丁酸鹽與β-羥基丁酸鹽在脊髓損傷中的抗炎作用

馮 婧， 劉建成， 張安仁

(1)成都中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)與理療學(xué)專業(yè)， 成都 610075； 2)中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科， 成都 610083；3)同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科， 上海 200080)

英國醫(yī)學(xué)雜志《柳葉刀》研究顯示，2016年全球脊髓損傷發(fā)病率、患病率和傷殘損失壽命年率(years lost due to disability, YLD)分別為13/10萬、368/10萬和130/10萬[1]。據(jù)國內(nèi)學(xué)者統(tǒng)計(jì)，2017年中國創(chuàng)傷性脊髓損傷發(fā)病率、患病率和YLD分別為9.51/10萬、340.10/10萬和93.54/10萬[2]。脊髓損傷的病理過程可分為2個(gè)階段：原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，前者是決定性的不可逆性的損傷，后者在一定時(shí)間內(nèi)是可逆的，故治療主要以減輕繼發(fā)性損傷為主。目前，仍然未見有效的治療脊髓損傷的方式。炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷發(fā)展的主要原因，是影響脊髓損傷的病情和恢復(fù)的重要因素[3]。近年的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽(Butyrate)治療可防治多種疾病的炎癥反應(yīng)進(jìn)展，包括牙周炎[4]、非酒精性脂肪性肝病[5]和結(jié)腸炎[6]等。其機(jī)制可能是：通過增加叉頭框蛋白O3(forkhead box O3，F(xiàn)OXO3)的表達(dá)促進(jìn)初始T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[7]，《自然》子刊的新研究證實(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)炎癥反應(yīng)[8]；減少腸道中的活性氧從而減少核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)活化[9]；抑制 NF-κB 信號(hào)通路的活性[10]；抑制組蛋白的去乙酰化及激活G蛋白偶聯(lián)受體[11]；抑制 JAK-STAT 通路的活性，STAT1 的異常活性與炎癥疾病有關(guān)[12]。β-羥基丁酸鹽(β-Hydroxybutyrate或3-Hydroxybutyrate)是與丁酸鹽密切相關(guān)的酮體代謝物，在痛風(fēng)[13]和酒精性肝炎[14]等疾病中被證實(shí)可作為一種抗炎分子。β-羥基丁酸鹽的抗炎作用主要通過抑制NLRP3炎性小體來實(shí)現(xiàn)[13, 15]，此外，也可能通過激活G蛋白偶聯(lián)受體[14]，上調(diào)MAP3K8等抗炎因子及降低促炎基因α腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及白細(xì)胞介素(interleukin, IL)類IL-6和IL-12等的表達(dá)[16, 17]，抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活及JNK和AMPK蛋白磷酸化[17]等途徑發(fā)揮抗炎作用。由此可知，丁酸鹽與β-羥基丁酸鹽具有相似的抗炎分子機(jī)制，故本文將兩者放在一起討論。丁酸鹽與β-羥基丁酸鹽的抗炎作用引起眾多學(xué)者的關(guān)注。引起本文注意的是，已有研究證實(shí)：其可改善脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，但相關(guān)研究較少，且停留在基礎(chǔ)研究層面。因此，本綜述將通過回顧國內(nèi)外文獻(xiàn)，總結(jié)丁酸鹽與β-羥基丁酸鹽在脊髓損傷后炎癥反應(yīng)中的應(yīng)用。

