基于靶向代謝組學(xué)分析嫁接對茶樹代謝物的影響

茶鳳官，劉 穎，高 峻, ，孔 勝，趙一明，周泳臣，左登鴻，呂才有，丁海琴，鄭文忠,3

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)院，云南昆明 650100；2.云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)茶葉產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)栽培研究室，云南昆明 650201；3.云南省普洱茶樹良種場，云南普洱 665000）

茶樹是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，茶樹的嫁接始于20世紀(jì)70年代。目前茶樹嫁接廣泛應(yīng)用于老茶園及低產(chǎn)茶園的換種改造、野生茶樹的擴(kuò)種和繁殖以及良種的保存等生產(chǎn)實(shí)踐中；同時(shí)隨著良種優(yōu)勢在茶葉生產(chǎn)中逐步得到體現(xiàn)與發(fā)揮，低產(chǎn)、低效的老茶園改造已然成為當(dāng)前茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展中一個(gè)重要研究課題。而嫁接后的茶樹因結(jié)合了接穗和砧木各自的優(yōu)勢，往往具有一種或多種顯著的增益效果；與此同時(shí)，嫁接后的茶樹利用原有的強(qiáng)大根系吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)來滿足接穗新梢發(fā)育的需要，所以可以比常規(guī)改植換種的茶樹提早2～3年投產(chǎn)，減少老茶園改植換種的投入成本，是老茶園改造、更換新品種等行之有效的方法之一。在生產(chǎn)上，選擇合適的砧木嫁接不僅可以增強(qiáng)對生物或非生物脅迫的抗性，還有助于提高產(chǎn)量、改良品質(zhì)。

目前嫁接茶樹的相關(guān)研究表明，茶樹嫁接會使鮮葉中部分化合物含量發(fā)生改變；吳姍等通過HPLS對嫁接茶樹氨基酸含量變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明，兩組供試茶樣中都檢出17種游離氨基酸，其中嫁接茶樹中茶氨酸含量都高于對應(yīng)的接穗品種；另外梁月榮等對嫁接茶樹及相應(yīng)的接穗品種新梢的茶多酚、氨基酸、咖啡堿和兒茶素等生化成含量進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，嫁接茶樹的氨基酸和咖啡堿含量高于相應(yīng)的接穗品種，而茶多酚和主要兒茶素類含量低于相應(yīng)的接穗品種。另外，隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于茶葉研究。例如，馬成英等利用UHPLC-QTOF/MS平臺結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)研究嫁接對茶葉次生代謝產(chǎn)物的影響，結(jié)果表明，不同砧木嫁接會對茶樹鮮葉的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生明顯的影響；鄧威威等對茶/油茶嫁接體的次級代謝物含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，嫁接體葉片中的氨基酸、嘌呤堿和多酚含量比油茶葉片高，其中茶氨酸含量比油茶顯著提高，咖啡堿含量比茶樹葉片顯著降低，嫁接體葉片中含有酚酸，而在油茶中未被檢出。

近年來對茶樹嫁接的研究大多都集中在嫁接技術(shù)、生物學(xué)特性、產(chǎn)量與抗逆性以及品種選育等方面，對于茶樹嫁接后代謝物的變化研究卻很少，且缺乏系統(tǒng)性的研究和分析；所以本文以品種桃形葉為接穗、短接白毫為砧木進(jìn)行茶樹嫁接，并利用廣泛靶向代謝物學(xué)技術(shù)分析嫁接前后茶樹代謝物的變化。這在一定程度能夠?yàn)榧藿雍蟛铇漉r葉的加工和生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)茶樣來源于云南省普洱良種場茶園，以品種桃形葉為接穗，短接白毫為砧木，采用切接法對茶樹行嫁接；待嫁接成活、生長旺盛后分別采摘其嫩芽（一芽一葉）立即放入液氮中冷凍保存，且每組進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，具體的樣品名稱和編號如表1所示。甲醇、乙腈 色譜級，Merck公司；標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥95%，Bio BioPha公司。

