產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌的篩選及其細(xì)菌素對(duì)大黃魚(yú)保鮮效果

許華娣，高騰琪，崔子杭，柳春勝，盤(pán)賽昆，楊 杰

（江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇連云港 222005）

乳酸菌（Lactici acid bacteria，LAB）是一類(lèi)能利用并發(fā)酵碳水化合物（主要指葡萄糖）產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱(chēng)，廣泛分布在傳統(tǒng)發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道、飼料和淤泥等生態(tài)環(huán)境中，其中發(fā)酵食品是拮抗性乳酸菌的重要來(lái)源之一。植物乳桿菌是一種常見(jiàn)的乳酸菌，在發(fā)酵碳水化合物的過(guò)程中可產(chǎn)生細(xì)菌素、過(guò)氧化氫和雙乙酰等抑菌物質(zhì)。細(xì)菌素不僅具有抗食源性致病菌和食品腐敗菌的特點(diǎn)，而且具有高效、無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，目前在食品工業(yè)、生物醫(yī)藥以及畜牧養(yǎng)殖等方面應(yīng)用廣泛。

近年來(lái)，已有大量關(guān)于乳酸菌細(xì)菌素的研究報(bào)道。趙圣明等通過(guò)硫酸銨沉淀、Sephadex LH-20凝膠層析純化、Hitrap QFF離子交換層析純化和反向高效液相色譜C柱純化得到了單一活性抑菌組分，對(duì)熒光假單胞菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和腸炎沙門(mén)氏菌具有明顯的抑制效果。馬國(guó)涵等通過(guò)乙酸乙酯萃取、超濾分離、Sephadex G-25過(guò)濾層析、HPLC從LP1-4發(fā)酵上清中分離得到一種細(xì)菌素，對(duì)銅綠假單胞菌等8株指示菌都具有良好的抑菌特性。由此可見(jiàn)，植物乳桿菌細(xì)菌素具有廣譜抗菌作用使其在食品保鮮方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

大黃魚(yú)（Large yellow croaker），是我國(guó)最大規(guī)模的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)和8大優(yōu)勢(shì)出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較高，但是蛋白質(zhì)和水分含量高導(dǎo)致極易腐敗，不僅會(huì)對(duì)消費(fèi)者健康產(chǎn)生不利影響，而且會(huì)造成相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，鮮魚(yú)較好的口感、中國(guó)人吃整魚(yú)的飲食習(xí)慣以及大黃魚(yú)的體型特征不適于切片方式銷(xiāo)售等因素，如何安全有效實(shí)現(xiàn)大黃魚(yú)整魚(yú)保鮮是亟待解決的實(shí)際問(wèn)題。目前，已有多種保鮮方式被應(yīng)用于大黃魚(yú)保鮮，相較于其他保鮮方式，生物保鮮的安全指數(shù)更高。生物保鮮劑分為植物源、動(dòng)物源以及微生物源保鮮劑，植物源和動(dòng)物源的保鮮劑應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮比較廣泛，而微生物源的比較少，趙鈺實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LLl 103粗提物能抑制大黃魚(yú)腐敗菌生長(zhǎng)，延長(zhǎng)其貨架期，細(xì)菌素最佳濃度為0.8 mg/mL。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選出產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌MMB-11，并將其細(xì)菌素粗提液應(yīng)用于大黃魚(yú)整魚(yú)的保鮮，以期為安全高效的大黃魚(yú)微生物源的生物保鮮劑開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵鯽魚(yú)和鹵水 貴州省黔東南州農(nóng)家；蝦醬連云港市巨龍路菜場(chǎng)；酸豇豆 南京六合農(nóng)家；金黃色葡萄球菌（）CICC 23656、希瓦氏腐敗菌（）ATCC 49138、嗜水氣單胞菌（）MCCC 1A00-190 實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；大黃魚(yú)（490～510 g） 購(gòu)自連云港家得福超市；過(guò)氧化氫酶200000 U/mg、蛋白酶K 30 U/mg、胰蛋白酶250 U/mg、胃蛋白酶3000 U/g

