雅安藏茶水提醇沉后各組分的物質(zhì)含量、抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性對比分析

夏 陳，羅棵瀕，向卓亞，鄧俊琳，陳 建, ，朱永清，施劉剛

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川成都 610066；2.雅安金花藏茶茶業(yè)有限公司，四川雅安 625100）

藏茶作為中國六大茶系中黑茶的典型代表，具有獨特的“醇和”而不“苦澀”的滋味。對于生長在青藏高原的藏民而言，藏茶自從流入藏區(qū)以來便成為藏民不可缺少的必需飲品。藏茶富含多酚、黃酮、多糖、游離氨基酸等多種功能物質(zhì)，同時基于黑茶獨特的渥堆工藝，粗茶中多酚、茶黃素、茶紅素等物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化、降解、生成和積累等反應，與多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)形成茶褐素等大分子物質(zhì)，成為黑茶的一個重要特征，其含量的多少也決定了藏茶的口感和色澤?；谶@些功能物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)藏茶水提物具有降血糖、降血脂、抗氧化等多種生物學功能。唐皓迪等研究發(fā)現(xiàn)高脂模型小鼠口服和灌胃藏茶水提物一段時間后，血清中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白和血糖等重要血脂血糖指標顯著下降。郭金龍等研究發(fā)現(xiàn)藏茶水提物對超氧陰離子的清除能力強于綠茶及眾多陽性對照物（V、V、BHA和BHT）。

目前對于藏茶中水提物的研究多集中于功效活性，而藏茶水提物成分較為復雜，如多酚、黃酮、多糖、茶色素等，無法判斷發(fā)揮生物活性作用的具體物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)水提物醇沉時醇濃度達到80%以上后，幾乎可除去全部蛋白質(zhì)、多糖、淀粉、無機鹽類等，使得水提物中能溶于乙醇功效部分成為上清液，而多糖等有機大分子不溶于乙醇將被沉淀出來，使得水提物大致被分為兩部分。基于雅安藏茶其水提物成分較為復雜，到目前為止，尚未全面系統(tǒng)地對藏茶水提物醇沉后各部分進行研究。故本研究旨在研究藏茶水提物經(jīng)醇沉后各組分（水提物、上清液與醇沉物）的化學成分，并通過兩種不同抗氧化體系（DPPH·和ABTS·清除能力）比較其體外抗氧化活性，同時比較-葡萄糖苷酶的抑制效果，為全面開發(fā)藏茶提取物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金花藏茶 由雅安市金花藏茶茶業(yè)有限公司提供，藏茶批號 20100619，形狀磚狀；DPPH、ABTS、-葡萄糖苷酶（≥10 U/mg）、對硝基苯--D-吡喃半乳糖苷（pNPG） 北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸（GA）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、咖啡堿（CA）、表兒茶素（EC）、兒茶素沒食子酸酯（CG）、沒食子酸兒茶素（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）（純度≥98%） 色譜純，北京索萊寶科技有限公司；-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯（水溶性VE）、福林酚、三氯化鋁、碳酸鈉、沒食子酸 分析純，成都市科龍化工試劑廠。

ELX-800酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；Gentrifuge5180R冷凍干燥機 德國Eppendorf公司；1290高效液相色譜儀（配備自動進樣器、二元泵、柱溫箱、DAD檢測器） 美國 Agilent公司；UPT-11-2T優(yōu)普系列超純水儀 四川優(yōu)普超純科技有限公司；Hei-vAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 海道爾夫儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藏茶提取物的制備方法 將金花藏茶按照1:10（g/mL）的料液比，用75 ℃熱水提取三次，分別提取為2、1和0.5 h，然后在50 ℃旋轉(zhuǎn)濃縮至原體積的1/5，濃縮液在4 ℃的溫度下按1:4的比例加入80%無水乙醇醇沉24 h，收集沉淀后溶于蒸餾水，將50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到的濃縮液冷凍干燥后得藏茶水提醇沉物；收集的上清液經(jīng)濃縮后冷凍干燥得到上清液樣品；藏茶水提后得到的濃縮液直接冷凍干燥為藏茶水提物。以下所有實驗均使用此樣品。稱取100 mg水提醇沉物與水提物分別溶于水進行分析測定；100 mg上清液溶于80%無水乙醇進行分析測定。

1.2.2 組分含量的測定 脂肪參照GB 5009.6-2016食品中脂肪的測定；總氨基酸參照國標GB 5009.124-2016食品中氨基酸的測定；水分參照國標GB 5009.3-2016食品中水分的測定。