1 丁酸鹽與β-羥基丁酸鹽的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)生

1.1 丁酸鹽的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)生

丁酸鹽是一種4碳的短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)，其分子式為CH3CH2CH2COOH(見Fig.1)，所有哺乳動(dòng)物的腸道均會(huì)產(chǎn)生有限的丁酸鹽。丁酸鹽在維持腸道健康方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[18,19]，它可以影響免疫調(diào)節(jié)[20]、細(xì)胞分化和凋亡[21]，同時(shí)也是結(jié)腸細(xì)胞的首選碳源[22]。已知有4種主要的丁酸鹽產(chǎn)生途徑，即乙酰輔酶 A(acetyl-CoA)通路、戊二酸(glutarate)通路、賴氨酸(lysine)通路和琥珀酸(succinate)通路(見Fig.1)。最普遍的是乙酰輔酶A途徑，不易消化的碳水化合物產(chǎn)生丙酮酸(pyruvate)，丙酮酸發(fā)酵產(chǎn)生乙酰輔酶A，或由乳酸鹽(lactate)產(chǎn)生。4種途徑匯聚在中間產(chǎn)物巴豆酰輔酶A(crotonyl-CoA)，繼而通過丁酸激酶(butyrate kinase, BUK)將丁酰輔酶A (butyryl-CoA)磷酸化形成的磷酸丁鹽轉(zhuǎn)化為丁酸鹽，或通過丁酰輔酶A:乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(butyryl-CoA:acetate-CoA transferase，BUT)基因?qū)⒍□］o酶A直接轉(zhuǎn)變?yōu)槎∷猁}[23-25]。有很多細(xì)菌例如來自丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii曾經(jīng)被命名為Fusobacteriumprauznitzii)、羅氏菌屬(Roseburia)、真細(xì)菌(Eubacterium)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)、糞厭氧菌(Anaerostipes)等菌屬的細(xì)菌，能夠在腸腔中產(chǎn)生mM水平的丁酸鹽[26-29]。

1.2 β-羥基丁酸鹽的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)生

哺乳動(dòng)物生物體的能量代謝通常依賴于碳水化合物消化。當(dāng)碳水化合物缺乏時(shí)，肝內(nèi)線粒體自然產(chǎn)生酮體(包括β-羥基丁酸、乙酰乙酸和丙酮)作為能量燃料。其中，β-羥基丁酸鹽占比超過70%。β-羥基丁酸鹽的分子式為CH3CH(OH)CH2COOH，在其結(jié)構(gòu)中包含1個(gè)丁酸核，與丁酸鹽在結(jié)構(gòu)上僅有1個(gè)羥基不同(見Fig.1)。β-羥基丁酸鹽的合成途徑(見Fig.1)：來自三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle, TCA)的2個(gè)乙酰輔酶A分子，其通過β-酮硫解酶縮合為乙酰乙酰輔酶A (acetoacetyl CoA)，并通過乙酰乙酰輔酶A還原酶還原為3-羥基丁酰輔酶A(3-Hydroxy-3-metyloglutaryl-CoA)來直接合成β-羥基丁酸鹽。有研究表明，除了主要來自肝內(nèi)合成的β羥基丁酸鹽外，動(dòng)物體內(nèi)的部分β-羥基丁酸鹽來自微生物組產(chǎn)生的聚羥基丁酸的降解[30- 32]。

綜上，丁酸鹽與β-羥基丁酸鹽結(jié)構(gòu)具有相似性，有趣的是，兩者似乎在代謝上也相互影響(見Fig.1)。有研究證實(shí)，注入丁酸鹽可以增加動(dòng)物體內(nèi)的丁酸鹽與β-羥基丁酸鹽水平[33]，且后者隨注入丁酸鹽含量的增加而線性升高[34]。因此，將兩者一起進(jìn)行討論是有意義的。

Fig.1 Synthesis paths of butyrate There are four main butyrate production pathways known. Apart from the most prevalent Acetyl-Coenzyme A (AcCoA) pathway, where AcCoA is produced via pyruvate derived from fermentation of host-indigestible carbohydrates (known as‘fibre’) or via lactate, there are three alternative synthesis pathways described, starting from glutarate, lysine, and succinate, which converge on the intermediate product crotonyl-CoA. The final step in butyrogenesis is the conversion of either butyryl-phosphate to butyrate by the butyrate kinase, encoded by the buk gene, or butyry-CoA to butyrate by the butyryl-CoA: acetate CoA-transferase, encoded by the but gene