購(gòu)自阿拉丁公司；乳酸菌生化鑒定試劑盒 海博生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

YXQ-LS-50SI立式壓力蒸汽滅菌器 上海訊博實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋、DNP-9126型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；PHS-3CW Microprocessor pH/mV Merer 上海理大智能電子有限公司；SBS-160數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器、DNL-N電腦數(shù)顯定時(shí)恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；D-37520高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；3730XL測(cè)序儀 美國(guó)ABI；SH2-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 上海越眾儀器設(shè)備有限公司；RE52-AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

上海亞榮生化儀器廠；TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀 北京盈盛科技有限責(zé)任公司；HX-4GM無(wú)菌均質(zhì)器 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；BCD-537WLDPC冰箱 海爾智家股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的篩選 分別稱(chēng)取1 g酸魚(yú)、鹵水、蝦醬和酸豇豆，接種到裝有50 mL MRS液體培養(yǎng)基的藍(lán)蓋玻璃瓶，37 ℃富集培養(yǎng)48 h后用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)x取10、10、10涂布到MRS固體培養(yǎng)基平板上，涂布好的平板37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取白色不透明、邊緣整齊并且有明顯溶鈣圈的菌落37 ℃發(fā)酵48 h，測(cè)定上清液的抑菌活性。

1.2.2 乳酸菌發(fā)酵上清液的制備 參照孫杰等的方法并修改，將篩選出的乳酸菌按照1%的接種量接種到2000 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，按照8000 r/min、4 ℃離心15 min，得到發(fā)酵上清液，4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.3 指示菌菌懸液的制備 參照馬國(guó)涵等的方法并修改，將金黃色葡萄球菌（）CICC 23656、希瓦氏腐敗菌（）ATCC 49138、嗜水氣單胞菌（）MCCC 1A00190按照1%的接種量分別接種于50 mL瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，于4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.4 抑菌活性的測(cè)定 參照高鵬的方法，以金黃色葡萄球菌（）CICC 23656、希瓦氏腐敗菌（）ATCC 49138、嗜水氣單胞菌（）MCCC 1A00190為指示菌，采用打孔法，每個(gè)孔中加入50 μL的乳酸菌上清液，通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑的大小測(cè)定乳酸菌的抑菌活性。

1.2.5 乳酸菌的鑒定

1.2.5.1 乳酸菌的形態(tài)特征 將保藏的乳酸菌挑取一環(huán)進(jìn)行三區(qū)劃線(xiàn)，觀察單菌落的形態(tài)特征。然后挑取單菌落接種于50 mL 的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，取適量發(fā)酵液進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察。

1.2.5.2 生理生化鑒定 參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法對(duì)復(fù)篩出的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，使用乳酸菌鑒定試劑盒進(jìn)行乳酸菌生理生化鑒定。

1.2.5.3 16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 基于16S rDNA的分子生物學(xué)檢驗(yàn)：將復(fù)篩的菌株按照1%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，取細(xì)菌培養(yǎng)液1 mL，10000 r/min離心1 min，倒棄培養(yǎng)液，加入180 μL溶菌酶振蕩使菌體重懸，37 ℃水浴 30 min，加入 20 μL Proteinase K，振蕩混勻，再加入Buffer GB，振蕩混勻，70 ℃水浴10 min，然后過(guò)柱純化，DNA產(chǎn)物保存于-20 ℃。

PCR擴(kuò)增引物選擇細(xì)菌通用引物：27F和1492R；PCR 反應(yīng)的總體積為 50 μL：dd HO 38 μL，10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L MgCl3 μL，dNTP 2.5 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，DNA 聚合酶 0.5 μL，模板 1 μL；反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 30 s；54 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 終延伸5 min。

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列檢測(cè)。將測(cè)序得到的序列提交GenBank比對(duì)，再用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.6 乳酸桿菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的確定

