(fā)生了轉換，-螺旋向-轉角轉變，-折疊向無規(guī)則卷曲轉變。

圖3 加熱過程中蝦頭蛋白圓二色譜和變性程度的變化Fig.3 Changes of the circle dichrosim and denaturation degree of shrimp head protein during heating

蛋白質二級結構橢圓率的變化與變性程度之間存在著一定的對應關系。由圖3A、3B和3C可知，定義未加熱蝦頭蛋白為未變性狀態(tài)，在196 nm的平均摩爾橢圓率為[θ]；100 ℃加熱5 min的蝦頭蛋白（橢圓率變化基本不顯著）為完全變性狀態(tài)，在196 nm的平均摩爾橢圓率為 [θ]；100 ℃ 加熱 0～5 min的蝦頭蛋白在196 nm的平均摩爾橢圓率為[θ]，用公式（5）表征蝦頭蛋白的變性程度 Δ:

由于蝦頭蛋白圓二色譜中196 nm處橢圓率的變化比較顯著，本實驗用196 nm處橢圓率的變化來表征蝦頭蛋白的變性程度，按照公式（5）計算，結果見圖3D。由圖3D可知，加熱前5 min，隨著加熱時間的增加，蝦頭蛋白變性程度顯著增加（0.05），當加熱到5 min時蝦頭蛋白變性程度緩慢增加，加熱5～8 min蝦頭蛋白變性程度趨于平穩(wěn)。圓二色譜的完全變性時間與其他方法不同，這可能是因為破壞蛋白質二級結構需要更多能量，所以完全變性時間發(fā)生滯后。

2.4 蝦頭蛋白內源熒光與變性程度

蛋白質分子中含有三種芳香族氨基酸殘基：色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。在紫外光照射下芳香族氨基酸殘基會發(fā)射熒光，348 nm為Trp熒光峰，303 nm為Tyr熒光峰，282 nm為Phe熒光峰，其中Trp熒光強度最強。Trp的熒光強度和峰位置與蛋白質構象密切相關，特別是與Trp殘基所處的微環(huán)境有關。環(huán)境極性增加則發(fā)射峰紅移，疏水性增加則發(fā)射峰藍移，當位于330～332 nm時表示Trp殘基處于疏水腔中，當位于342 nm時表明Trp殘基部分處于疏水性環(huán)境中；當位于350～352 nm時表示Trp殘基完全暴露于極性環(huán)境中，疏水腔瓦解，蛋白質的結構松弛。

從圖4A、4B和4C可以看出，未加熱蝦頭蛋白的內源熒光在340～350 nm，說明蝦頭蛋白的Trp殘基部分處于疏水性環(huán)境中；隨著加熱時間的增加，蝦頭蛋白的內源熒光逐漸從340～350 nm移動到了350～360 nm，發(fā)生了紅移，且熒光強度顯著增強。這是因為加熱過程會破壞蝦頭蛋白的空間結構，使肽鏈逐漸伸展，Trp殘基逐漸暴露在分子外部的極性環(huán)境中。

圖4 加熱過程中蝦頭蛋白內源熒光和變性程度的變化Fig.4 Changes of the endogenous fluorescence and denaturation degree of shrimp head protein during heating

由圖4A、4B和4C，定義未加熱蝦頭蛋白為未變性狀態(tài)，熒光最大吸收峰的波長為F；100 ℃加熱4 min時（相對紅移距離變化不顯著）為完全變性狀態(tài)，熒光最大吸收峰的波長相對F的相對紅移距離為F；100 ℃加熱0～4 min蝦頭蛋白的熒光最大吸收峰相對紅移距離表征為F，用公式（6）表征蝦頭蛋白的變性程度Δ：

以波峰相對紅移距離為參考，按照公式（6）計算，結果見圖4D。從圖4D中可以看出，在加熱前4 min，隨著加熱時間的增加，蝦頭蛋白變性程度顯著增大（0.05），在加熱4 min時蛋白變性程度達到最大，再增加加熱時間，蛋白變性程度也不再顯著變化（＞0.05）。這同樣說明加熱4 min使蝦頭蛋白發(fā)生了完全變性。

2.5 不同表征方法的比較分析

對表征蝦頭蛋白變性程度的不同方法進行比較，結果見圖5。從圖5可知，對相同濃度的蝦頭蛋白（圖5A、5B和5C），隨著加熱時間的增加，4種方法表征的蛋白變性程度均呈逐漸增加趨勢（＜0.05）；在加熱1～4 min之間時，蛋白變性程度都顯著增加（＜0.05），隨后再延長加熱時間，蛋白變性程度均不再顯著變化（0.05）。四種蛋白變性表征方法在加熱1～4 min之間（即未達到完全變性之前），蛋白變性程度之間存在一些差異，溶解度法所表征的蛋白變性程度顯著性大于SDS-PAGE法、圓二色譜法和熒光光譜法（0.05），這是因為四種蛋白變性表征方法采取的檢測原理不同。溶解度法檢測可溶性蛋白的變化，SDS-PAGE檢測分子量的變化，圓二色譜檢測二級結構的變化，熒光光譜檢測空間結構的變化，且不同方法靈敏度不同，可以看出溶解度法的靈敏度高于其他方法。

圖5 不同濃度蛋白變性表征方法的比較Fig.5 Comparison of different concentration characterization methods for protein denaturation

以上結果表明，在同一表征方法中，不同濃度的蝦頭蛋白在加熱過程中變性程度呈S型上升趨勢，在加熱1～4 min之間時變性速率存在顯著差異（＜0.05）。在加熱1～4 min時（即未達到完全變性之前），60 mg/mL蝦頭蛋白的變性速率顯著慢于30 mg/mL和 40 mg/mL 蝦頭蛋白的（＜0.05），而 30 mg/mL 略高于40 mg/mL蝦頭蛋白的變性速率。這可能是因為在相同加熱條件下，60 mg/mL溶液中蛋白含量較大，熱誘導蛋白質分子聚集在一定程度上受到抑制，使蛋白質變性程度降低。因此，蛋白質濃度對蛋白質完全變性時間無影響，但對蛋白變性速率有影響，選擇蝦頭蛋白濃度為30 mg/mL即料液比1:3時蝦頭蛋白可能會更快達到變性條件。

同時比較四種蝦頭蛋白變性程度表征方法的可操作性，溶解度法只需測定蛋白質濃度，具有快速、直觀、操作簡單、測試廉價等優(yōu)點，而SDS-PAGE法、圓二色譜法和熒光光譜法還需將濃度調至該方法適宜的范圍再進行測定，且耗時長、樣品使用量大，還需特定的儀器設備。

如上所述，在表征蝦頭蛋白變性程度時采用溶解度法更加方便快捷，并且考慮原料用量建議選擇料液比為1：3可能會更快達到變性條件。

3 結論

研究結果表明：溶解度法、SDS-PAGE法、圓二色譜法、熒光光譜法在定量直觀地表征加熱過程中蝦頭蛋白變性程度上具有一致性。在同一表征方法中，不同濃度的蝦頭蛋白在加熱過程中變性程度都呈S型上升趨勢，但在加熱1～4 min之間變性速率存在差異，其中蛋白溶解度的變性程度對加熱時間的靈敏度最為顯著。因此溶解度作為測定蝦頭蛋白變性程度的方法更加方便快捷，并且建議選擇料液比為1:3可能會更快達到變性條件。研究結果為食品加工過程中表征蛋白變性程度提供了方法參考。