傳染性法氏囊病病毒超強毒株ZHA001株的分離及鑒定

于 雷，潘 雨，高 潔，遲 鑫，劉 碩

(北京中海生物科技有限公司，北京 100081)

傳染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一種危害青年雞的烈性、高度接觸性的病毒病[1]，1957年首次出現(xiàn)于美國[2]。我國自1979年發(fā)現(xiàn)該病以來[3]，全國各地陸續(xù)有該病發(fā)生和流行的報道。

IBDV屬于雙RNA病毒科，其基因組由A、B兩節(jié)段組成，編碼5種蛋白，分別為VP1、VP2、VP3、VP4和VP5[4]。其中VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和宿主保護性抗原，還與病毒毒力、抗原變異及細(xì)胞凋亡等有關(guān)[5]。目前已把VP2作為基因工程亞單位疫苗的主要目的基因進行研究。

依據(jù)致病性和抗原性的差異，血清Ⅰ型IBDV野毒株可分為經(jīng)典毒株、變異毒株和超強毒株(very virulent IBDV，vvIBDV)[6]。自1990年以來，我國和其它國家及地區(qū)不斷分離到vvIBDV，它能突破由經(jīng)典毒株致弱的活疫苗或滅活疫苗提供的保護作用，導(dǎo)致雛雞發(fā)病[7]。vvIBDV的高致死率給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[8]。

山東某肉雞場在B87活疫苗免疫后仍發(fā)生疑似傳染性法氏囊病的病例。從發(fā)病死亡的雞只上采集病料組織，進行病毒分離鑒定，分離到一株vvIBDV，對VP2基因進行了克隆和序列分析，從分子水平研究其毒力和基因變異情況，并對其致病性等進行了研究，解釋免疫雞群發(fā)病的原因，以期為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料 采自山東某817肉雞場疑似法氏囊病的病雞法氏囊組織。

1.2 SPF雞胚和SPF雞 購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品 IBDV陽性血清、IBDV瓊擴抗原等由北京中海生物科技有限公司提供。

1.4 主要試劑及試劑盒 病毒核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、DNA凝膠回收提取試劑盒、pEASY?-T1 Cloning Kit等均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.5 引物設(shè)計與合成 VP2基因擴增引物參照文獻(xiàn)[9]，上游引物為5′-CGAATTCATGACAAACCTGCAAGAT-3′，下游引物為5′-CCGCTCGAGTCACCTTAGGGCCCGGATTAT-3′。由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。

1.6 病料處理 采集出現(xiàn)典型癥狀和病理變化的病死雞法氏囊組織。將法氏囊組織剪碎，稱重后按照1∶5比例(m/V)加入滅菌生理鹽水(加入終濃度為2000 單位/mL的青、鏈霉素)，放入研磨器中研磨，得到勻漿液；凍融3次；加入等體積氯仿，低溫振蕩作用過夜；4 ℃、10000 g離心5 min，取上清液。-70 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 病毒分離 將上清液點眼接種4周齡SPF雞5只，0.1 mL/只。接種后每天觀察，死雞隨時剖檢，無菌采集法氏囊；接種后96 h剖檢存活雞，收集病變法氏囊。法氏囊組織按照1∶5比例(m/V)加入滅菌生理鹽水研磨，凍融3次后10000 g離心5 min，取上清液作為試驗用毒種，-70 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 瓊脂擴散試驗(AGP) 按常規(guī)方法進行：瓊脂板用梅花打孔器打孔，中間孔加入IBDV陽性血清，周圍孔分別加入分離株病毒液、標(biāo)準(zhǔn)IBDV瓊擴抗原及生理鹽水對照，37 ℃濕盒中孵育36 h，觀察結(jié)果。

1.9 病毒RNA的提取 試驗用毒種融化后用試劑盒提取病毒RNA。

1.10 VP2基因擴增及克隆與測序 以提取的病毒RNA為模板，通過下游引物進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，通過上、下游引物，經(jīng)PCR擴增VP2基因。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57.8 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因，與pEASY?-T1載體連接后轉(zhuǎn)化Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序。