1.2.6.1 乳酸的排除 參照高鵬的方法，菌株MMB-11活化發(fā)酵結(jié)束后8000 r/min，4 ℃下離心15 min棄沉淀取上清，用1 mol/L HCl和NaOH溶液將發(fā)酵上清液的pH調(diào)整至4.0、4.5、5.0、5.5，測(cè)定相同pH下MRS培養(yǎng)基的抑菌活性，排除酸對(duì)抑菌活性的影響。

1.2.6.2 過(guò)氧化氫的排除 參照高鵬的方法，取10 mL上清液pH調(diào)整至過(guò)氧化氫酶的最適pH7.0，然后取6 mL，添加過(guò)氧化氫酶6 mg，振蕩混勻后，37 ℃水浴保溫2 h，選擇同樣加酶處理的MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照。水浴結(jié)束后測(cè)定抑菌活性，確定抑菌物質(zhì)是否為過(guò)氧化氫。

1.2.6.3 蛋白酶水解實(shí)驗(yàn) 參照高鵬的方法，取40 mL離心上清液分成四份，一份不做處理作為對(duì)照，其余分別調(diào)整 pH1.9、8.0、7.9，各取 6 mL，分別添加胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K 6 mg，振蕩均勻，37 ℃水浴保溫2 h，測(cè)定離心上清液和酶處理組的抑菌活性，確定抑菌物質(zhì)是否為細(xì)菌素。

1.2.7 乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素分離純化及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 醇沉水提法初步分離MMB-11細(xì)菌素 參照劉苗等的方法，將MMB-11的濃縮發(fā)酵上清液取出放在燒杯中，緩慢加入無(wú)水乙醇并攪拌均勻，使燒杯中無(wú)水乙醇的最終濃度為75%，將該燒杯于4 ℃的冰箱中放置12 h后按照4 ℃，8500 r/min離心15 min，分別測(cè)定上清和沉淀的抑菌活性。

1.2.7.2 Sephadex LH-20層析分離MMB-11細(xì)菌素參照趙圣明等的方法并修改，將1.2.6.1中得到的上清濃縮并定容至50 mL，過(guò)濾后沿層析柱壁緩慢加樣3 mL，用 60% 色譜級(jí)甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，洗脫速度為0.7 mL/min，自動(dòng)部分收集器設(shè)定為每管收集3 min。洗脫結(jié)束后，收集各管組分并編號(hào)，測(cè)定各管的抑菌活性。

1.2.7.3 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 參照Ren等的實(shí)驗(yàn)，取1 mL細(xì)菌素粗提液，分別將其置于40、60、80、100 ℃ 水浴鍋保溫處理 20 min，121 ℃ 高壓滅菌處理15 min，測(cè)定其抑菌活性。

1.2.7.4 抑菌物質(zhì)的pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 參照Digaitiene等的實(shí)驗(yàn)，取1 mL細(xì)菌素粗提液，用1 mol/L的HCl和NaOH溶液將其pH分別調(diào)整至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，保持 2 h后調(diào)回發(fā)酵上清液的初始pH，以未處理的發(fā)酵上清液為對(duì)照，測(cè)定其抑菌活性。

1.2.8 植物乳桿菌MMB-11細(xì)菌素在大黃魚(yú)保鮮中的應(yīng)用

1.2.8.1 樣品處理 將大黃魚(yú)去鱗、去腮、去除內(nèi)臟之后洗凈晾干，然后隨機(jī)分成三組，空白組（C組）的大黃魚(yú)不做任何處理，陽(yáng)性對(duì)照組（N組）用1 g乳酸菌鏈球素加20 mL稀鹽酸配制成0.5% Nisin溶液涂抹大黃魚(yú)，MMB-11組（P組）用2000 mL發(fā)酵液分離純化的MMB-11的細(xì)菌素粗提液涂抹大黃魚(yú)，將處理后的大黃魚(yú)裝入無(wú)菌密封袋，4 ℃冰箱保藏，每隔3 d取樣測(cè)定。

