霍山石斛藥渣中多糖的提取、乙醇分級(jí)沉淀、純化和分子量測(cè)定

徐海軍，楊 洋，董雅琪，李天宇，張婭菲,爨淑楠，鄧 輝，郝經(jīng)文，戴 軍

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安 237012)

霍山石斛(俗稱米斛)是安徽省六安市霍山縣道地名貴中藥材[1]，其形如累米，根粗頂細(xì)，每節(jié)僅米粒長(zhǎng)短，成熟后長(zhǎng)度不超過(guò)10 cm。唐開(kāi)元年間，道家《道藏》曾將霍山石斛、天山雪蓮、三兩人參、百二十年首烏、花甲之茯苓、蓯蓉、深山靈芝、海底珍珠、冬蟲夏草等列為“中華九大仙草”，而霍山石斛名列其首[2]。《神農(nóng)本草經(jīng)》將霍山石斛列為上品仙草[3]。除了作為藥品使用外，霍山石斛也一直作為保健食品原料來(lái)使用。2019年9月《霍山石斛莖(人工種植)》安徽省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)正式發(fā)布，使霍山石斛作為食品原料應(yīng)用有了“合法”身份。多糖是霍山石斛的重要藥效成分，具有抗氧化、抗白內(nèi)障、抗肝損傷和肝纖維化、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗糖基化等藥理作用[4-8]。為了確定某制藥廠霍山石斛經(jīng)無(wú)水乙醇和水依次提取一次后剩下藥渣中的多糖含量及其組成特點(diǎn)，本項(xiàng)目提取、純化藥渣中的多糖，并用不同濃度乙醇對(duì)提取的多糖進(jìn)行分級(jí)沉淀，測(cè)定了含量最多的40%醇沉多糖及其鹽酸水解物的分子量分布，以便為充分利用寶貴的霍山石斛資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑

霍山石斛藥渣(由某藥廠提供，霍山石斛干莖依次經(jīng)無(wú)水乙醇和水提取一次后剩余的藥渣)；葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；豬胰淀粉酶(酶活≥50 U/mg，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)；氯仿、正丁醇、無(wú)水乙醇、丙酮、苯酚、濃硫酸、鹽酸、磷酸、氫氧化鈉、硝酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭Ｍ肝龃?MWCO3500 D，北京索萊寶科技有限公司)；DEAE-32纖維素(粒徑50 um，吸附載量180 mg HSA，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司)。

1.2 儀器

DD5臺(tái)式大容量低速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4型，常州國(guó)華電器有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140 A型，上海一恒科技有限公司)、電子分析天平(FA1204 B型，上海越平科技儀器有限公司)、旋渦混勻器(HYQ-2121A型，蘇州捷美電子有限公司)、冷凍干燥機(jī)(FD-1A-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52 AA型，上海亞榮生化儀器廠)、SHB-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1901型，北京普析通用儀器有限公司)、pH計(jì)(PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、ELEOS System型凝膠滲透色譜儀(美國(guó)Wyatt公司)、色譜柱(Shodex OHpak系列 SB-806串803，日本昭和電工株式會(huì)社)。

2 方法

2.1 藥渣中霍山石斛總多糖的提取、脫淀粉和脫蛋白

參照余剛等的方法[8]，將霍山石斛藥渣在65 ℃干燥箱中烘6小時(shí)，取出冷卻后用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩。每次稱取20 g藥渣粉末，裝在三角瓶中，按1∶40體積加入800 mL蒸餾水，85 ℃水浴加熱2小時(shí)，其間進(jìn)行多次振搖。水浴加熱結(jié)束后取出，冷卻后將水煮液用4層紗布過(guò)濾，取濾液。濾渣擠干后重新加1:40體積蒸餾水再水浴加熱2小時(shí)。這樣反復(fù)提取3次。合并3次濾液，4000 rpm離心10 min。取上清，80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1050 mL。加入4倍體積無(wú)水乙醇，使溶液乙醇終濃度為80%，4 ℃冷藏過(guò)夜，使多糖充分析出，再用8層紗布過(guò)濾(過(guò)濾時(shí)可用手?jǐn)D壓以加快過(guò)濾速度)，濾渣用95%乙醇洗滌2次，揮干。