1.11 VP2基因的序列分析 利用DNAStar軟件對分離株及GenBank上其他毒株(表1)的VP2基因進行核苷酸序列和氨基酸序列比對，采用MEGA軟件中Neighbor-Joining(NJ)方法進行遺傳演化分析，并繪制系統(tǒng)進化樹。

表1 IBDV參考毒株信息Tab 1 Information of reference IBDV strains

1.12 雞胚半數(shù)致死量(ELD50)的測定 試驗用毒種用滅菌生理鹽水進行10倍系列稀釋，取10-2～10-6共5個稀釋度，每稀釋度經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種雞胚5枚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育168 h，記錄各組雞胚死亡情況及胚體病變，根據(jù)Reed-Muench法計算ELD50。

1.13 外源病毒檢驗 用滅菌生理鹽水將試驗用毒種稀釋至103.5ELD50/0.1 ml，與等量雞傳染性法氏囊病陽性血清混合，37 ℃作用60 min。按照《中國獸藥典》2020年版三部附錄3505外源病毒檢驗法中“1 禽源制品及其細(xì)胞的檢驗”[10]中“1.2 雞胚檢查法”和“1.3 細(xì)胞檢查法”進行。

1.14 致病性試驗 用4周齡SPF雞15只，隨機分成2組，第1組10只，各點眼接種試驗用毒種104.0ELD50(0.1 mL)；第2組5只，不接種作為對照。兩組雞在相同條件下隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察96 h，觀察各組雞臨床表現(xiàn)，對病死雞進行剖檢，并記錄死亡數(shù)量及病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離與鑒定 IBDV病料接種SPF雞進行病毒分離，96 h內(nèi)死亡3只，剖檢可見法氏囊充血，腫脹，外觀似紫葡萄樣；2只存活雞96 h時精神沉郁，羽毛蓬松，剖檢法氏囊出現(xiàn)膠凍樣腫脹。無菌采集所有雞只法氏囊，經(jīng)處理后作為試驗用毒種。對其進行RT-PCR檢測和瓊脂擴散試驗，核酸電泳后出現(xiàn)一條約1400 bp的條帶，與預(yù)期大小相符(圖1)；瓊脂擴散試驗中，待檢毒種與陽性血清孔間出現(xiàn)了一條乳白色沉淀線，與標(biāo)準(zhǔn)IBDV瓊擴抗原陽性對照相同，而生理鹽水陰性對照無沉淀，結(jié)果表明IBDV陽性。將該IBDV分離株命名為ZHA001株。

圖1 RT-PCR擴增VP2基因Fig 1 Amplification of VP2gene with PT-PCR

2.2 序列測定結(jié)果及同源性分析 測序結(jié)果表明，ZHA001株VP2基因大小為1356 bp，編碼452個氨基酸。利用DNAStar軟件對該毒株及血清I型參考毒株的VP2基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列進行同源性分析。結(jié)果顯示，ZHA001株與其他IBDV毒株的核苷酸同源性超過90.1%，其中與超強毒株UK661和OKYM株的同源性為97.9%，與超強毒株HLJ19-6101株的同源性最高，為99.1%；與超強毒株氨基酸序列的同源性均大于99 %。

2.3 ZHA001株VP2高變區(qū)氨基酸分析 對ZHA001株VP2高變區(qū)的氨基酸進行分析，與參考毒株的特征性氨基酸位點進行比較，發(fā)現(xiàn)ZHA001株與超強毒特征性氨基酸位點相一致(表2)，七肽區(qū)(326～332)也與超強毒株完全相同，為“SWSASGS”。

表2 IBDV VP2基因高變區(qū)氨基酸比對結(jié)果Tab 2 The amino acid alignment of IBDV VP2 gene hypervariable region

2.4 遺傳進化分析 基于VP2基因的核苷酸序列遺傳進化樹顯示，血清I型的IBDV毒株可分為經(jīng)典毒株、超強毒株、弱毒株和變異毒株等不同分支；IBDV ZHA001株與超強毒株(UK661、OKYM、Gx、HK46、D6948、HLJ19-6101、HB20-4401、SH95等)在同一進化樹分支(圖2)。