1.2.8.2 感官評(píng)價(jià) 參照郭儒岳等的方法并稍作修改，由6名經(jīng)過(guò)水產(chǎn)品質(zhì)量培訓(xùn)的食品加工與安全專(zhuān)業(yè)研究生組成評(píng)估小組根據(jù)下列評(píng)分表從大黃魚(yú)氣味、肌肉組織、彈性、顏色、粘液情況定期（3 d）進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)（表1），綜合評(píng)分結(jié)果為各項(xiàng)得分之和的平均值。

表1 大黃魚(yú)的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria of large yellow croaker

1.2.8.3 pH的測(cè)定 參照GB 5009.237-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定，分別稱(chēng)取C組、N組以及P組5 g魚(yú)肉于無(wú)菌均質(zhì)袋，加入50 mL煮沸冷卻的蒸餾水拍打均質(zhì)2 min，后浸漬30 min，4000 r/min，離心10 min，測(cè)定上清液的pH。

1.2.8.4 菌落總數(shù)（TVC）的測(cè)定 參照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定，將涂布好的平板于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落總數(shù)。

1.2.8.5 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測(cè)定 參照GB 5009.228-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》修改用半自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定，以重復(fù)性條件下獲得的三次獨(dú)立測(cè)定的算數(shù)平均值表示。

1.2.8.6 質(zhì)構(gòu)特性（TPA）的分析 用解剖刀在CYC和WYC肌側(cè)線(xiàn)上方的中間位置切開(kāi)，將獲得肌肉部分切割成2 cm×2 cm×0.5 cm的小塊。使用平底柱形探頭p50（5 mm直徑），模擬人牙齒咀嚼食物，對(duì)大黃魚(yú)魚(yú)塊進(jìn)行2次壓縮質(zhì)構(gòu)儀質(zhì)地多面剖析模式測(cè)試。測(cè)試條件如下：探頭下降速率3.0 mm/s；測(cè)試速率0.5 mm/s；探頭回程速率3.0 mm/s；測(cè)試距離為10 mm；停留間隔時(shí)間1 s；觸發(fā)力5 g；環(huán)境溫度：12～16 ℃。每次測(cè)3個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，使用SPSS 25統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用 Duncan’s Multiple Range Test中的單因素方差分析（＜0.05）分析數(shù)據(jù)之間的差異性，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示數(shù)值。采用不同的字母表示同一貯藏時(shí)間不同處理方式之間存在顯著性差異，并用Origin 2019和MEGA 7.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的初篩與復(fù)篩

在初篩的235株菌中，根據(jù)抑菌圈直徑的大小，選取編號(hào)菌株 X8、X9、X14、X15、A16、L73、S49、MMB-11作為復(fù)篩的研究對(duì)象，結(jié)果如表2所示，MMB-11對(duì)金黃色葡萄球菌和希瓦氏腐敗菌的抑菌圈直徑分別為11.70±0.05 mm和11.40±0.05 mm，與其他菌株相比，其綜合抑菌活性最高，因此選擇MMB-11作為后續(xù)研究菌株。

表2 不同菌株的抑菌圈直徑Table 2 Diameters of inhibition zone of different strains

2.2 植物乳桿菌MMB-11的鑒定

2.2.1 乳酸菌的形態(tài)特征結(jié)果 MMB-11菌落形態(tài)如圖1所示，MMB-11菌落呈不透明的乳白色，邊緣整齊且表面光滑，是典型的乳酸菌的生長(zhǎng)特征；菌體經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡鏡檢觀察，其顏色呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體呈短桿狀或彎桿狀，有時(shí)呈鏈狀，無(wú)芽孢和鞭毛。

圖1 菌株MMB-11菌落形態(tài)及革蘭氏染色圖Fig.1 Colony morphology and Gram staining of MMB-11 strain