將揮干的霍山石斛粗多糖用蒸餾水溶解，配成1%濃度。參照李婭等的方法(略加修改)脫淀粉[9]，即在1%霍山石斛粗多糖溶液中加入胰淀粉酶(終濃度為15 IU/mL)，40 ℃水解80 min。水解結(jié)束后沸水浴加熱5 min滅活淀粉酶，冷卻至室溫后，用Sevage法脫蛋白(重復(fù)5次)[8]，再用80%乙醇沉淀，沉淀分別用95%乙醇和丙酮洗2次，揮干后得霍山石斛精制總多糖，稱重，計(jì)算多糖提取率。

2.2 霍山石斛多糖乙醇分級(jí)沉淀

將上述制備的霍山石斛總多糖用蒸餾水配成1%溶液。參照文獻(xiàn)[10]和[11]方法(略加修改)進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀。先加入無(wú)水乙醇使多糖溶液的乙醇終濃度為30%，輕搖混勻后4 ℃冷藏過(guò)夜，8000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清。在上清中加入無(wú)水乙醇使多糖溶液的乙醇終濃度為40%，輕搖混勻后4 ℃冷藏過(guò)夜，8000 rpm 4℃離心10 min，取沉淀，得40%醇沉霍山石斛多糖，將其切成小塊攤在保鮮膜上20 ℃揮干。同法依次制備50%、60%、70%、80%醇沉霍山石斛多糖。根據(jù)分級(jí)沉淀結(jié)果，選取所占比例最高的40%醇沉多糖進(jìn)行進(jìn)一步純化。

2.3 40%醇沉霍山石斛多糖DEAE32層析、透析純化

將40%醇沉霍山石斛多糖配成2%濃度。用DEAE32柱進(jìn)行層析，每次上樣體積為2 mL。用蒸餾水進(jìn)行洗脫。流速為2.5 mL/min。每管收集10 mL洗脫液，用苯酚-硫酸法定性監(jiān)測(cè)每管洗脫液中多糖含量，即從每管洗脫液中取100 uL樣品，加入200 uL 5%苯酚，再加入1 mL濃硫酸，肉眼觀察洗脫液顏色變化，如果溶液呈黃色則表明其中含有多糖。對(duì)含有多糖的洗脫液收集管，進(jìn)一步用苯酚-硫酸法[12]測(cè)定多糖含量(以O(shè)D490值表示)，繪制洗脫曲線。

將含有多糖的洗脫液合并，80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至有一定黏度后，用截留分子量為3400 Da的透析袋透析。先用自來(lái)水流動(dòng)透析24小時(shí)；然后換成蒸餾水靜止透析12小時(shí)，再換一次蒸餾水，繼續(xù)透析12小時(shí)。透析結(jié)束后，將透析液裝在干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，冷凍后用真空冷凍干燥機(jī)凍干。

2.4 40%醇沉霍山石斛多糖中淀粉含量定性鑒定、蛋白含量和多糖含量測(cè)定

2.4.1 40%醇沉霍山石斛多糖中淀粉含量定性鑒定

參照李婭等的方法(略作修改)[9]，稱取適量40%醇沉霍山石斛多糖溶于蒸餾水中，配成1 mg/mL濃度的多糖溶液。取50 μL樣品溶液，滴在干凈的培養(yǎng)皿中，再滴入 200 μL碘試劑(含 0.02%碘的0.2%碘化鉀溶液)，觀察顏色變化，用0.1%可溶性淀粉溶液作陽(yáng)性對(duì)照。

2.4.2 40%醇沉霍山石斛多糖中蛋白含量測(cè)定

參照喬德亮[13]的方法，稱取100 mg 考馬斯亮藍(lán) G-250，溶于50 mL 95%乙醇，加入 100 mL 85%的磷酸，蒸餾水定容至 1 L，備用。精確配制 0.1 mg/mL 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液，用蒸餾水補(bǔ)充至 1 mL，加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán) G-250，混勻，放置 10 min。595 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。

40%醇沉霍山石斛多糖中蛋白質(zhì)含量測(cè)定：取3支試管，分別加入1mL 1mg/mL 多糖樣品溶液，再加入 5mL 考馬斯亮藍(lán) G-250，混勻，放置 10 min。595nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算出蛋白含量，取三管平行測(cè)定的平均值。

