一年蓬中焦袂康酸對臨床致病關(guān)鍵酶的抑制作用研究

丁俊楠，錢鵬旭，遲東澤，郭鑫*，臧皓*

(1.通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，通化 134002；2.吉林省藥品審核查驗(yàn)中心，長春 130062)

一年蓬又名牙腫消、治瘧草等，為菊科飛蓬屬植物[1]，原產(chǎn)北美洲，于19世紀(jì)末傳入中國，其繁殖力強(qiáng)、分布廣，在我國主要分布于吉林省、河北省、山東省、江蘇省、安徽省、浙江省、江西省、福建省、四川及西藏等地，多生于路邊曠野或山坡荒地[2]。該植物為一年或兩年生草本，莖粗壯，高度約為0.3～1米，直立生長，其上部具有分枝，基部葉于花期時枯萎；上部多為長圓形或?qū)捖研?，少?shù)為近圓形，下部葉與基部葉具有相同形狀，但葉柄較短，中部和上部的葉較小，為長圓狀披針形或披針形；頭狀花序一般具有數(shù)個或多個，排列成疏圓錐花序樣，花期為6月到9月[3]。該植物中主要含有黃酮類、萜類、有機(jī)酸等成分[4]，具有改善微循環(huán)、降低血液粘度、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等多方面的藥理作用[5-6]，常被民間醫(yī)學(xué)用于治療瘧疾、消化不良，腸炎，流行性肝炎，淋巴結(jié)炎，急性炎癥和肥胖等疾病。但其作用機(jī)制尚不明確。

脲酶[7]也稱尿素溶液酶，歸屬于氟苯酶類-尿素溶液酰胺基水解酶。其具有很高的特異性，它能夠催化反應(yīng)氟苯類化合物、尿素溶液造成二氧化碳和氨。氨會加快腸黏膜細(xì)胞的脆化，進(jìn)而影響腸胃對營養(yǎng)元素的消化吸收。酪氨酸酶[8]又稱多酚氧化酶等，是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含多亞基的含銅氧化還原酶，廣泛存在于微生物、動植物和人體中，具有著廣泛的用途，在生物體內(nèi)具有多種重要的生理功能，特別在皮膚美白、抗氧化作用等方面表現(xiàn)尤為突出。黃嘌呤氧化酶[9]是一種黃素蛋白酶，存在于各種生物體中，可催化體內(nèi)的嘌呤底物形成尿酸。對于痛風(fēng)等疾病的患者來說，黃嘌呤氧化酶抑制劑無疑是他們選擇用藥的方式之一，因此對于黃嘌呤氧化酶抑制劑的進(jìn)一步的挖掘也是十分必要的。

本實(shí)驗(yàn)以一年蓬中焦袂康酸為研究對象，對其進(jìn)行脲酶抑制實(shí)驗(yàn)、酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)以及黃嘌呤氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)研究，旨在為一年蓬的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

焦袂康酸，實(shí)驗(yàn)室自制；無水磷酸二氫鉀（99.5%）、無水磷酸氫二鉀（99%）、無水磷酸氫二鈉（99%）、無水磷酸二氫鈉（99%）薩恩化學(xué)；次氯酸鈉、硫脲、苯酚、硝普鈉、尿素 西亞化學(xué)；脲酶、黃嘌呤氧化酶、酪氨酸酶、別嘌醇、熊果苷，美國sigma公司；NaOH、HCl、乙醇等常規(guī)化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

VDHG-9245A型恒溫箱，上海一恒科技有限公司；TDL-5-A型號低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器；HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海-恒科技有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海-恒科學(xué)儀器有限公司；HY-2旋渦混勻儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BSA224S-CW型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器；ReadMax1900Plus型光吸收酶標(biāo)儀，上海閃普生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脲酶抑制實(shí)驗(yàn)

參照[10]的方法，略有改動。焦袂康酸樣品及陽性參比樣品硫脲的溶液配制均采用PBS。配制100 mM/L的尿素溶液、5 U/mL的脲酶溶液、1%苯酚溶液、0.5%氫氧化鈉溶液備用。在96孔板中加入40 μL尿素溶液、10 μL脲酶溶液以及10 μL樣品溶液后混勻，于37℃孵化30 min，再加40 μL苯酚溶液溶液和40 μL氫氧化鈉溶液，混勻，再于37℃孵化30 min。測定其在625 nm處的吸光度值記為As，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；在96孔板中加入40 μL尿素溶液、10 μLPBS溶液以及10 μL樣品溶液后混勻，于37℃孵化30 min，再加40 μL苯酚溶液溶液和40 μL氫氧化鈉溶液，混勻，再于37℃孵化30 min。測定其在625 nm處的吸光度值記為Ac，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；在96孔板中加入40 μL尿素溶液、10 μL脲酶溶液以及10 μL PBS溶液后混勻，于37℃孵化30 min，再加40 μL苯酚溶液溶液和40 μL氫氧化鈉溶液，混勻，再于37℃孵化30 min。測定其在625 nm處的吸光度值記為Ab，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；按下列公式計(jì)算抑制率。

1.2.2 酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)

