HAp增強PLA纖維基人工韌帶的骨細胞活性研究

陸 腱，李 宏，劉桂連，吳琪琳，華英匯，費 翔*，朱美芳

(1.東華大學 材料科學與工程學院 纖維材料改性國家重點實驗室，上海 201600；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院運動醫(yī)學科，上海 200040)

人工韌帶是韌帶重建手術中重要的醫(yī)療器械，其市售產品主要由聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)纖維編織制成。PET不可生物降解的特性使得PET人工韌帶在植入后會因材料蠕變、與天然組織應力傳遞方式不匹配等原因失效[1-3]，需二次手術取出。因此，開發(fā)可生物降解纖維組成的人工韌帶成為韌帶修復器械研究的熱點。

通過熔融紡絲法制備的聚乳酸(PLA)纖維拉伸強度接近PET纖維，同時可生物降解，有望取代PET纖維成為人工韌帶的基體。從1996年開始，研究者們開始采用PLA纖維制備人工韌帶，并用于動物韌帶功能的重建[2, 4-8]。上述工作多通過編織結構調節(jié)人工韌帶力學性能和拓撲結構，在纖維材料的功能化方面有待深入研究。作者擬在PLA纖維的熔紡制備過程中，借助熔融加工技術雜化引入廣泛用于促進骨組織修復的活性物質羥基磷灰石(HAp)[9-12]，以增強PLA纖維基人工韌帶與骨細胞的相容性。首先借助熔融共混將納米級的HAp分散于PLA，制成與PLA切片尺寸相近的毫米級雜化樹脂；然后將雜化樹脂與PLA切片復配進行熔融紡絲，制成含有HAp的PLA雜化纖維；最后通過編織技術將雜化纖維集成為人工韌帶材料；從形貌、結構、力學性能、細胞相容性方面研究了HAp的引入對PLA-HAp雜化纖維、人工韌帶的影響。

1 實驗

1.1 主要原料與試劑

PLA：牌號FY601，安徽豐原集團有限公司產；HAp：針狀，南京埃普瑞納米材料有限公司產；去離子水、無水乙醇：上海泰坦科技股份有限公司產；PBS緩沖液、胰酶細胞消化液、Calcein-AM試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司產；CCK8細胞計數試劑盒：日本Dojindo研究所產；αMEM完全培養(yǎng)基、小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3)：上海中喬新舟生物科技有限公司產。

1.2 主要設備及儀器

CTE 20-48雙螺桿共混擠出機：南京科倍隆機械有限公司制；納米雜化纖維熔紡成形試驗專用設備：上海金緯化纖機械制造有限公司制；YG086縷紗測長儀：常州市中纖檢測儀器設備有限公司制；DZF-2018B捻繩機：東莞德至豐科技有限公司制；DT-01表面等離子處理儀：蘇州市奧普斯等離子體科技有限公司制；Ni-U光學顯微鏡：日本尼康公司制；Hitachi SU8010掃描電子顯微鏡：日本日立公司制；Prodigy-ICP等離子體光譜儀：美國利曼公司制；204F1差示掃描量熱儀：德國耐馳公司制；D/max-2550VB+/PC型X射線衍射儀：日本理學公司制；YG029全自動單紗強力機：常州市中纖檢測儀器設備有限公司制；INSTRON 5969電子萬能材料試驗機：美國英斯特朗公司制；熒光顯微鏡：德國Leica公司制。

1.3 PLA-HAp纖維及其人工韌帶的制備

1.3.1 PLA-HAp雜化樹脂的制備

將HAp置于真空烘箱中，于100 ℃下干燥12 h；對于PLA切片，先將切片置于真空轉鼓烘箱中在80 ℃下真空干燥4 h以除去水分，再于100 ℃真空干燥4 h對PLA進行預結晶。按一定質量比機械混合干燥后的HAp與PLA切片，借助雙螺桿共混擠出機進行熔融共混、擠出、造粒，制備HAp質量分數為10%的PLA-HAp雜化樹脂。其中，熔融共混工藝如下：雙螺桿共混擠出機一區(qū)30 ℃、二區(qū)180 ℃、三區(qū)190 ℃、四區(qū)至機頭210 ℃，螺桿轉速為300 r/min。