2.4.3 40%醇沉霍山石斛多糖中多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[12]。準(zhǔn)確稱取0.1 g烘干至恒重的葡萄糖，用蒸餾水定容至100 mL，得1 mg/mL葡萄糖溶液；用10 mL吸管從中取10 mL，定容至100 mL，得0.1 mg/mL 葡萄糖溶液，分別取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液加到10 mL塑料有蓋離心管中，用蒸餾水補(bǔ)至 1 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，再加入5 mL 濃硫酸，立即蓋上蓋子，渦旋混勻，靜置20 min，在冷水中冷卻，用空白管調(diào)零，490 nm 波長(zhǎng)測(cè)吸光度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。取3支試管，分別加入1 mL 0.1 mg/mL 多糖樣品溶液，參照上述方法測(cè)定多糖含量。根據(jù)回歸方程計(jì)算出樣品多糖含量，取三管平行測(cè)定的平均值。

2.5 40%醇沉霍山石斛多糖及其水解物分子量測(cè)定

參照李凡的方法[14]，將50 mL 40%醇沉霍山石斛多糖溶液(40 mg/mL)加到2 L 0.1 mol/L鹽酸溶液中，調(diào)pH至1.0，多糖終濃度為1 mg/mL，37 ℃水解 1 h 后，用氫氧化鈉調(diào) pH 至中性，透析除鹽后真空冷凍干燥獲得40%醇沉霍山石斛多糖水解物。

將40%醇沉霍山石斛多糖及其水解物樣品分別用超純水配成0.1 mg/mL濃度，用0.22 uL濾膜過(guò)濾后上樣檢測(cè)。色譜條件：檢測(cè)器：激光檢測(cè)器(LS)和示差檢測(cè)器(DRI)；流動(dòng)相：水+0.02% NaN3；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：500 uL。

3 結(jié)果

3.1 霍山石斛藥渣中多糖提取率

經(jīng)測(cè)定，霍山石斛藥渣多糖的提取率為12%。表明僅經(jīng)無(wú)水乙醇和水依次提取1次的霍山石斛藥渣中仍含有較多的多糖。

3.2 霍山石斛多糖分級(jí)醇沉結(jié)果

霍山石斛多糖用不同濃度乙醇分級(jí)沉淀后得到各組分多糖占總多糖的比例見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn)，40%醇沉的多糖所占總多糖的比例最大，達(dá)到51.5%；其次為50%乙醇沉淀的多糖，達(dá)到24.9%。乙醇濃度超過(guò)60%后沉淀的多糖所占比例均較小。因此，后續(xù)主要對(duì)占比最大的40%醇沉多糖進(jìn)行研究。

3.3 40%醇沉霍山石斛多糖DEAE-32層析時(shí)蒸餾水洗脫曲線

1%濃度40%醇沉霍山石斛多糖溶液經(jīng)DEAE-32層析，以蒸餾水為洗脫劑，每管收集洗脫液10 mL，前9管收集液用苯酚-硫酸法監(jiān)測(cè)多糖時(shí)沒(méi)有顏色變化，第10管時(shí)出現(xiàn)黃色，然后顏色逐漸變深，第16管時(shí)顏色變淺，第17管顏色又變深，第18管后顏色漸漸變淺，第23管時(shí)基本無(wú)色。獲得的洗脫曲線見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，40%醇沉霍山石斛多糖用DEAE-32層析、蒸餾水洗脫時(shí)可出現(xiàn)一個(gè)主要的洗脫峰，峰頂略有波折。純化的40%醇沉霍山石斛多糖冷凍干燥后呈疏松潔白海綿狀物(見(jiàn)圖2)。在用蒸餾水洗脫后，換用0.1～1 mol/L NaCl溶液洗脫時(shí)，基本未檢測(cè)到多糖，說(shuō)明40%醇沉霍山石斛多糖絕大部分為中性多糖。

表1 霍山石斛多糖分級(jí)醇沉結(jié)果

圖1 40%醇沉霍山石斛多糖DEAE-32層析蒸餾水洗脫曲線

圖2 冷凍干燥的40%醇沉霍山石斛多糖樣品

3.4 40%醇沉霍山石斛多糖樣品中淀粉含量定性鑒定結(jié)果

采用碘試劑法定性鑒定40%醇沉霍山石斛多糖中的淀粉含量，結(jié)果表明1%濃度的40%醇沉霍山石斛多糖遇碘試劑后不顯紫紅色，而1%可溶性淀粉溶液(陽(yáng)性對(duì)照)遇碘試劑后呈紫紅色，表明純化的40%醇沉霍山石斛多糖基本不含淀粉(見(jiàn)圖3)。