表1 樣品信息及編號Table 1 Sample information and number

Scientz-100F冷凍干燥機(jī) 寧波新芝；5424R離心機(jī) 艾本德中國有限公司；MM400研磨機(jī) 德國RETSCH公司；UPLC SHIMADZU Nexera X2超高液相色譜儀 日本島津公司；Applied Biosystems 4500 Q TRAP質(zhì)譜儀 AB SCIEX公司；Direct-Q3純水儀 美國默克密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取 將采摘回來的茶葉嫩芽放入凍干機(jī)中進(jìn)行真空冷凍干燥，并將干燥后的茶樣用研磨機(jī)研磨至粉狀，取100 mg碾磨后的組織樣溶解于1.2 mL 70%的甲醇提取液中，將溶液渦旋振蕩后置于4 ℃冰箱過夜，12000 r/min離心10 min后，吸取上清，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

質(zhì)控樣本（QC）由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性，在儀器分析的過程中，每10個(gè)檢測分析樣本中插入一個(gè)質(zhì)控樣本，以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：AgilentSB-C（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫 40 ℃；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量4 μL；流動相A：0.1%的甲酸，流動相B：乙腈，洗脫梯度如表2所示。

表2 色譜階梯洗脫條件Table 2 Chromatographic step elution conditions

1.2.3 質(zhì)譜條件 ESI源操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓5.5 kV；簾氣流速 25 psi；GSI氣體流速 50 psi；GSII氣體流速 60 psi；碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高；QQQ掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體設(shè)置為中等。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于自建數(shù)據(jù)庫MWDB和二級譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性；通過三重四級桿篩選出每個(gè)物質(zhì)的特征離子，在檢測器中獲得特征離子的信號強(qiáng)度（CPS），用MultiaQuant軟件打開樣本下機(jī)質(zhì)譜文件，根據(jù)代謝物保留時(shí)間與峰型的信息對色譜峰的進(jìn)行積分和校正工作，每個(gè)色譜峰的峰面積（Area）代表對應(yīng)物質(zhì)的相對含量，然后導(dǎo)出所有色譜峰面積積分?jǐn)?shù)據(jù)保存并利用（Unit Variance Scaling）進(jìn)行數(shù)據(jù)的歸一化處理，最后得到數(shù)據(jù)的定性和定量結(jié)果。利用Office 2010和Origin 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)的基本處理和相關(guān)圖表的繪制；通過R軟件中的MetaboAnalystR包進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本質(zhì)控（QC）分析

通過對不同質(zhì)控QC樣本質(zhì)譜檢測分析的總離子流（TIC）圖進(jìn)行重疊分析，可以判斷代謝物提取和檢測的重復(fù)性，能為數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性提供重要的保障。QC質(zhì)控樣本的總離子流圖如下圖1所示，代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高，即保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均一致，表明樣品離散少，儀器穩(wěn)定，檢測結(jié)果可靠。

圖1 QC樣本質(zhì)譜檢測TIC重疊圖Fig.1 TIC overlap diagram of QC sample mass spectrometry detection

2.2 主成分分析

PCA 分析（Principal Component Analysis），即主成分分析，PCA分析本質(zhì)上是一種無監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，能從總體上反應(yīng)各組樣本之間的總體差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大?。籔CA結(jié)果如圖2所示，第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率為63.28%，第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率為10.56%，A1和B1兩組樣品表現(xiàn)出明顯的分離趨勢，說明嫁接前后的茶樹代謝物具有較大差異。

圖2 樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)PCA得分圖Fig.2 PCA score of sample mass spectrometry data

2.3 代謝物差異分析

嫁接前后茶樣中共檢測到804種代謝物（包括正離子和負(fù)離子兩種模式）；為了進(jìn)一步分析茶樹嫁接前后代謝物的變化情況，利用偏最小二乘法判別（OPLS-DA）進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)基于OPLSDA模型中的變量重要性投影（VIP）值和差異倍數(shù)（FC）值進(jìn)行差異代謝物的篩選；當(dāng)代謝物同時(shí)滿足VIP≥1和FC值≥2或≤0.5這兩個(gè)條件時(shí)，則認(rèn)為該代謝物具有顯著的差異性；如下圖3所示，兩組樣品中共篩選出10類105種具有顯著差異的代謝物；與嫁接前相比，嫁接后的茶樣中有44種差異代謝物顯著上調(diào)，61種差異代謝物顯著下調(diào)，差異代謝物下調(diào)的數(shù)目大于上調(diào)，在這些差異代謝物中占比較多的是黃酮、脂質(zhì)、酚酸、其他和核苷酸及其衍生物這5種類別，分別占差異代謝物總數(shù)的31%、15%、9%、9%和8%。在105種具有顯著差異的代謝中有15種脂質(zhì)、9種黃酮、9種核苷酸及其衍生物、6種鞣質(zhì)、4種酚酸、4種生物堿、3種有機(jī)酸、2種氨基酸及其衍生物和10種其他物質(zhì)在嫁接前的茶樣中相對含量更高；而有25種黃酮、6種酚酸、5種氨基酸及其衍生物、4種有機(jī)酸、1種脂質(zhì)、1種鞣脂、1種生物堿、1種木脂素和香豆素物質(zhì)在嫁接后的茶樣中相對含量更高。