2 丁酸鹽、β-羥基丁酸鹽與脊髓損傷炎癥

炎癥反應(yīng)是造成脊髓繼發(fā)性損傷的主要原因，在脊髓損傷的病理生理學(xué)發(fā)展過程中處于中心地位。脊髓損傷后急性期(受傷后 0 ～ 2 d)，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤到損傷部位以吞噬細(xì)胞碎片和髓鞘。活性氧(reactive oxygen species, ROS)激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，分泌白細(xì)胞介素(interleukin, IL)和更多ROS。在亞急性期(受傷后3 d至數(shù)周)，巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞處于M1表型并分泌維持促炎微環(huán)境的白細(xì)胞介素(IL-6、IL-12、IL-1β)和趨化因子(CCL2、CXCL2)。損傷區(qū)域還有 Th1 細(xì)胞，也可以分泌白細(xì)胞介素(IL-12、TNF-α、IFN-γ等)。在慢性期(受傷后7周至數(shù)年)，星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌抗炎性白細(xì)胞介素(IL-10、TGF-β)，將小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂锌寡鬃饔玫腗2型，通過分泌生長因子(腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor, NGF) 、表皮細(xì)胞生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary Neurotrophic Factor, CNTF) 、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors-1, IGF-1))和抗炎白介素(IL-13、IL-4、IL-10、TGF-β)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[35, 36]。動(dòng)物研究表明，脊髓損傷的小鼠糞便中產(chǎn)丁酸鹽菌Butyricimonas的水平顯著降低，丁酸鹽含量與假手術(shù)組相比，下降了58.6%[37]。產(chǎn)丁酸鹽菌Butyricimonas豐度與β-羥基丁酸鹽水平呈正相關(guān)[38]。臨床數(shù)據(jù)顯示，脊髓損傷患者體內(nèi)產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌Roseburia、Pseudobutyrivibrio、Dialister、Megamonas、Clostrdium和Faecalibacterium的豐富度明顯低于健康人群[39- 41]。此外有研究表明，將健康小鼠的糞便菌群移植到脊髓損傷小鼠體內(nèi)，可觀察到受體小鼠的SCFAs明顯上調(diào)(與對照組相比，F(xiàn)MT將糞便丁酸水平上調(diào)了46.7%)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌群可以通過抑制 IL-1β/NF-κB 信號(hào)通路，減輕脊髓損傷小鼠的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[37]。脊髓損傷對小鼠血清和脊髓中β-羥基丁酸鹽水平無顯著影響。給予外源性β-羥基丁酸鹽治療后，脊髓損傷小鼠對β-羥基丁酸鹽的利用率高于假手術(shù)組，部分創(chuàng)傷被逆轉(zhuǎn)[42]。因此，丁酸鹽、β羥基丁酸鹽可能是用于治療脊髓損傷的有前景的療法。