圖3 40%醇沉霍山石斛多糖樣品中淀粉含量定性鑒定結(jié)果注：圖中A和B分別為陽(yáng)性對(duì)照和樣品。

3.5 40%醇沉霍山石斛多糖中蛋白含量測(cè)定結(jié)果

采用考馬斯亮藍(lán)法獲得的蛋白含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=194.33x+1.6765(R2=0.9944)。根據(jù)回歸方程計(jì)算得到40%醇沉霍山石斛多糖樣品中蛋白含量為0.78%。

3.6 40%醇沉霍山石斛多糖中多糖含量測(cè)定結(jié)果

采用苯酚-硫酸法測(cè)定40%醇沉霍山石斛多糖樣品中多糖含量，獲得的葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=106.66x，R2=0.9998。根據(jù)回歸方程計(jì)算得到樣品中多糖含量約為90.61%。

3.7 40%醇沉霍山石斛多糖分子量測(cè)量結(jié)果

40%醇沉霍山石斛多糖重均分子量(Mw)為6萬(wàn)，數(shù)均分子量(Mn)為5.3萬(wàn)。Mw/Mn=1.136，說(shuō)明40%醇沉霍山石斛多糖分子大小相對(duì)較均一。分子量分布結(jié)果(見(jiàn)表2)表明49%的多糖分子量在4萬(wàn)～4.8萬(wàn)，47.2%的多糖分子量在4.8萬(wàn)～13萬(wàn)，另有3.8%的多糖分子量在13萬(wàn)～22萬(wàn)。說(shuō)明40%醇沉霍山石斛多糖的分子量總體上相對(duì)較小。

表2 40%醇沉霍山石斛多糖分子量分布

40%醇沉霍山石斛多糖水解物重均分子量(Mw)為2.4萬(wàn)，數(shù)均分子量(Mn)為0.59萬(wàn)。Mw/Mn=4.1，說(shuō)明水解物中的多糖分子大小很不均一。40%醇沉霍山石斛多糖水解物分子量分布情況見(jiàn)表3。從表3可知，40%醇沉霍山石斛多糖經(jīng)鹽酸適度水解后，其分子量急劇降低，其63.9%的多糖分子量在0.13萬(wàn)～0.8萬(wàn)，30.2%的多糖分子量在0.8萬(wàn)～7.8萬(wàn)，分子量超過(guò)7.8萬(wàn)的多糖只有5.9%。

表3 40%醇沉霍山石斛多糖水解物分子量分布

4 討論

霍山石斛中的多糖含量一般為17%～28%左右[6]。本研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛藥渣中殘留有較為可觀的多糖，其含量達(dá)到12%。但這些多糖的分子量相對(duì)較小，例如所占比例最高的40%醇沉霍山石斛多糖重均分子量(Mw)只有6萬(wàn)。鄧輝報(bào)道霍山石斛多糖中有52.34%的多糖重均分子量小于1萬(wàn)[15]，21.83%的多糖重均分子量在1萬(wàn)～5萬(wàn)，重均分子量在5萬(wàn)～20萬(wàn)的多糖占16.38%，重均分子量在20萬(wàn)～50萬(wàn)的多糖占6.31%，重均分子量大于50萬(wàn)的多糖占3.14%。秦丹陽(yáng)等研究發(fā)現(xiàn)[16]，霍山石斛多糖在1—4月及10—12月主要由兩個(gè)組分構(gòu)成，組分1的分子量在9.6萬(wàn)～53.8萬(wàn)，組分2的分子量在2.7萬(wàn)～9.97萬(wàn)，而在5—9月份(夏季)只存在高分子量的組分1，低分子量的組分2基本消失。郝杰等測(cè)得霍山石斛總多糖的重均分子量(Mw)為25.2萬(wàn)[17]，用40%、50%、60%和80%的乙醇對(duì)霍山石斛總多糖分級(jí)沉淀，分別獲得重均分子量(Mw)為47.9萬(wàn)、31.6萬(wàn)、30.7萬(wàn)和8.59萬(wàn)的多糖。李明智等發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛純多糖及其分級(jí)組分均主要為中性糖[18]，并且純多糖和30%、40%、50%乙醇分級(jí)沉淀獲得的多糖分子量分別為26.2萬(wàn)、31.5萬(wàn)、24.8萬(wàn)、20.3萬(wàn)，50%乙醇沉淀上清中的多糖分子量為13.6萬(wàn)，且各組分均一性良好。這些研究結(jié)果表明不同濃度乙醇能沉淀多大分子量的多糖似乎沒(méi)有特定數(shù)值限定，可能還同時(shí)受到多糖分子量大小以外的其他因素(例如多糖的空間結(jié)構(gòu)、極性大小等)的影響。鑒于乙醇分級(jí)沉淀在分離不同分子量大小多糖中具有成本低、效率高、便于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)，仍有必要深入研究完善該技術(shù)在制備高生物活性多糖中的應(yīng)用。