2.2.2 乳酸菌的生理生化鑒定結(jié)果 根據(jù)表3的生理生化鑒定結(jié)果表明菌株MMB-11發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)生氣體，明膠液化結(jié)果呈陰性，不能水解精氨酸產(chǎn)氨氣，可發(fā)酵葡萄糖、果糖、阿拉伯糖等多種糖，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，表明該菌株為植物乳桿菌。

表3 MMB-11生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical identification results of MMB-11 strain

2.2.3 菌株MMB-11 16S rDNA 鑒定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株MMB-11的DNA后，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過(guò)同源性比較，發(fā)現(xiàn)其與植物乳桿菌的相似度達(dá)95%，因此在綜合其形態(tài)特征觀察結(jié)果、生理生化試驗(yàn)結(jié)果和16S rDNA序列分析的結(jié)果基礎(chǔ)上，鑒定其為植物乳桿菌（圖2），命名為植物乳桿菌MMB-11。

圖2 MMB-11的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of MMB-11

利用MEGA7.0軟件構(gòu)建MMB-11系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，菌株MMN-11與植物乳桿菌在同一分支。

2.3 菌株MMB-11產(chǎn)抑菌物質(zhì)的鑒定

2.3.1 酸的排除 酸排除實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3，在發(fā)酵上清液的pH由4.0到5.5的過(guò)程中，其對(duì)金黃色葡萄球菌、希瓦氏腐敗菌和嗜水氣單胞菌的抑菌活性在逐漸變?nèi)?，pH為5.5時(shí)仍有一定的抑菌活性，而對(duì)照組MRS液體培養(yǎng)基在pH5.0時(shí)就已經(jīng)完全沒(méi)有抑菌活性。說(shuō)明在發(fā)酵上清液中，排除酸的抑菌作用后，存在其他具有抑菌作用的物質(zhì)。

圖3 MMB-11排酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of MMB-11 acid removal experiment

2.3.2 過(guò)氧化氫的排除 使用過(guò)氧化氫酶酶解上清液，若上清液中的抑菌物質(zhì)為HO，經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后的上清液抑菌活性將顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后，發(fā)酵上清液對(duì)于金黃色葡萄球菌、希瓦氏腐敗菌、嗜水氣單胞菌的抑菌活性并沒(méi)有顯著性變化，說(shuō)明過(guò)氧化氫不是發(fā)酵上清液中起抑菌作用的主要物質(zhì)。

圖4 MMB-11排過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of MMB-11 hydrogen peroxide removal experiment

2.3.3 蛋白酶水解實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌素都是蛋白質(zhì)或者多肽，所以經(jīng)蛋白酶水解處理發(fā)酵上清液后，上清液抑菌活性將顯著下降。馬國(guó)涵等通過(guò)蛋白酶水解實(shí)驗(yàn)確定了大菱鲆腸道中篩選出的乳酸菌可產(chǎn)細(xì)菌素，并分離純化了植物乳桿菌LP1-4。如圖5所示，經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K水解后，與原發(fā)酵液相比，其抑菌活性呈現(xiàn)出不同程度地下降，且與對(duì)照組相比差異顯著（＜0.05），說(shuō)明MMB-11中的抑菌物質(zhì)對(duì)酶敏感。因此，確定菌株MMB-11的發(fā)酵上清液中主要抑菌活性物質(zhì)為細(xì)菌素。

圖5 MMB-11蛋白酶水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of MMB-11 protease hydrolysis experiment

2.4 植物乳桿菌MMB-11細(xì)菌素分離純化及其性質(zhì)研究

2.4.1 醇沉水提分離細(xì)菌素 醇沉水提組分抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，處理后上清仍具有顯著的抑菌活性，而其沉淀沒(méi)有抑菌活性，表明醇沉水提法處理可以有效富集抑菌活性物質(zhì)，去除植物乳桿菌MMB-11發(fā)酵液中大量的蛋白、無(wú)機(jī)鹽、多糖等雜質(zhì)。

圖6 MMB-11 醇沉水提組分抑菌活性Fig.6 Antibacterial activities of the components of MMB-11 by alcohol precipitation