1.2.3 總糖測定 總糖用苯酚-硫酸比色法測定，精密稱取樣品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加水適量，超聲處理使其完全溶解，用水定容至刻度，搖勻，精密吸取1.0 mL樣品液，向試管中加1.0 mL苯酚試劑混勻后立即加5.0 mL濃硫酸，靜置10 min。搖勻，30 ℃放置30 min后于490 nm測定吸光度。以葡萄糖溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標（x），吸光值為縱坐標（y），繪制苯酚-硫酸法標準曲線y=0.0032x+0.1001，=0.9993，線性范圍 11.72～750 μg/mL。

1.2.4 總多酚 總多酚按照福林酚法測定，20 μL上述樣品液中加入20 μL福林酚試劑后靜置5 min，加入160 μL 5% NaCO溶液，室溫下避光反應60 min后，在765 nm下測定混合液吸光值。以沒食子酸溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標（x），吸光值為縱坐標（y），繪制標準曲線。沒食子酸線性回歸方程為y=0.0078x+0.0562，=0.9993，線性范圍 0～175 μg/mL。

1.2.5 總黃酮測定 總黃酮用AlCl比色法測定，向 20 μL 上述樣品液中加入 10 μL 25%（m/v）NaNO反應6 min 后，加入10 μL 10% AlCl·6HO 反應5 min，加入 30 μL 1 mol/L NaOH 和 100 μL 蒸餾水，510 nm波長處測定吸光值。以蘆丁溶液濃度（μg/mL）為橫坐標（x），吸光值為縱坐標（y），繪制標準曲線。蘆丁線性回歸方程為y=0.0034x+0.0466，=0.9996，線性范圍 0～300 μg/mL。

1.2.6 茶色素測定 茶色素用Roberts萃取比色法測定，用30 mL乙酸乙酯將30 mL上述樣品液中進行萃取并振蕩5 min，得到4 mL乙酸乙酯層，用13 mL 95%乙醇定容至25 mL，得到溶液A（EA）。向25 mL乙酸乙酯層中加入25 mL 2.5% NaHCO后振蕩30 s，靜置分層后，將4 mL乙酸乙酯層用95%乙醇定容至25 mL，得到溶液C（EC）。向2 mL水層中加入2 mL飽和草酸溶液和6 mL超純水，用95%乙醇（15 mL）定容至25 mL，得到溶液D（ED）。25 mL樣品液用 25 mL 2.5% NaHCO振蕩3 min，2 mL水相加入2 mL飽和草酸溶液和6 mL超純水，用15 mL 95%乙醇定容，得到溶液B（EB）。以上溶液（EA、EB、EC、ED）在380 nm下測量吸光度，并以95%乙醇作為空白對照。

式中：EA、EB、EC、ED為在380 nm下測量吸光度值；TFs，茶黃素，g/100 g；TBs，茶褐素，g/100 g；TRs，茶紅素，g/100 g；樣品干物質(zhì)率為100-含水率。

1.2.7 還原糖測定 還原糖按照3，5-二硝基水楊酸法測定。量取上述樣品溶液2 mL，置具塞刻度大試管中，加入2 mL DNS試劑，搖勻，90 ℃水浴顯色6 min，取出，流水冷卻至室溫，加水至25 mL，搖勻，在540 nm波長處檢測吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線y=0.1015x+0.0034（＝0.9995）。

1.2.8 多糖測定 多糖按照董楊等修改測定，取1 mL上述樣品試液于具塞試管中，再加入4 mL蒽酮-硫酸試液，立即搖勻并置于冰水浴中，然后于沸水浴中加熱7 min，迅速冷至室溫，靜置10 min后，620 nm處測定吸光度，以蒸餾水做空白，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算樣品中多糖含量。

1.2.9 多酚類化合物組成的測定 藏茶提取物中多酚類化合物的測定采用高效液相色譜法，參照朱柏雨等的方法稍作修改。將藏茶提取物經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣分析。色譜柱Eclipse Plus C柱（2.1 mm×50 mm, 1.8 μm）；DAD 檢測器，檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流量：0.3 mL/min；進樣量：1 μL；流動相：1% 的甲酸水溶液（A）+乙腈（B）。梯度洗脫：0～2 min，B 5%～10%；2～10 min，B 10%～20%；10～15 min，B 20%～40%；15～17 min，B：40%～70%；17～20 min，B：70%～95%。

上述10個標準品20 mg，分別用甲醇溶解并定容至5 mL作為標準品母液。以二倍稀釋法制備不同濃度的標準品溶液。以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，得線性方程如表1所示。樣品中多酚類化合物的含量計算公式如下：多酚單體含量（μg/g）=待測液中多酚單體濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/樣品質(zhì)量。

