皮膚類器官的構(gòu)建、功能及其應(yīng)用研究進(jìn)展*

王 敏 張臨風(fēng) 徐鶴然 張曉娜 化璟琳 張?zhí)鹛?趙風(fēng)年 朱姿英

（1）北京工商大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，北京 100048；2）北京工商大學(xué)-唐頤新型材料安全與評價創(chuàng)新研究中心，北京 102401；3）中國人民解放軍總醫(yī)院創(chuàng)新醫(yī)學(xué)部，北京 100853）

類器官（organoid）是通過多能干細(xì)胞（pluripotent stem cell）或胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC），分化為多個具有特異性器官的細(xì)胞類型，與對應(yīng)的器官擁有類似的空間組織，并能夠再現(xiàn)對應(yīng)器官的部分功能，與體內(nèi)器官顯示出最大的相似性，從而提供一個高度生理相關(guān)的系統(tǒng)，也作為一種更有效的體外研究模型用于癌癥、心腦血管疾病等熱門領(lǐng)域的研究［1］。2009年，Sato等［2］利用體外培養(yǎng)的單個Lgr5干細(xì)胞，成功獲得包含小腸潘氏細(xì)胞（paneth cells）、杯狀細(xì)胞（goblet cells）、腸上皮細(xì)胞（enterocytes）的腸道類器官，建立了類器官培養(yǎng)系統(tǒng)。Huang等［3］基于此方法建立小腸類器官模型，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）通過影響Hes1、Math1和Sox9的表達(dá)，從而干擾小腸干細(xì)胞（intestinal stem cells）的分化，表明小腸類器官是研究腸上皮-病原體互作的最適試驗?zāi)Ｐ?。隨著類器官技術(shù)的不斷發(fā)展，科研人員從不同組織中分離出了不同類型細(xì)胞，培養(yǎng)出了胃、肝臟、肺、乳腺、前列腺等類器官［4-8］。這些類器官均具有其特異性、基因表達(dá)特征、特殊的空間結(jié)構(gòu)和原始組織功能以用于體外模擬疾病發(fā)生和新藥測試［9］。

近20年來，體外模型一直是皮膚醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究工具。最初的體外皮膚表皮模型系統(tǒng)僅由分化的表皮組成；結(jié)構(gòu)稍微復(fù)雜的全層皮膚模型，由角質(zhì)形成細(xì)胞接種于起支架作用的含有成纖維細(xì)胞的膠原或纖維蛋白基質(zhì)上構(gòu)建；還可以利用成纖維細(xì)胞在體外能自身分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的特點，生成完全由人體組件組成的3D皮膚模型。與傳統(tǒng)皮膚全層模型相比，基于干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的皮膚類器官，與體內(nèi)發(fā)育過程相似，能夠基于細(xì)胞類別自我組織和定向分化，并且可以產(chǎn)生皮膚模型無法比擬的皮膚附屬物，如毛囊、皮脂腺等。近年發(fā)展起來的微流控技術(shù)和3D生物打印技術(shù)的應(yīng)用，也可為皮膚疾病研究提供更加有前景的工具。本文對皮膚類器官及其附屬物的構(gòu)建過程，以及皮膚類器官應(yīng)用在皮膚疾病研究治療中的相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行了介紹和論述（圖1）。

Table 1 Advantages and limitations of various skin cell models表1不同皮膚細(xì)胞模型優(yōu)勢及局限性