2.4.2 Sephadex LH-20層析分離純化細(xì)菌素 Sephadex LH-20層析后的抑菌結(jié)果如表4所示，MMB-11抑菌物質(zhì)分布在第59管到第81管之間，并且抑菌活性隨著洗脫體積的增加呈現(xiàn)先增強(qiáng)后下降的趨勢(shì)，第71管收集的組分對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性最大，抑菌圈直徑為17.75±0.07 mm，第69管對(duì)希瓦氏腐敗菌和嗜水氣單胞菌抑菌活性最大，抑菌圈直徑分別為18.25±0.05 mm和25.80±0.10 mm。將有抑菌活性的組分收集合并然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表4 Sephadex LH-20層析凝膠收集管抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of Sephadex LH-20 gel chromatography collection tube

2.4.3 植物乳桿菌MMB-11細(xì)菌素粗提液熱穩(wěn)定性研究 從圖7可以看出，經(jīng)過(guò)40、60、80、100 ℃保溫處理20 min以及121 ℃處理15 min之后，MMB-11的細(xì)菌素粗提液對(duì)于金黃色葡萄球菌、希瓦氏腐敗菌和嗜水氣單胞菌的抑菌圈與原來(lái)相比略有變化，40、60、80、100、121 ℃ 處理之后其抑菌活性變化不顯著（＞0.05），表明植物乳桿菌MMB-11的細(xì)菌素粗提液具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖7 MMB-11細(xì)菌素粗提液溫度耐受性Fig.7 MMB-11 bacteriocin crude extract temperature tolerance

2.4.4 植物乳桿菌MMB-11細(xì)菌素粗提液pH穩(wěn)定性研究 從圖8可以看出，植物乳桿菌MMB-11的細(xì)菌素粗提液的pH調(diào)整至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0后，其對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑菌活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但是仍然具有較強(qiáng)的抑菌活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌MMB-11的細(xì)菌素粗提液具有良好的pH穩(wěn)定性。

圖8 MMB-11細(xì)菌素粗提液pH耐受性Fig.8 MMB-11 bacteriocin crude extract pH tolerance

2.5 MMB-11細(xì)菌素粗提液應(yīng)用于大黃魚(yú)保鮮

2.5.1 不同處理方式對(duì)大黃魚(yú)感官評(píng)價(jià)的影響 大黃魚(yú)的感官評(píng)價(jià)結(jié)果如圖9所示，隨著貯藏時(shí)間的增加，感官評(píng)價(jià)的分值呈下降趨勢(shì)，保鮮效果的感官評(píng)價(jià)呈下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Nisin處理組和MMB-11處理組可獲得更好的感官評(píng)價(jià)，延長(zhǎng)大黃魚(yú)的鮮度接受時(shí)間，并且MMB-11處理組的感官評(píng)價(jià)明顯優(yōu)于Nisin處理組（＜0.05）。這與劉佳秀等的研究結(jié)果是一致的，這可能是由于大黃魚(yú)中天然存在的微生物能夠引起魚(yú)肉腐敗變質(zhì)，但是MMB-11細(xì)菌素粗提液具有良好的抑菌作用，延緩了大黃魚(yú)的腐敗變質(zhì)，因此，感官評(píng)價(jià)的結(jié)果更好。

圖9 感官評(píng)價(jià)分值隨著貯藏時(shí)間的變化Fig.9 The change of organoleptic evaluation scores in the process of storage

2.5.2 不同處理方式對(duì)大黃魚(yú)pH的影響 由于微生物的作用以及魚(yú)本身所含有的水解酶，大黃魚(yú)在貯藏的過(guò)程中，其pH先下降后上升，可能由于保藏前期，大黃魚(yú)中的糖原酵解產(chǎn)生乳酸，而到了保藏中期和后期，大黃魚(yú)體內(nèi)的內(nèi)源組織蛋白酶釋放出來(lái)了，加上微生物的作用導(dǎo)致抑菌物質(zhì)中的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨氣和胺類(lèi)等堿性揮發(fā)性物質(zhì)，使得大黃魚(yú)的pH在后期上升。圖10反映了4 ℃貯藏期間大黃魚(yú)在3種處理方式下pH的變化趨勢(shì)，與唐智鵬等以及許萍等的研究結(jié)果是一致的，表明MMB-11處理組能夠很好地延緩魚(yú)肉pH的變化。