表1 對照回歸方程及線性范圍Table 1 The compare regression equation and linear range

1.2.10 抗氧化活性測定

1.2.10.1 DPPH·清除能力 參照Liu等方法并作適當?shù)男薷模瑢⒋汲廖?、上清物和水提物?0%甲醇配制成不同濃度的溶液進行測定。取不同濃度 （ 9.76、 19.53、 78.12、 156.25、 312.50、 625.00、1250.00 μg/mL）的藏茶提取物溶液和維生素E（陽性對照）和0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液以1:1比例混合，室溫靜置一段時間后在517 nm波長下比色，清除率計算公式：

式中，A：空白對照組OD值；A：樣品組或陽性對照組（維生素E）的OD值。

1.2.10.2 ABTS·清除能力 參照Lü等方法并作適當?shù)男薷模〔煌瑵舛龋?.76、19.53、78.12、156.25、312.50、625.00 μg/mL）藏茶提取物和維生素E溶液（陽性對照）和ABTS工作液（在734 nm波長處吸光度值為0.70±0.02的ABTS母液與過硫酸鉀溶液混合液）混合反應6 min后于734 nm波長下測量OD值。清除率計算公式：

式中，A：空白對照組OD值；A：樣品組或陽性對照組（維生素E）的OD值。

1.2.11-葡萄糖苷酶抑制性測定 將醇沉物、上清物和水提物用80%甲醇配成不同濃度的溶液進行測定。參照Chen等方法并作適當?shù)男薷?，取不同濃度?.76、19.53、39.06、78.12 和 156.25 μg/mL）的藏茶提取物和阿卡波糖（陽性對照）和-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL，0.1 mol/L pH6.9的 PBS緩沖液配制）按照 1:1的比例混合，10 min后加入 100 μL pNPG（0.1 mol/L，0.1 mol/L pH6.9的 PBS緩沖液配制），37 ℃ 水浴鍋放置 10 min 后，加入 100 μL NaCO，在405 nm的波長下測定OD值。計算公式：

式中，A：空白對照組OD值；A：樣品組或陽性對照組（阿卡波糖）的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較方法進行顯著性分析，＜0.05表示差異具有顯著性，結(jié)果用平均值±標準差表示（n=3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分分析

藏茶提取物基本成分見表2。藏茶水提醇沉物中多糖含量顯著（＜0.05）高于上清液，這是由于水提物中多糖等水溶性物質(zhì)大分子不溶于乙醇，當乙醇濃度達到80%時可以沉淀下大部分的多糖，因此經(jīng)醇沉后多糖主要存在于醇沉物中。由表2可知，共檢測到16種氨基酸，包括1種條件半必需氨基酸（酪氨酸）、7種必需氨基酸和8種非必需氨基酸。醇沉物中氨基酸總量為5.89 g/100 g，顯著高于上清液。16種氨基酸中含量最高的為谷氨酸，其次為天冬氨酸和甘氨酸，為茶葉提供獨特風味，這與楊天友等所研究的黑茶中氨基酸結(jié)果相一致。除谷氨酸和精氨酸外，醇沉物中其余氨基酸含量也均顯著（＜0.05）高于上清液。

表2 藏茶提取物中基本組分（g/100 g）Table 2 Chemical composition analysis of Tibetan tea extract (g/100 g)

2.2 多酚類化合物和茶色素分析

藏茶提取物多酚類化合物和茶色素含量見表3，其中藏茶上清液中總多酚、總黃酮含量以及主要的多酚類化合物含量（GA、GC、EGC、C、CA、EC、EGCG、GCG、ECG和 CG）均顯著（＜0.05）高于醇沉物，這是由于多酚類化合物易溶于水并且溶于乙醇，因此經(jīng)醇沉后多酚類化合物主要存在于上清液中。此外，藏茶中CA含量最高（98.74 mg/g），其次為 GC（27.90 mg/g）和 GA（24.15 mg/g），而 CA 具有刺激中樞神經(jīng)的功能，但經(jīng)醇沉后醇沉物中含量顯著降低（18.73 mg/g），可以減弱藏茶中的苦味和刺激性。

表3 藏茶提取物中多酚類物質(zhì)和茶色素Table 3 Polyphenols and tea pigments in Tibetan tea extract