圖2 ZHA001株VP2基因進化樹分析Fig 2 Phylogenetic analysis of ZHA001 based on VP2

2.5 雞胚半數(shù)致死量測定 將試驗用毒種系列稀釋后接種10日齡雞胚，根據(jù)接種后雞胚的死亡情況，計算出ZHA001株的ELD50為10-4.38/0.2 mL。死胚表現(xiàn)為絨毛尿囊膜增厚，胚體水腫、腦部充血，剖檢可見肝臟斑駁狀病變。

2.6 外源病毒檢驗 試驗用毒種與特異性陽性血清中和后接種SPF雞胚和雞胚成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)后進行判定。結(jié)果，雞胚檢查法中兩種途徑接種的雞胚胎兒均發(fā)育正常，絨毛尿囊膜無病變，取接種雞胚的雞胚液進行紅細(xì)胞凝集試驗，結(jié)果均為陰性；細(xì)胞檢查法中，接種的細(xì)胞無細(xì)胞病變，對細(xì)胞進行紅細(xì)胞吸附試驗，未出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。上述結(jié)果表明該試驗毒種無外源病毒污染，毒種純凈。

2.7 毒力試驗 IBDV ZHA001株接種SPF雞后36 h，部分雞只精神沉郁，拉白色或綠色稀便。48 h，所有接種雞精神沉郁，羽毛蓬松。48～96 h內(nèi)死亡9只，剖檢見法氏囊呈紫葡萄樣(圖3A)。1只雞瀕死，剖檢法氏囊出現(xiàn)充血、腫脹。非接種對照組5只雞均健活，剖檢法氏囊無異常(圖3B)。結(jié)果表明ZHA001株為超強毒株。

圖3 ZHA001株致病性試驗Fig 3 Challenge test of IBDV ZHA001

3 討論與小結(jié)

傳染性法氏囊病病毒主要侵害雞，尤其是超強毒株，自20世紀(jì)90年代以來對我國養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。然而，隨著飼養(yǎng)環(huán)境的改善和疫苗的廣泛應(yīng)用，超強毒株得到了很好的控制，僅呈現(xiàn)點發(fā)[11]。2017年以來不同于早期變異株的新型法氏囊變異株在國內(nèi)開始流行[12-13]，且流行范圍仍在擴大[6]。本次超強毒株的分離，也表明了目前新型變異毒株流行的同時超強毒株并未消失。

目前對IBDV 分子流行病學(xué)研究集中在該病毒VP2 基因的高變區(qū)，VP2 基因與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原的變異以及毒力有關(guān)[14]，VP2高變區(qū)氨基酸變化較大，因此對該區(qū)域的分子特征進行研究不僅可以發(fā)現(xiàn)IBDV的抗原性變化，還可提供IBDV毒株遺傳進化信息。本研究克隆了IBDV ZHA001株VP2基因，并對其與NCBI上其他IBDV毒株進行比較分析。結(jié)果表明，分離毒株與其他IBDV 超強毒株的核苷酸相似性均超過97.6%，氨基酸相似性均超過99.3%，并且具有222A、242I、279D、256I、284A、294I和299S等超強毒株特征性氨基酸[15-17]，從分子水平說明ZHA001株為IBDV 超強毒株；從進化樹也可以看出，ZHA001株與8個超強毒的參考毒株位于同一個大的分支。致病性試驗中，SPF雞感染率10/10，死亡率9/10，符合超強毒株特性[18]，與VP2基因序列分析和進化樹分析一致。

分離ZHA001株的養(yǎng)雞場在發(fā)生IBD前免疫過B87活疫苗，如果不是免疫失誤，那么可能是超強毒突破疫苗保護所致，因為IBDV超強毒株能夠突破高水平抗體的保護，導(dǎo)致雞群高死亡率[1]。當(dāng)然也不排除與抗原變異有關(guān)，ZHA001株VP2第212位氨基酸(D→N)、384位氨基酸(V→I)發(fā)生改變，尤其第212位氨基酸位于VP2的第一親水區(qū)(212 ～224AA)，該區(qū)域氨基酸的改變可能引起VP2抗原性改變，造成抗原變異。這種改變是否會造成抗原的劇烈改變還需進一步研究。

本次從免疫傳染性法氏囊病活疫苗的發(fā)病肉雞群分離到一株IBDV，命名為ZHA001株，經(jīng)鑒定為超強毒株。本研究可為傳染性法氏囊病的防控提供參考。