圖10 pH隨著貯藏時(shí)間的變化Fig.10 The change of pH in the process of storage

2.5.3 不同處理方式大黃魚(yú)菌落總數(shù)（TVC）的變化菌落總數(shù)測(cè)定可以判定食品的細(xì)菌污染程度以及食品的衛(wèi)生質(zhì)量，菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，三組大黃魚(yú)的細(xì)菌菌落總數(shù)呈上升趨勢(shì)，這與高永悅等的研究結(jié)果一致，空白組的大黃魚(yú)細(xì)菌菌落總數(shù)上升的最快，Nisin處理組的次之，MMB-11處理組的最小。參照SC/T 2809-2018，大黃魚(yú)的一級(jí)鮮度，菌落總數(shù)≤10CFU/g，二級(jí)鮮度標(biāo)準(zhǔn)≤10CFU/g。第6 d時(shí)，MMB-11處理組的大黃魚(yú)還處于一級(jí)鮮度，而Nisin處理組已經(jīng)到了二級(jí)鮮度；到12 d空白組的細(xì)菌總數(shù)達(dá)到了1.10×10CFU/g，超出了二級(jí)鮮度，而Nisin處理組和MMB-11處理組還處于二級(jí)鮮度。結(jié)果表明，Nisin處理組和MMB-11處理組，可以有效抑制大黃魚(yú)魚(yú)肉中的細(xì)菌菌落總數(shù)，而且相較于0.5% Nisin溶液，MMB-11細(xì)菌素粗提液的保鮮效果更好。這可能由于大黃魚(yú)中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌希瓦氏腐敗菌是革蘭氏陰性菌，Nisin主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，而MMB-11對(duì)陽(yáng)性菌和陰性菌均有良好的抑制效果。因此，在MMB-11粗提液處理組的菌落總數(shù)顯著低于其他組。

圖11 菌落總數(shù)隨著貯藏時(shí)間的變化Fig.11 The change of TAC in the progress of strorage

2.5.4 不同處理方式大黃魚(yú)揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的變化 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）指動(dòng)物性食品在腐敗過(guò)程中，由于酶和細(xì)菌的作用，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨以及胺類(lèi)等堿性含氮物質(zhì)。此類(lèi)物質(zhì)具有揮發(fā)性，其含量越高，表明氨基酸被破壞的越多，特別是蛋氨酸和酪氨酸，因此營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到很大影響。

三種不同方式處理的大黃魚(yú)在冷藏期內(nèi)揮發(fā)性鹽基氮的變化曲線(xiàn)如圖12所示，結(jié)果表明三組大黃魚(yú)的揮發(fā)性鹽基氮總體都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這與史國(guó)萃等的研究結(jié)果一致?？瞻捉M的揮發(fā)性鹽基氮的值始終高于其他兩組，且在12 d的時(shí)候達(dá)到了31.37±0.21 mg/100 g，超出了大黃魚(yú)二級(jí)鮮度的標(biāo)準(zhǔn)30 mg/100 g。在3～9 d MMB-11處理組的揮發(fā)性鹽基氮一直顯著低于 Nisin處理組（＜0.05），到12 d時(shí)兩者的數(shù)值沒(méi)有顯著差異?？偟膩?lái)說(shuō)，在揮發(fā)性鹽基氮這一指標(biāo)上，Nisin處理組和MMB-11處理組的保鮮效果明顯優(yōu)于空白組（＜0.05），且MMB-11組效果在3～9 d時(shí)可以更好地抑制揮發(fā)性鹽基氮的增長(zhǎng)，這可能是與MMB-11處理組可以更好地延緩大黃魚(yú)pH上升有關(guān)。