3 丁酸鹽、β-羥基丁酸鹽在脊髓損傷中發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制

3.1 對NF-κB/ NLRP3炎性小體信號(hào)通路的影響

NF-κB是介導(dǎo)脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的核心[43]。抑制NF-κB和NLRP3炎性體的活化可以減輕脊髓損傷引起的炎癥反應(yīng)程度[44]。NF-κB激活主要通過IκB激酶抑制劑(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK)介導(dǎo)的NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB, IκB)的磷酸化而發(fā)生[45]。在脊髓損傷中，大量NF-κB調(diào)控的靶基因表達(dá)上調(diào)，包括α腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細(xì)胞介素例如IL-1β、IL-6和IL-8；趨化因子例如單核細(xì)胞趨化蛋白-1；黏附分子例如細(xì)胞間黏附分子-1和血管內(nèi)皮黏附分子-1；誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、環(huán)加氧酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)以及蛋白酶，例如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等[46]。IKK/NF-κB信號(hào)通路通過誘導(dǎo)炎癥性細(xì)胞因子的釋放，參與了脊髓損傷后活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎作用的調(diào)控[47]。Lanza等[48]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉治療在脊髓損傷后24 h，抑制NF-κB的核活化及IκB-α降解，降低TNF-α、IL-1β、iNOS 和COX-2的表達(dá)。脊髓損傷后，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以激活NLRP3炎性小體，從而促進(jìn)胱天蛋白酶1前體(pro-caspase-1)切割為具有活性的胱天蛋白酶1(caspase-1)，并引起IL-1β、NO和TNF-α等促炎因子增多，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[49]。有研究表明，產(chǎn)丁酸鹽菌屬的豐度與促炎基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[50]。O’Connor等[51]的研究指出，脊髓損傷大鼠體內(nèi)與丁酸產(chǎn)生有關(guān)的微生物隨著IL-1β的增加而減少，特別是Faecalibacteriumprausnitzii。越來越多的證據(jù)證實(shí)，NLRP3的激活會(huì)導(dǎo)致IL-1β的釋放。IL-1β是一種直接使傷害感受器敏感，并引起疼痛的炎性細(xì)胞因子，NLRP3被認(rèn)為是炎性疼痛有巨大潛力的治療靶點(diǎn)[52, 53]。Bayazid等[54]探討了丁酸鈉在TNF-α刺激的SH-SY5Y細(xì)胞中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)丁酸鈉能減少NO的產(chǎn)生，降低iNOS和COX-2的表達(dá)，并抑制NLRP3炎性小體的活化。用β-羥基丁酸鹽處理脂多糖(1 μg / mL)刺激4 h的人單核細(xì)胞的培養(yǎng)物，上清液中IL-1β和IL-18的含量隨β-羥基丁酸鹽濃度增加而依賴性減少[55]。Qian等[42]研究表明，在脊髓損傷小鼠中進(jìn)行β羥基丁酸鹽處理，可降低NLRP3蛋白表達(dá)，抑制胱天蛋白酶1的激活，減少IL-1β和IL-18的表達(dá)，減輕脊髓損傷后炎癥反應(yīng)。

3.2 抗氧化應(yīng)激

脊髓損傷觸發(fā)活性氧的產(chǎn)生，包括過氧化氫(H2O2)、超氧化物(O2-)和羥基(OH-)自由基等，ROS增加引發(fā)的氧化應(yīng)激是重要的二次損傷因素[56]。氧化應(yīng)激是一種重要的病理生理機(jī)制，可緊密地調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[57]。越來越多的證據(jù)表明，NF-κB是能夠被氧化應(yīng)激激活的重要炎癥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[58]。H2O2和過氧亞硝酸鹽被證實(shí)，可以正向或負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB的活性[59]。此外，核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是具有強(qiáng)抗氧化作用和抗炎作用的轉(zhuǎn)錄因子[60, 61]。因此，可以通過減少活性氧的生成來達(dá)到抗炎的目的。有報(bào)道指出，O2-、H2O2和脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平，在脊髓損傷動(dòng)物模型損傷區(qū)域比假手術(shù)組更高, 抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)表達(dá)降低[42, 62]。最新研究顯示，丁酸鈉通過Nrf2通路降低癲癇小鼠ROS水平，并提高抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-Px)活性，表明丁酸鈉能顯著改善神經(jīng)功能[63]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，每日30 ～100 mg/kg劑量的丁酸鈉治療脊髓損傷小鼠會(huì)顯著增加Nrf2表達(dá)，上調(diào)MnSOD的表達(dá)[48]。同時(shí)，β-羥基丁酸鹽降低脊髓損傷小鼠O2-、H2O2和MDA的水平，并增強(qiáng)脊髓中SOD2和抗氧化分子過氧化氫酶(catalase, CAT)的轉(zhuǎn)錄，減輕氧化應(yīng)激[42]。孔剛剛[64]研究發(fā)現(xiàn)，β-羥基丁酸鹽通過抑制HDAC1和HDAC2，進(jìn)而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白FOXO3a、 NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)和NADPH氧化酶4(NADPH Oxidase 4，NOX4)表達(dá)，且證實(shí)β-羥基丁酸鹽抑制NLRP3炎癥小體的激活，參與調(diào)節(jié)脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞由促炎的M1型向具有神經(jīng)保護(hù)作用的M2型轉(zhuǎn)化。