1.3.2 PLA-HAp雜化纖維的制備

首先按一定質量比機械混合PLA-HAp雜化樹脂與PLA切片，并采用1.3.1中干燥PLA切片的方法進行干燥；然后進行熔融紡絲，采用36孔常規(guī)圓形噴絲板制備PLA-HAp初生纖維；再通過自主設計的拉伸設備將初生纖維在60 ℃下進行2倍拉伸，然后在100 ℃下熱定型，得到線密度約60 dtex的PLA-HAp雜化纖維。其中，PLA-HAp雜化樹脂質量分數為0、5%、10%、15%(即HAp質量分數分別0、0.5%、1.0%、1.5%)的PLA-HAp纖維試樣分別標記為PLA-HAp0、PLA-HAp0.5、PLA-HAp1.0、PLA-HAp1.5。

1.3.3 PLA-HAp纖維基人工韌帶的制備

PLA-HAp纖維基人工韌帶的制備參考蠶絲基人工韌帶的編織方法[13-15]。采用縷紗測長儀量取12束長為1 m的PLA-HAp纖維并將其捋成一股，采用捻繩機以100 圈/min的轉速，先對纖維束順時針加捻69 s，再在伸直狀態(tài)下對折纖維束并逆時針加捻33 s，然后如上對折并順時針加捻10～11 s，最后對其末端進行打結，編織得到PLA-HAp纖維基人工韌帶材料。

將該材料置于100 ℃真空烘箱中處理1 h以消除編織過程中產生的內應力；再將材料浸泡于體積分數75%的乙醇水溶液中以除去纖維中的紡絲油劑；然后將材料在室溫下真空干燥，采用表面等離子處理儀在200 W下處理10 min，以提高材料表面親水性。

1.4 分析與測試

微觀形貌：采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察雜化樹脂、纖維截面的微觀形貌，其中雜化樹脂的放大倍數為10 000，纖維截面的放大倍數為20 000。

元素組成：借助強酸溶解纖維，采用等離子體光譜儀(ICP-OES)測試PLA-HAp雜化纖維中無機元素鈣(Ca)、磷(P)的含量。

結晶結構：采用差示掃描量熱儀對PLA-HAp雜化纖維進行測試。從40 ℃開始，以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃。對于獲得的差示掃描量熱(DSC)升溫曲線，先分別對160～180 ℃的結晶熔融峰和110 ℃附近的冷結晶峰積分，計算試樣的結晶熔融焓(?Hf)與冷結晶焓(?Hc)，按照式(1)計算試樣的結晶度(Xc)。

Xc=(?Hf-?Hc)/93.0 ×100%

(1)

取向結構：將多束纖維制成單絲平行排列、長度為10 cm以上的試樣，固定于X射線衍射儀靶臺進行測試，對獲得的X射線衍射(XRD)曲線進行積分分析，計算半高寬之和(HFWHM)，然后通過式(2)計算試樣的結晶擇優(yōu)取向度。

f=(360-HFWHM)/360 ×100%

(2)

式中：f為取向因子，f為100%時說明材料各向異性，f為0時說明材料各向同性。

力學性能：采用全自動單紗強力機對PLA-HAp纖維進行測試，夾持距離為500 mm，拉伸速度為500 mm/min；采用電子萬能材料試驗機對PLA-HAp纖維基人工韌帶進行測試，夾持距離為30 mm，拉伸速度為15 mm/min。

骨細胞活性：將MC3T3細胞種植于裝有滅菌人工韌帶材料的24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基用量為0.5 mL/孔，細胞種植密度為5×104個/孔；然后分別在培養(yǎng)1，3，5 d后將人工韌帶材料取出置于空白24孔板，借助CCK8試劑盒對材料上存活細胞數量進行測試，試樣中活細胞數量采用酶標儀測得的活細胞指示物強度(OD值)來表征，所有試樣均平行重復測試不少于3次。

骨細胞形態(tài)：采用鈣黃綠素(Calcein-AM)試劑盒對人工韌帶材料上的骨細胞進行活細胞染色，細胞形態(tài)通過熒光顯微鏡觀測骨細胞在人工韌帶材料的存活情況。

細胞實驗數據的統(tǒng)計學分析：使用Origin 8.5軟件中的單因素方差分析進行試驗數據的顯著性差異分析，選擇0.05作為顯著性水平值。顯著性差異水平(p)標記如下：p小于0.05為*，p小于0.01為**，p小于0.001為***。