參照[11]的方法，略有改動。焦袂康酸樣品及陽性參比樣品熊果苷的溶液配制均采用PBS。配制0.1 M的PBS、200U/mL酪氨酸酶溶液和5mM L-酪氨酸溶液。在96孔板中加入100 μL L-酪氨酸溶液、20 μL 0.1M PBS和40 μL樣品以及40 μL酪氨酸酶溶液于37℃孵化20 min后，在450 nm處測定OD值記為As，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；在96孔板中加入100 μL L-酪氨酸溶液、20 μL 0.1M PBS和40 μL樣品以及40 μLPBS溶液于37℃孵化20 min后，在450 nm處測定OD值記為Ac，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；在96孔板中加入100 μL L-酪氨酸溶液、20 μL 0.1M PBS和40 μL PBS溶液以及40 μL酪氨酸酶溶液于37℃孵化20 min后，在450 nm處測定OD值記為Ab，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；

1.2.3 黃嘌呤氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)

參照[12]的方法，略有改動。焦袂康酸樣品及陽性參比樣品別嘌醇的溶液配制均采用PBS。配制0.07 M的PBS、0.01 U/mL黃嘌呤氧化酶、150 μM黃嘌呤溶液和1N HCl溶液。在96孔板中加入30 μL黃嘌呤氧化酶溶液、35 μL PBS和50 μL樣品于25℃孵化15 min后，在加入60 μL黃嘌呤溶液，于25℃孵化30 min，加入25 μL 1N HCl終止反應(yīng)，混勻后立刻在290 nm下測OD值記為As進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；在96孔板中加入30 μLPBS溶液、35 μL PBS和50 μL樣品于25℃孵化15 min后，在加入60 μL黃嘌呤溶液，于25℃孵化30 min，加入25 μL 1N HCl終止反應(yīng)，混勻后立刻在290 nm下測OD值記為Ac進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；在96孔板中加入30 μL黃嘌呤氧化酶溶液、35 μL PBS和50 μL PBS溶液于25℃孵化15 min后，在加入60 μL黃嘌呤溶液，于25℃孵化30 min，加入25 μL 1N HCl終止反應(yīng)，混勻后立刻在290 nm下測OD值記為Ab進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)；按下列公式計(jì)算抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)來進(jìn)行差異性顯著分析，其中P＜0.05差異顯著；Office excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖，每次試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制脲酶的能力

一年蓬中焦袂康酸對試驗(yàn)體系中的脲酶有顯著的抑制作用（P＜0.05），如圖1所示，硫脲溶液對脲酶的抑制效果非常顯著，與硫脲相比，當(dāng)一年蓬中焦袂康酸質(zhì)量濃度小于200 μg/mL時，清除率變化不顯著；當(dāng)濃度大于200 μg/mL時，隨著一年蓬中焦袂康酸濃度增加，對脲酶的抑制效果顯著增強(qiáng)；在500 μg/mL時達(dá)最大清除率64.78%。

圖1 脲酶抑制活性

2.2 抑制酪氨酸酶的能力

一年蓬中焦袂康酸對試驗(yàn)體系中的酪氨酸酶有顯著的抑制作用（P＜0.05），如圖2所示，熊果苷溶液對酪氨酸酶的抑制效果非常顯著，與熊果苷相比，當(dāng)一年蓬中焦袂康酸質(zhì)量濃度小于600 μg/mL時，清除率隨著濃度的不斷生高而顯著升高；當(dāng)濃度大于600 μg/mL時，隨著一年蓬中焦袂康酸濃度增加，對酪氨酸酶的抑制效果變化不顯著；在750 mg/mL時達(dá)最大清除率68.85%。

圖2 酪氨酸酶抑制活性

2.3 抑制黃嘌呤氧化酶的能力

一年蓬中焦袂康酸對試驗(yàn)體系中的黃嘌呤氧化酶有顯著的抑制作用（P＜0.05），如圖3所示，別嘌醇溶液對黃嘌呤氧化酶的抑制效果非常顯著，與別嘌醇相比，當(dāng)一年蓬中焦袂康酸質(zhì)量濃度小于300 μg/mL時，清除率變化并不顯著；當(dāng)濃度大于300 μg/mL時，隨著一年蓬中焦袂康酸濃度增加，對黃嘌呤氧化酶的抑制效果變化顯著；在750 μg/mL時達(dá)最大清除率77.86%。

圖3 黃嘌呤氧化酶抑制活性

3 結(jié)論與討論

一年蓬中焦袂康酸的脲酶抑制率、酪氨酸酶抑制率以及黃嘌呤氧化酶抑制率在一定范圍內(nèi)均隨作用濃度的增大而活性增強(qiáng)，表現(xiàn)出較好的酶抑制活性。本實(shí)驗(yàn)中僅以一年蓬中焦袂康酸作為研究對象，進(jìn)行了體外酶活性抑制的研究，并未研究其內(nèi)在的藥理功效，可進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)物質(zhì)的深入的藥理學(xué)試驗(yàn)研究，進(jìn)一步探索一年蓬中焦袂康酸的藥理活性及功效，為今后一年蓬的開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。