1 皮膚類器官

現(xiàn)有的體外皮膚研究模型多以體外培養(yǎng)的2D皮膚細(xì)胞、3D皮膚細(xì)胞模型為主，層間相互作用與真實生理狀態(tài)還存在較大差距。利用如人臍血干細(xì)胞、多能干細(xì)胞經(jīng)過分化而成的三維皮膚類器官進(jìn)行體外環(huán)境模擬培養(yǎng)，可以改善現(xiàn)有2D、3D模型培養(yǎng)，細(xì)胞類型單一、缺乏細(xì)胞與ECM間相互作用、無法在體外自組織分化的局限性，縮小了與體內(nèi)多細(xì)胞組織及其生理功能的差異性［10-12］。例如，對于給定劑量的過氧化氫或硝酸銀，皮膚類器官比單層培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞具有明顯的抵抗力，且具有更好的抗氧化應(yīng)激能力［13］，但同時，皮膚類器官也存在一定的局限，如生長周期和一致性尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)等（表1）［11，13-24］。近年來，隨著動物替代試驗在歐美等國的推行，體外構(gòu)建的皮膚類器官開始用于在體外最大程度模擬人體皮膚環(huán)境，對皮膚疾病的進(jìn)行更直觀有效的研究治療，以及廣泛應(yīng)用于體外研究皮膚疾病的病理生理學(xué)和系統(tǒng)修復(fù)損傷。

2 皮膚及其附屬物類器官的構(gòu)建

長久以來應(yīng)用于科學(xué)研究的動物實驗，存在如實驗周期長、個體差異性大、造模難度大、種間差異大等諸多局限［25-26］。同時，在動物試驗中出現(xiàn)嚴(yán)重毒性的藥物不會繼續(xù)進(jìn)行人體試驗，因此部分對人體安全有效的藥物，可能在篩選過程中被遺漏［27-28］。體外培養(yǎng)皮膚細(xì)胞模型或類器官具有多重優(yōu)點，逐漸被用于皮膚疾病研究及藥物測試。通過體外培養(yǎng)的各類皮膚細(xì)胞、組織和類器官，結(jié)合計算機模擬預(yù)測毒性等新的體外替代檢測方法，對藥物前期預(yù)實驗進(jìn)行完善和補充，并作為動物實驗之前的預(yù)篩選，更高通量大規(guī)模地進(jìn)行篩選，有較好的一致性。所以，構(gòu)建具備一定結(jié)構(gòu)和功能的類器官可以在特定條件下被用于實現(xiàn)大規(guī)模、高通量的實驗?zāi)Ｊ剑源藢鹘y(tǒng)的動物實驗進(jìn)行補充和完善［29-30］。

2.1 細(xì)胞來源

構(gòu)建皮膚類器官的細(xì)胞有多種來源，包括來源于人臍帶血的臍血單個核細(xì)胞、全能干細(xì)胞類的胚胎干細(xì)胞、分化功能強大的多能干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，以及來源成體干細(xì)胞的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等（圖2）。與普通細(xì)胞不同，在實驗室和臨床研究中使用胚胎干細(xì)胞時，還應(yīng)嚴(yán)格遵守關(guān)于《中華人民共和國生物安全法（草案）》的說明、《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》、《人胚胎干細(xì)胞研究倫理指導(dǎo)原則》等相關(guān)法規(guī)和科研倫理準(zhǔn)則［31-33］。

2.1.1 臍血干細(xì)胞（umbilical cord blood stem cell，UCBC）

因臍帶血相對容易收集，可提供較原始的免疫細(xì)胞，同時較易獲得造血干/祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cells），還可兼具非造血細(xì)胞存在的這些特性而適用于細(xì)胞治療。同時，臍帶血也是造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells）和內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell）等多項具有治療潛力的細(xì)胞來源［34］。臍血干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞和臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（cord blood mesenchymal stem cells），以及內(nèi)皮祖細(xì)胞等亞成分，其中間充質(zhì)干細(xì)胞在皮膚領(lǐng)域的研究較多。人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞具有多種參與抗炎作用的生長因子和細(xì)胞因子，并且對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）/干擾素-γ（IFN-γ）刺激的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞具有抗炎作用，其機制可能與激活的B細(xì)胞系分泌的免疫球蛋白抑制有關(guān)。Kim等［35］用人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞處理輕度特應(yīng)性皮炎患者的損傷處4周后，發(fā)現(xiàn)皮膚水分值增加同時經(jīng)皮失水率降低，皮膚屏障功能加強。Kim等［36-37］發(fā)現(xiàn)人臍帶血單個核細(xì)胞（cord blood mononuclear cells，CBMC）來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）具有較高的多能性、正常核型和分化為3個胚層的能力，其分化而成的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有與原代細(xì)胞系相似的特征。未來，臍血干細(xì)胞可以進(jìn)一步用于構(gòu)建皮膚類器官，并且在疾病治療中將具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.1.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）