分子量大小是影響多糖藥理活性的重要因素之一[19-22]。因?yàn)榉肿恿吭酱蟮亩嗵瞧浞肿芋w積也越大，以致不利于跨膜進(jìn)入生物體內(nèi)，而影響其生物活性的發(fā)揮，相反，多糖的分子量越小則容易與活性位點(diǎn)結(jié)合，但是如果分子量過(guò)小又不利于形成聚合結(jié)構(gòu)[23]。研究表明分子量在5萬(wàn)～20萬(wàn)的多糖可能具有顯著的抗腫瘤活性[24，25]。因此，本研究中40%醇沉霍山石斛多糖的重均分子量(Mw=6萬(wàn))仍在此范圍內(nèi)，理論上依然具有較好的藥理活性。

對(duì)于大分子多糖，采取適當(dāng)方法降低其分子量，可以提高其生物活性[26]。江曙等研究表明黃蜀葵莖葉多糖的自由基降解產(chǎn)物可提高免疫活性[27]。江曙等還報(bào)道原本無(wú)明顯免疫調(diào)節(jié)活性的黃蜀葵莖葉多糖經(jīng)鹽酸適度水解后[28]，可生成有顯著免疫調(diào)節(jié)活性的多糖。李凡報(bào)道霍山石斛多糖DHP-2A經(jīng)鹽酸水解后可生成穩(wěn)定的可吸收多糖片段[14]。本研究表明40%醇沉霍山石斛多糖用鹽酸水解后調(diào)pH至中性，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后多糖溶液呈乳白色，并在透析時(shí)在透析袋底部析出白色沉淀，而上清保持澄清。推測(cè)該白色沉淀為多糖中的蛋白質(zhì)遇鹽酸發(fā)生變性，然后在透析過(guò)程中因?yàn)槿芤褐宣}的濃度漸漸降低，導(dǎo)致對(duì)變性蛋白顆粒的浮力效應(yīng)喪失而使變性蛋白發(fā)生沉淀。李凡在制備鹽酸水解石斛多糖時(shí)[14]，用的是純化的霍山石斛多糖DHP-2A，其中不含有蛋白，所以未發(fā)生蛋白遇強(qiáng)酸變性和透析時(shí)析出沉淀的現(xiàn)象。有趣的是，40%醇沉多糖的分子量分布范圍為4萬(wàn)～22萬(wàn)，但40%醇沉多糖水解物的分子量分布范圍為0.26萬(wàn)～64.5萬(wàn)，后者的最大分子量反而顯著增加。其原因尚不清楚。有可能是部分變性的糖蛋白纏繞在一起使多糖分子量增加。關(guān)于利用鹽酸水解高分子量石斛多糖來(lái)提高其生物活性的適宜方法(例如適宜pH值、水解時(shí)間、水解溫度等)還需更多的研究。

本研究制備的40%醇沉霍山石斛多糖樣品中含有0.78%的蛋白質(zhì)。這些微量的蛋白質(zhì)可能屬于糖蛋白，在用Sevage法脫蛋白時(shí)不易全部被去掉。然而，有研究表明霍山石斛中的糖蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性強(qiáng)于純的多糖[29]。這似乎提示霍山石斛多糖中保留一部分蛋白質(zhì)對(duì)于增強(qiáng)其生物活性是有益的。因此在制備霍山石斛多糖時(shí)，不必苛求盡量脫除蛋白。

5 結(jié)論

霍山石斛藥渣中殘留有較高含量(12%)的多糖，但其分子量明顯低于未提取前的霍山石斛?；羯绞幵?0%醇沉多糖占總多糖的比例最高，達(dá)到51.5%，其重均分子量為6萬(wàn)，尚屬于活性高的多糖分子量范圍。用鹽酸水解后可使大部分40%醇沉霍山石斛多糖分子量急劇降低，但有少量多糖分子量反而明顯增加，具體原因還有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用霍山石斛藥渣中的多糖資源提供了初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。