3.3 其他

在大鼠脊髓損傷時(shí)立即給予持續(xù)7 d的丁酸鈉600 mg/(kg. d)腹腔注射進(jìn)行干預(yù)，損傷1周時(shí)，丁酸鈉組脊髓組織的凋亡細(xì)胞和炎癥細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組[65]。在脊髓損傷的Sprague-Dawley大鼠模型中，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(Akt)和下游FOXO3a蛋白水平受到明顯抑制[66]。Zhou等[67]在大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉的鼻內(nèi)給藥顯著增加PI3K和Akt的表達(dá)，并減弱神經(jīng)元凋亡。此外，用FOXO3a的腺病毒載體感染脂多糖誘導(dǎo)的脊髓細(xì)胞，會(huì)顯著增加細(xì)胞中FOXO3a 蛋白水平，F(xiàn)OXO3a的過表達(dá)能降低TNF-α[66]。而β-羥基丁酸鹽處理會(huì)顯著增強(qiáng)脊髓損傷小鼠FOXO3a的表達(dá)[64]。因此，激活PI3K/ Akt /FOXO3a信號(hào)通路可能是丁酸鹽和β羥基丁酸鹽的抗炎機(jī)制之一。

4 丁酸鹽、β-羥基丁酸鹽的臨床應(yīng)用

目前，丁酸鹽、β-羥基丁酸鹽的臨床干預(yù)已進(jìn)展到外源性直接干預(yù)，相比內(nèi)源性代謝途徑更方便實(shí)施。外源性丁酸鹽及β-羥基丁酸鹽干預(yù)的安全性和耐受性已在臨床試驗(yàn)中得到支持[68, 69]。兩者的抗炎特性已經(jīng)引起臨床工作者的關(guān)注。炎癥性腸病患者口服丁酸鈉膠囊后發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充丁酸鈉會(huì)增加具有潛在抗炎作用的細(xì)菌的生長[70]。志賀菌病期間用丁酸鹽輔助治療通過降低IL-1β和IL-8減輕炎癥[71]。但是，兩個(gè)獨(dú)立的隨機(jī)雙盲安慰劑對照研究表明，當(dāng)使用外源性酮補(bǔ)充劑升高血液β-羥基丁酸鹽時(shí)，NLRP3的活化增強(qiáng)，外源性增加β-羥基丁酸鹽可能增強(qiáng)炎癥[72]。此外，Hamer等[73]研究表明，丁酸鹽灌腸劑對結(jié)腸炎癥和氧化應(yīng)激的影響很小。綜上所述，丁酸鹽和β-羥基丁酸鹽的抗炎作用在臨床應(yīng)用中具有爭議性，還需要更多實(shí)驗(yàn)支持。

5 問題與展望

綜上所述，現(xiàn)有的基礎(chǔ)研究證實(shí)，丁酸鹽及β-羥基丁酸鹽在脊髓損傷后發(fā)揮抗炎作用，其機(jī)制可能涉及抑制NF-κB/ NLRP3炎性小體信號(hào)通路活性，以及抗氧化應(yīng)激等多方面(見Fig.2)。目前，丁酸鹽及β-羥基丁酸鹽在脊髓損傷中的研究僅局限于體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，且相關(guān)研究較少，兩者在其他疾病中的抗炎機(jī)制是否同樣在脊髓損傷中也發(fā)揮作用仍需要更多研究來證明。此外，丁酸鹽及β-羥基丁酸鹽在臨床中對炎癥反應(yīng)的治療效果尚存在爭議，在脊髓損傷中還未有相關(guān)數(shù)據(jù)，未來需進(jìn)行更多探索。Cavaleri等[74]提出，β-羥基丁酸鹽和丁酸鹽在調(diào)節(jié)代謝、炎癥、認(rèn)知和一般健康方面具有潛在協(xié)同作用。從本文綜述機(jī)制來看，β-羥基丁酸鹽和丁酸鹽可能存在協(xié)同性，預(yù)計(jì)兩者結(jié)合用藥可能更有效地達(dá)到治療目標(biāo)，這可能是未來研究的方向。

Fig.2 Anti-inflammatory mechanism of butyrate and β-hydroxybutyrate in a spinal cord injury Butyrate inhibits NF-κB activity and increases MnSOD and Nrf2 levels. β-hydroxybutyrate inhibits the NLRP3 inflammasome signaling pathway, enhances the expression of antioxidant molecules SOD2 and CAT, reduces reactive oxygen species generation and increases FOXO3 levels