圖3 A1 vs B1差異代謝物分類圖Fig.3 A1 vs B1 differential metabolite classification map

為了更加直觀地比較茶樹在嫁接前后差異代謝物相對含量的變化情況，利用R軟件包繪制了如圖4所示的差異代謝物分類熱圖；結(jié)果表明，與嫁接前相比，嫁接后的茶樹大部分的黃酮類物質(zhì)的相對含量顯著增加，而脂質(zhì)類、核苷酸及其衍生物和以糖醇類為主的其他類物質(zhì)的相對含量則顯著減少。

圖4 差異代謝物分類熱圖Fig.4 Heat map of differential metabolite classification

為了更清楚地了解茶樹在嫁接前后代謝物差異倍數(shù)的變化情況，制作了如圖5所示的代謝物差異倍數(shù)柱狀圖，并將上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物中排名靠前的20位代謝物進(jìn)行展示。嫁接后茶樹中有7種黃酮（山奈酚-3-O-桑布雙糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷（煙花苷）、木犀草素-7-O-（2''-O-鼠李糖基）蕓香糖苷、葫蘆巴堿、木犀草素-6-C-葡萄糖苷-7-O-（6''-對香豆酰）葡萄糖苷、山奈酚-3-O-刺槐糖苷-7-O-鼠李糖苷（刺槐苷）、5,7,4'-三羥基異黃酮-7-O-半乳糖苷-鼠李糖、金圣草黃素-8-C-葡萄糖苷（金雀花素）），2 種氨基酸（N--乙酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-亮氨酸）的相對含量要明顯高于嫁接前；而有3種其它類物質(zhì)（D-果糖-1,6-二磷酸、吡哆素、1-（甘油-3-磷酸）-1D-肌醇）、2 種有機(jī)酸（2-羥基異己酸、DL-甘油醛-3-磷酸），2種酚酸（紫丁香苷、3,4'-二羥基-3'-甲氧基苯戊酸），1 種黃酮（山奈酚-3-O-（2-O-木糖基-6-O-鼠李糖基）葡萄糖苷），1 種鞣脂（2,3-二-O-沒食子酰-D-葡萄糖）和1種核苷酸及其衍生物（2-脫氧核糖-5'-磷酸）的相對含量則明顯低于嫁接前。說明嫁接后代謝物中相對含量較高的是黃酮和氨基酸，而嫁接前相對含量較高的是有機(jī)酸和酚酸。

圖5 代謝物差異倍數(shù)柱狀圖Fig.5 Histogram of metabolite difference multiple

2.4 差異代謝物通路分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果表明，共有38條通路，且差異代謝物主要分布在嘌呤代謝、煙酸酯和煙酰胺代謝、甘油磷脂代謝、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、光合生物的固碳作用、咖啡堿代謝、次級代謝產(chǎn)物的生物合成等20條代謝途徑中，如圖6所示。另外，在篩選出的105種具有顯著差異的代謝物中被KEGG注釋到的有24種，主要包括7種核苷酸及其衍生物、6種黃酮、3種其他、2種氨基酸及其衍生物、2種生物堿、2種有機(jī)酸、1種酚酸和1種脂質(zhì)；差異代謝物被注釋最多的是黃酮和核苷酸及其衍生物這2種類別；其中核苷酸及其衍生物類主要參與嘌呤代謝、次級代謝產(chǎn)物的生物合成和咖啡因代謝等多條代謝通路，且被KEGG注釋到的尿苷5'-二磷酸、7-甲基黃嘌呤、3-甲基黃嘌呤、鳥嘌呤、黃苷、2'-脫氧肌苷-5'-單磷酸和2-脫氧核糖-5'-磷酸這7種核苷酸及其衍生物均全部顯著下調(diào)；而黃酮類物質(zhì)主要參與類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、次級代謝產(chǎn)物的生物合成等多條代謝通路，且被KEGG注釋的6種黃酮中山奈酚-3-O-蕓香糖苷（煙花苷）、山奈酚-3-O-鼠李糖苷（阿福豆苷）（番瀉葉山奈苷）、矢車菊素-3-O-（6''-O-對香豆酰）葡萄糖苷、根皮素和芹菜素這5種代謝物則顯著上調(diào)，而柚皮素-7-O-葡萄糖苷（櫻桃苷）則顯著下調(diào)。