iPSC作為多能干細(xì)胞的一種，具有無限自我更新和增殖的特性，并能分化為外胚層、中胚層、內(nèi)胚層等3個胚層的成熟細(xì)胞類型［38］。iPSC利用OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc6等重編程因子從體細(xì)胞中產(chǎn)生，克服了ESC的倫理和免疫學(xué)問題［39-40］。除臍血干細(xì)胞來源iPSC外，還可以來源于血細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。另一方面，iPSC又具有分化為各類細(xì)胞的能力，如角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、皮膚來源的前體細(xì)胞。同時，皮膚細(xì)胞因為容易獲得而在重新編程系統(tǒng)中使用最廣泛，如最常用的成纖維細(xì)胞，也可作為皮膚類器官的主要細(xì)胞來源之一。

Jamwal等［41］用pCXLE-HUL、pCXLE-HSK、pCXLE-hOCT3/4對取流產(chǎn)20周胎兒的成纖維細(xì)胞進(jìn)行核轉(zhuǎn)染，經(jīng)iPSC培養(yǎng)液中培養(yǎng)后，獲得非整合型iPSC系。但這種方法下成纖維細(xì)胞的重新編程成功率較低，約為0.01%~0.5%，整個過程大約需要3~5周［42］。相比之下，角質(zhì)形成細(xì)胞由于其較高的基礎(chǔ)表達(dá)水平而具有較高的重新編程效率，在2~3周內(nèi)即可達(dá)到適宜傳代大小，較之成纖維細(xì)胞提高了100倍（約為1%~2%）［43］。Yang等［44］在培養(yǎng)皿中富集角質(zhì)形成細(xì)胞，用編碼了轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒轉(zhuǎn)染后，獲得單個表皮細(xì)胞，并生成了iPSC。通過成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞重新編程而得到iPSC，為皮膚細(xì)胞獲取提供了新思路。

Sah等［45］向單個iPSC中添加分化因子、維甲酸（RA）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP-4），4周內(nèi)高效生成了大量均勻分化的角質(zhì)形成細(xì)胞，且分化過程細(xì)胞死亡較少。Kim等［37］以CMC-hiPSC-011細(xì)胞株為研究對象，在分化培養(yǎng)基中形成成纖維細(xì)胞。Sugiyama-Nakagiri等［46］將成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的人iPSC細(xì)胞系與表皮角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)毛囊角質(zhì)化。通過誘導(dǎo)iPSC分化，促進(jìn)人皮膚及其附屬物的再生，這也為皮膚和附屬物相關(guān)疾病的研究及新藥開發(fā)提供有效的工具。

2.1.3 角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte）

人的表皮是一個分隔開的相對獨立的多層結(jié)構(gòu)，能夠起到防止外來病原體和減少水分流失的作用，并通過角質(zhì)形成細(xì)胞的死亡和分化來維持皮膚器官的動態(tài)平衡，從而使人類免受外部環(huán)境因素的影響［47］。最近的研究表明，將iPSCs產(chǎn)生分化的角質(zhì)形成細(xì)胞，接種到加入膠原基質(zhì)并完成凝膠化的每層成纖維細(xì)胞上，獲得的皮膚類器官可以在體外模擬皮膚表皮層的結(jié)構(gòu)和功能［48］。