茶色素是黑茶在微生物發(fā)酵過程中多酚類化合物發(fā)生氧化、聚合以及偶聯(lián)等生化反應，和蛋白質(zhì)、多糖以共價鍵結(jié)合形成的水溶性聚合大分子物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)復雜，主要分為茶褐素類、茶黃素類和茶紅素類，茶色素對湯色、滋味以及功能性質(zhì)有重要的影響。由表3可知，藏茶水提物中茶色素主要以茶褐素為主，含量為17.23 g/100 g，經(jīng)醇沉后茶褐素主要存在于醇沉物中，上清液中有少量的茶褐素；茶紅素只存在于上清液中；茶黃素主要存在于上清液中，少量存在于醇沉物中。研究發(fā)現(xiàn)茶褐素是與蛋白質(zhì)、多糖、多酚、氨基酸等共價鍵結(jié)合形成的水溶性聚合大分子物質(zhì)，溶于水而不溶于乙醇，因此經(jīng)醇沉后沉淀中茶褐素最高。而茶紅素和茶黃素是黑茶發(fā)酵過程中茶多酚氧化聚合形成的，因此溶于80%乙醇。

2.3 抗氧化活性

自由基作為人體生命活動時產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，大量自由基會破壞人體正常的細胞（如胰島細胞等），從而引起糖尿病等疾病，而植物化合物的攝入可以有效地清除多余的自由基，從而影響糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。因此，通過測定藏茶水提物、醇沉上清液與醇沉物對DPPH·和ABTS·清除率來評價抗氧化活性。如圖1所示，在0～1250 μg/mL濃度范圍內(nèi)，藏茶水提物、上清液、醇沉物和維生素E對DPPH·和ABTS·均具有清除能力，并隨著濃度的增加，清除率逐漸上升，其清除能力的強弱依次為維生素E＞上清液＞水提物＞醇沉物。這是由于上清液中黃酮和多酚類化合物遠高于醇沉物和水提物，而大量研究發(fā)現(xiàn)DPPH·和ABTS·清除能力與黃酮和多酚類化合物含量呈顯著正相關(guān)。此外，當濃度為1250 μg/mL時，上清液對DPPH·的最高清除率達到88.04%，當濃度為 625 μg/mL，上清液對 ABTS·的最高清除率達到94.19%，抑制率均低于陽性對照維生素E，但強于報道的其他種類的黑茶提取物，周向軍等研究發(fā)現(xiàn)0.2936 g/L烏龍茶茶褐素對DPPH·的最高抑制率接近80%。楊新河等研究發(fā)現(xiàn)1.00 mg/mL青磚茶、康磚茶、茯磚茶、六堡茶和普洱茶中茶多糖對ABTS·清除率分別為91.26%、92.93%、92.64%、92.34%和92.81%。

圖1 DPPH·清除能力（A）和 ABTS+·清除能力（B）Fig.1 DPPH· scavenging capacity (A) and ABTS+· scavenging capacity (B)

2.4 α-葡萄糖苷酶酶抑制活性

-葡萄糖苷酶可將寡糖降解為單糖繼而被腸上皮細胞所吸收，導致體內(nèi)血糖水平升高，因此抑制-葡萄糖苷酶可降低餐后血糖水平。該研究結(jié)果表明藏茶提取物對-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用，抑制強弱依次為醇沉物＞水提物＞上清液。這可能是由于醇沉物中含有較高含量的多糖和茶褐素，研究發(fā)現(xiàn)多糖和茶褐素可以抑制糖代謝酶的活性，從而起到降血糖功效。如圖2所示，在9.76～19.53 μg/mL濃度范圍內(nèi)，對-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著濃度的增加而迅速增加，當濃度從19.53 μg/mL增加到78.13 μg/mL時，抑制活性緩慢增加。在一定濃度內(nèi)，對-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著濃度的增加而增加，當濃度達到156.25 μg/mL，醇沉物抑制率達到最大值為81.02%。與過去的研究結(jié)果相一致，賀國文等研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶不同分子質(zhì)量提取物均對-葡萄糖苷酶有較強的抑制作用。黃群等研究報道黑茶可以通過抑制-葡萄糖苷酶，升高糖代謝關(guān)鍵酶的mRNA基因表達改善糖尿病的高血糖。

圖2 α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.2 Inhibitory activity of α-glucosidase

3 結(jié)論

本文通過對藏茶水提醇沉物和上清液中基本組分、總多酚、總黃酮、茶色素、多酚類化合物以及抗氧化活性和-葡萄糖苷酶消化酶抑制作用分析比較，發(fā)現(xiàn)水提醇沉物中多糖、茶褐素含量較上清液高且CA比水提物明顯減少，表現(xiàn)出較高的-葡萄糖苷酶抑制活性和較低的咖啡堿；而上清液中多為黃酮和多酚類化合物且高含量的CA，使其表現(xiàn)出更高的DPPH·和ABTS·清除能力以及較高的咖啡堿。藏茶水提醇沉物和上清夜的物質(zhì)分析有利于其高值化、資源化利用。藏茶水提醇沉物有望開發(fā)為一種天然保健食品應用在保健品等領(lǐng)域。