2 結果與討論

2.1 PLA-HAp雜化樹脂及纖維的微觀形貌

從圖1a中可發(fā)現，PLA-HAp雜化樹脂有明顯區(qū)別于周邊基體的白色顆粒，這些顆粒與HAp納米粒子尺寸相近，可推斷為分散于PLA中的HAp納米粒子，且HAp在樹脂中分布較均勻，將該雜化樹脂用于熔融紡絲可實現HAp均勻分散于纖維中，但與PLA基體邊界較清晰，即兩者相容性不是很好，可能會影響纖維的加工和性能。從圖1b和圖1c可看出：相對于PLA-HAp0的截面，PLA-HAp1.0的截面中可以觀測到納米級的粒子聚集體，這證實了納米HAp在PLA纖維中的有效負載；同時，PLA-HAp纖維中的納米聚集體結構與周圍的PLA存在明顯的邊界，可能會成為纖維受力時的應力集中點，導致纖維更易破壞。

圖1 PLA-HAp樹脂及纖維的微觀形貌

2.2 PLA-HAp雜化材料的熔融紡絲工藝

將PLA-HAp雜化樹脂與PLA切片按一定比例混合，再進行熔融紡絲，以制備雜化纖維及梯度調控纖維中HAp含量。從表1可知，在熔融紡絲過程中，PLA-HAp1.5的紡絲成形溫度高于HAp含量更低的其他試樣，這是因為隨著PLA-HAp體系中與PLA相容性差的HAp含量增大，體系流變性能會變差，需提升溫度改善熔體流動速率以滿足成纖加工需求。

表1 PLA-HAp纖維的熔融紡絲工藝參數

2.3 HAp含量對PLA-HAp纖維結構與性能的影響

相對于PLA，HAp含有Ca、P兩種元素，采用ICP-OES測試纖維中的Ca、P元素含量以表征HAp負載量。從表2可知：隨著HAp添加量增加，雜化纖維中Ca、P元素含量梯度上升，與預期一致；纖維斷裂強度都大于3 cN/dtex，滿足編織加工的需求；隨著HAp的加入，纖維的斷裂強度由3.87 cN/dtex降低至3.16 cN/dtex，斷裂伸長率也由28.2%降低至25.9%，這歸因于HAp與PLA的相容性較差，在受力時易使纖維內部形成缺陷導致斷裂。

表2 PLA-HAp纖維的結構與性能

對于聚合物纖維材料，聚集態(tài)結構對其力學性能有著重要的影響。從各纖維試樣的DSC曲線(圖2a)可以看出，在110 ℃附近均無結晶峰，在160～180 ℃均有結晶熔融峰，說明纖維經拉伸后均已結晶完善。從表2也可知，纖維的Xc隨著加入HAp含量的增加而增大，這是因為PLA是半結晶聚合物，HAp的納米尺度結構可以誘導PLA異相成核，加速結晶，Xc由47.1%提升至49.1%及以上。對于纖維的取向結構，從圖2b和表2可知，隨著PLA-HAp纖維中HAp含量升高，纖維的f先增大后減小，這是因為HAp呈針狀，其作為PLA的成核劑利于PLA沿取向方向結晶，因此纖維引入HAp后，晶區(qū)f由93.1%提升至96.1%；但HAp含量過多時，會阻礙晶區(qū)的取向運動，因此PLA-HAp纖維的f會隨HAp含量的增加而降低，從96.1%降低至93.7%。

圖2 PLA-HAp纖維試樣的DSC曲線和XRD曲線

2.4 PLA-HAp纖維基人工韌帶的形貌與力學性能

通過SEM分析PLA-HAp纖維基人工韌帶的微觀形貌，如圖3所示，由于各纖維試樣的線密度相近、截面形狀相同，PLA-HAp纖維基人工韌帶在徑向尺寸上差異較小，直徑均為1 mm左右。

圖3 PLA-HAp纖維基人工韌帶的SEM照片

從表3可知：各PLA-HAp纖維試樣所制人工韌帶的拉伸強度都在87 MPa以上，約為人體前交叉韌帶(38.70 MPa[16])的2.2倍，可用于重建前交叉韌帶功能；負載有HAp的PLA-HAp纖維基人工韌帶在直徑上較細；含有HAp的PLA-HAp纖維基人工韌帶具有較低的最大載荷和斷裂伸長率；由于直徑上的差異，在拉伸強度方面，含HAp的PLA-HAp纖維基人工韌帶與純PLA纖維基人工韌帶差異較小。