自從小鼠ESC中成功獲得角質(zhì)形成細(xì)胞以來，許多研究小組已經(jīng)分別從小鼠ESC、人ESC、小鼠iPSC和人iPSC中獲得了相應(yīng)角質(zhì)形成細(xì)胞［49-52］。Vatansever等［53］從小鼠ESC中分離出類胚體，在添加用于阻斷神經(jīng)通路的BMP-4的基底膜基質(zhì)上培養(yǎng)10 d后，結(jié)合透射電鏡觀察鑒定出分化而成的角質(zhì)形成細(xì)胞。Ibrahim等［54］使用全反式維甲酸、L-抗壞血酸、BMP-4和表皮生長因子將人iPSC分化為角質(zhì)形成細(xì)胞。除此之外，多能干細(xì)胞也可以用于分化出角質(zhì)形成細(xì)胞。Zhong等［55］通過抑制人多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β而啟動外胚層譜系分化，證明90%以上的細(xì)胞可以分化成為TP63期Ⅱ角質(zhì)形成細(xì)胞。Yan等［56］實驗表明小鼠iPSC來源的角質(zhì)形成細(xì)胞通過提高上皮化率和減少瘢痕形成來縮短愈合時間，由此獲得的角質(zhì)形成細(xì)胞可以應(yīng)用于治療受損皮膚。同時，利用角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建起人皮膚表皮類器官，未來為皮膚創(chuàng)面愈合提供了一種新的治療思路與方向。

2.1.4成纖維細(xì)胞（fibrocyte）

位于皮膚表皮層之下更厚的真皮層，主要“工作”細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，即一類紡錘形的間充質(zhì)細(xì)胞，由大量成纖維細(xì)胞生成的ECM組成，同時還具有不同的結(jié)構(gòu)，如血管、神經(jīng)、汗腺和淋巴管等，在皮膚結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用［57］。Kim等［37］將分化的成纖維細(xì)胞中和I型膠原再懸浮，將懸液加入Transwell?平板，在分化培養(yǎng)基中孵育5~7 d后接種角質(zhì)形成細(xì)胞，生成3D皮膚類器官。但是，由成纖維細(xì)胞重新編程的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，成功率較低，由此構(gòu)建皮膚類器官的研究目前還較少，且應(yīng)用大多集中在傷口愈合治療方面。成纖維細(xì)胞合成結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白（collagen）和彈性蛋白（elastin），并將其整合到大多數(shù)間充質(zhì)組織ECM中去，ECM通過填充傷口部位形成瘢痕，在傷口愈合中起著至關(guān)重要的作用［23］。同時，真皮成纖維細(xì)胞前體細(xì)胞分化為各種類型的細(xì)胞，在傷口愈合中執(zhí)行毛囊啟動和瘢痕形成的特定功能［58］。Yan等［56］將C57BL/6小鼠真皮層切片，通過胎牛血清和DMEM培養(yǎng)獲得成纖維細(xì)胞。未來可以通過成纖維細(xì)胞構(gòu)建皮膚真皮類器官，用于深入探討前體細(xì)胞分化機制以及ECM作用路徑，開發(fā)成纖維細(xì)胞導(dǎo)向的無瘢痕愈合療法。

2.2 皮膚類器官的構(gòu)建

皮膚的表皮層產(chǎn)生毛發(fā)和腺體，以角質(zhì)形成細(xì)胞為主要細(xì)胞類型，它有助于體溫調(diào)節(jié)和屏障形成；皮膚真皮層囊括了血管和神經(jīng)等其他結(jié)構(gòu)，以真皮成纖維細(xì)胞為主要駐留細(xì)胞，其產(chǎn)生ECM，并有助于毛囊的啟動和循環(huán)。因此，根據(jù)皮膚生理結(jié)構(gòu)特點，利用不同來源細(xì)胞，經(jīng)定向培養(yǎng)或誘導(dǎo)分化，構(gòu)建體外模擬皮膚組織系統(tǒng)的皮膚及其附屬物類器官模型，有助于了解發(fā)育和體內(nèi)平衡過程中不同細(xì)胞類型和分子信號通路的復(fù)雜相互作用。在皮膚的胚胎發(fā)育中，Wnt、BMP、FGF等信號通路起著至關(guān)重要的作用，其中Wnt信號已成為控制皮膚模式的主要途徑，并且控制分化的皮膚細(xì)胞功能［59］。例如，早年研究發(fā)現(xiàn)的成年小鼠皮膚創(chuàng)傷后依賴Wnt通路的毛囊再生［60］。然而，這些通路如何調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中表皮分層的遺傳網(wǎng)絡(luò)相互作用仍尚未明確［61］。