圖12 TVB-N隨著貯藏時(shí)間的變化Fig.12 The change of TVB-N in the progress of strorage

2.5.5 不同處理方式大黃魚(yú)質(zhì)構(gòu)（TPA）的變化 質(zhì)構(gòu)分析如表5所示，研究了不同處理組對(duì)大黃魚(yú)貯藏過(guò)程中的硬度、彈性、黏聚性、膠黏性、咀嚼性和黏附性的影響，貯藏時(shí)間為3 d，三種不同處理方式的大黃魚(yú)各項(xiàng)指標(biāo)沒(méi)有顯著差異；貯藏6 d時(shí)，硬度、彈性、咀嚼性均發(fā)生了顯著變化；貯藏9 d時(shí)，硬度和黏聚性發(fā)生了顯著變化；貯藏12 d時(shí)，黏附性和硬度發(fā)生了顯著變化。結(jié)果表明在貯藏3 d時(shí)，三種處理方式對(duì)大黃魚(yú)的質(zhì)構(gòu)影響不顯著，在貯藏6～9 d時(shí)影響顯著，12 d時(shí)對(duì)黏附力和硬度影響最為顯著。

此外，從表5還可以發(fā)現(xiàn)不同處理方式的大黃魚(yú)的硬度總體是上升趨勢(shì)，但中間都出現(xiàn)了下降。這可能是大黃魚(yú)在死后，貯藏初期由于肌肉本身柔軟且富有彈性，而隨著貯藏時(shí)間的增加，肌肉開(kāi)始收縮變硬，使得其失去了彈性，進(jìn)入了僵硬期，導(dǎo)致硬度相應(yīng)上升，隨后由于蛋白質(zhì)受到內(nèi)源蛋白酶和腐敗微生物的降解導(dǎo)致蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，肌肉質(zhì)地發(fā)生軟化，彈性下降等變化。在彈性指標(biāo)上，不同處理方式的大黃魚(yú)在貯藏過(guò)程中總體上呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，這與Jiao等的研究相一致。而黏聚性、膠黏性以及咀嚼性主要跟彈性和硬度相關(guān)，其變化趨勢(shì)基本與彈性和硬度的變化趨勢(shì)吻合。不同處理方式的大黃魚(yú)黏附性總體呈下降趨勢(shì)，這可能是由于細(xì)胞間的結(jié)合力變小從而使得肌肉組織沒(méi)有那么緊密，這與感官評(píng)價(jià)評(píng)分相一致。因此，MMB-11處理組和Nisin處理組能夠顯著保持大黃魚(yú)貯藏期間的品質(zhì)，且MMB-11處理組效果更佳。

表5 不同貯藏時(shí)間的TPATable 5 The TPA in the process of storage

3 結(jié)論

本文從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選得到一株植物乳桿菌MMB-11，對(duì)金黃色葡萄球菌、希瓦氏腐敗菌和嗜水氣單胞菌均具有良好的抑制作用，進(jìn)一步通過(guò)抑菌成分分析以及蛋白酶水解實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵上清液中主要抑菌活性物質(zhì)為細(xì)菌素，該細(xì)菌素對(duì)蛋白酶敏感，且具有良好的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。最后通過(guò)感官評(píng)價(jià)、pH測(cè)定、菌落總數(shù)測(cè)定、揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定以及質(zhì)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，相較于空白組和0.5% Nisin處理組，MMB-11細(xì)菌素組對(duì)大黃魚(yú)具有良好的保鮮效果。研究結(jié)果表明，植物乳桿菌MMB-11在水產(chǎn)品綠色保鮮劑的開(kāi)發(fā)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，后續(xù)將對(duì)MMB-11的細(xì)菌素進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化并深入研究其相關(guān)特性、探索提高其細(xì)菌素產(chǎn)量的條件，為大黃魚(yú)整魚(yú)保鮮劑的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。