表3 PLA-HAp纖維基人工韌帶的直徑和力學性能

2.5 PLA-HAp纖維基人工韌帶的骨細胞活性

采用MC3T3骨細胞來研究PLA-HAp纖維基人工韌帶對骨細胞性能的影響。從圖4可知，種植在人工韌帶上的MC3T3細胞，其細胞活性隨共培養(yǎng)時間的延長而增大。其中，共培養(yǎng)1 d后各組韌帶上的活細胞數量無明顯差異；此后，含HAp的纖維基人工韌帶上的細胞活性開始明顯高于無HAp的PLA-HAp0人工韌帶，尤其是HAp負載量最高的PLA-HAp1.5人工韌帶，其在培養(yǎng)3，5 d后與PLA-HAp組都表現出顯著性差異(3 d后p小于0.001，5 d后p小于0.01)。上述CCK8測試結果表明了HAp的引入可有效改善PLA纖維基人工韌帶與MC3T3細胞的相容性。

圖4 PLA-HAp纖維基人工韌帶與骨細胞相容性的CCK8表征

基于上述分析，以無HAp的PLA-HAp0人工韌帶和HAp負載量最高的PLA-HAp1.5人工韌帶為研究對象，研究HAp的負載對人工韌帶骨細胞活性的影響。借助Calcein-AM對韌帶上存活的骨細胞進行染色，并通過熒光顯微鏡進行觀測。從圖5可以看出：在共培養(yǎng)1 d后，PLA-HAp0和PLA-HAp1.5兩組人工韌帶上都黏附著少量Calcein-AM標記的活細胞(圖5a和圖5d)；隨著共培養(yǎng)時間的延長，被標記活細胞的數量開始增多，且PLA-HAp1.5人工韌帶上細胞數量多于PLA-HAp0人工韌帶上細胞數量(圖5 b和圖5e, 圖5c和圖5f)，這與上述CCK8測試的結果相一致。

圖5 PLA-HAp纖維基人工韌帶上骨細胞的Calcein-AM染色圖示意

從圖6可以看出：人工韌帶上細胞外基質和黏附細胞隨共培養(yǎng)時間而增加；培養(yǎng)1 d后，細胞黏附于人工韌帶的組成纖維上，同時大部分纖維還可看出原有輪廓(圖6a和圖6d所示)；培養(yǎng)3 d后，隨著細胞在人工韌帶上的增殖、遷移，人工韌帶上部分纖維的輪廓隨黏附細胞及細胞外基質發(fā)生改變，其中PLA-HAp1.5人工韌帶上纖維開始被細胞和細胞外基質黏結(圖6b和圖6e所示)；培養(yǎng)5 d后，在PLA-HAp1.5人工韌帶中，開始有部分纖維上黏附的細胞發(fā)生匯聚，形成2～4倍纖維直徑的聚集體(圖6c和圖6f所示)。因此，上述SEM圖像表明了MC3T3細胞在PLA-HAp1.5人工韌帶上的生長速度快于PLA-HAp0人工韌帶，進一步驗證了人工韌帶中HAp的加入對MC3T3細胞增殖行為的促進作用；同時細胞外基質的發(fā)展和細胞的生長都是沿著纖維方向進行的，而人工韌帶中的纖維主要是沿韌帶軸向方向排布的，因此該纖維組成的人工韌帶拓撲結構可誘導細胞沿韌帶軸向取向生長，利于重構結構上沿韌帶軸向取向的韌帶組織。

圖6 PLA-HAp纖維基人工韌帶上骨細胞的SEM照片

綜上所述，HAp的負載有效提高了PLA纖維基人工韌帶的骨細胞活性，有利于骨細胞在材料表面的增殖，可加速人工韌帶與周圍骨組織的整合。

3 結論

a.通過熔融共混技術將納米HAp均勻分散于PLA樹脂中，再與尺寸相近的PLA切片復配混合，經熔融紡絲獲得斷裂強度高達3.16～3.27 cN/dtex的PLA-HAp雜化纖維。在聚集態(tài)結構方面，HAp的加入可提高PLA纖維的結晶度和取向度，但其與PLA相容性較差，使得纖維在受力條件下易因結構缺陷導致斷裂，以致整體的斷裂強度和斷裂伸長率稍低。

b.將PLA-HAp雜化纖維編織成人工韌帶，PLA-HAp纖維基人工韌帶的拉伸強度達87.1～94.2 MPa，滿足重建韌帶功能的需求。

c.在生物功能方面，HAp的加入可有效在人工韌帶表面引入Ca、P元素，從而顯著提升人工韌帶與骨細胞(MC3T3)的相容性，證實了通過負載HAp提高PLA纖維基人工韌帶骨細胞活性的有效性。