圖6 嫁接前后差異代謝物KEGG富集圖Fig.6 KEGG enrichment diagram of differential metabolite before and after grafting

3 討論

嫁接是茶樹良種繁育最直接有效的方法之一，通過嫁接可以最大程度地保留接穗品種的優(yōu)良特性，而茶樹作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其主要的價(jià)值就在茶樹的鮮葉上。鮮葉質(zhì)量是導(dǎo)致茶葉品質(zhì)形成的重要因素之一，而鮮葉質(zhì)量在很大程度是由里面的內(nèi)含物質(zhì)含量所決定的，所以研究茶樹嫁接前后代謝物含量的變化，能夠?yàn)榧藿硬铇涞牟枞~加工提供一定的理論參考。

通過前文的研究發(fā)現(xiàn)，茶樹嫁接前后代謝物具有明顯的差異性，分析代謝物的差異倍數(shù)可知，導(dǎo)致差異的主要原因可能是嫁接后茶樹中氨基酸和黃酮類物質(zhì)大量積累，以及酚酸和有機(jī)酸等物質(zhì)的消耗。另外，通過對KEGG代謝通路的分析，發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)顯著上調(diào)，而核苷酸及其衍生物則顯著下調(diào)；這可能與嫁接后茶樹中相關(guān)代謝通路中酶的活性或者基因的表達(dá)有關(guān)，但目前針對茶樹嫁接后代謝物的變化的研究較少，因此，嫁接茶樹代謝物的具體變化機(jī)理還需做進(jìn)一步探索。除此之外，吳珊等研究也發(fā)現(xiàn)嫁接后茶樹體內(nèi)游離氨基酸含量有所增加，同樣王文建將鐵觀音嫁接到6個(gè)不同品種砧木上，結(jié)果表明嫁接后的茶樹中氨基酸、茶多酚和水浸出物等含量增加，這與本文的研究結(jié)果大體一致。所以在接下來的研究中可以通過代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析的方法，對相關(guān)通路中的差異代謝物進(jìn)行進(jìn)一步的研究和分析。

4 結(jié)論

利用廣靶代謝組學(xué)技術(shù)對茶樹（桃形葉）嫁接前后的代謝物進(jìn)行檢測，兩組茶樣PCA表現(xiàn)出明顯的分離趨勢，說明茶樹嫁接前后代謝物具有較大的差異。另外，嫁接前后的茶樣中共篩選出10類105種具有顯著差異的代謝物，這些差異代謝物中的大部分黃酮類和氨基酸及其衍生物相對含量明顯增加，而脂質(zhì)類、核苷酸及其衍生物、酚酸類等物質(zhì)的相對含量則明顯減少，同時(shí)，分析代謝物的差異倍數(shù)，發(fā)現(xiàn)在嫁接后的茶樹中相對含量較高的代謝物是黃酮和氨基酸，而嫁接前相對含量較高的代謝物是酚酸和有機(jī)酸，這些滋味物質(zhì)含量的變化會對茶樹鮮葉品質(zhì)造成影響。此外，通過KEGG代謝通路的分析，發(fā)現(xiàn)代謝物在38條代謝通路中富集，且大部分的差異代謝物分布在嘌呤代謝、類黃酮生物合成、次級代謝產(chǎn)物的生物合成等20條代謝途徑中；與此同時(shí)，被KEGG注釋到的大部分黃酮類物質(zhì)顯著上調(diào)，而核苷酸及其衍生物則顯著下調(diào)。綜上所述，品種桃形葉通過嫁接會使代謝物的含量發(fā)生明顯的改變，這在一定程度上能夠?yàn)榧藿硬铇涞牟枞~加工、生產(chǎn)等提供參考。