科研人員先后建立了人類、小鼠和犬類表皮類器官，但真皮目前仍側(cè)重于附屬物類器官的構(gòu)建。Wang等［62］將分選的ITGA6高基底細(xì)胞包埋在Matrigel?基質(zhì)膠中，覆蓋培養(yǎng)基以培養(yǎng)和擴(kuò)增細(xì)胞，最終獲得人類原代表皮類器官，可用于模擬由紅色毛癬菌引起的皮膚癬菌感染模型。Boonekamp等［63］取8~18周齡小鼠背部皮膚中分離出表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)得到用于長期擴(kuò)增和分化的小鼠表皮類器官，作為體外研究表皮穩(wěn)態(tài)的工具。Wiener等［64］取濾泡間表皮細(xì)胞接種于基底膜提取物中，在不同培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)犬表皮類器官，將其作為研究表皮結(jié)構(gòu)和功能障礙的體外模型。

皮膚類器官是體外保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征、細(xì)胞間關(guān)系以及細(xì)胞外基質(zhì)的原代培養(yǎng)物。皮膚表皮來自外胚層，真皮則有不同的胚胎起源，而無論真皮起源如何，所有類型的皮膚都需要上皮（表皮）和間充質(zhì)（真皮）細(xì)胞的相互作用才能最終發(fā)育并形成附屬器［65-67］。在目前已建立有人類和小鼠的皮膚類器官中，Kim等［36］發(fā)現(xiàn)CBMC-iPSC衍生的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有與原代細(xì)胞系相似的特征。他們通過懸滴法生成均勻可控的胚胎體，將其附著在IV型膠原涂層培養(yǎng)皿上成功分化出角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，并將成纖維細(xì)胞連續(xù)傳代至I型膠原包被板上，使其產(chǎn)生具有遷移和黏附功能的ECM，在高鈣培養(yǎng)基的氣液界面培養(yǎng)體系下誘導(dǎo)CBMC-IPSC來源的皮膚類器官分層，并將其移植入小鼠，建立人源化小鼠模型。這項研究表明，人iPSC衍生的皮膚類器官很可能是一種全新的，而且可以替代體內(nèi)和體外做皮膚研究的工具。不僅如此，Lee等［68］從小鼠多能干細(xì)胞中定向分化出表皮和真皮細(xì)胞，通過逐步調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化TGF-β和FGF信號通路，共同誘導(dǎo)球形細(xì)胞聚集體內(nèi)的顱骨上皮細(xì)胞（cranial epithelial cells）和神經(jīng)嵴細(xì)胞（cranial epithelial cells），經(jīng)過4~5個月孵育，獲得了帶有皮膚附屬物小鼠皮膚類器官，未來有望用于燒傷或受傷患者的附屬物皮膚的重建。

2.3 皮膚附屬物類器官

人類的皮膚系統(tǒng)由皮膚及其附屬物組成，除皮膚表皮層和真皮層外，它們還產(chǎn)生一些具有功能的附屬物，例如毛囊、皮脂腺、汗腺和指甲。目前已經(jīng)成功構(gòu)建的三維皮膚附屬物類器官如毛囊、皮脂腺和汗腺等，可以用于科學(xué)研究和臨床治療。

毛囊（hair follicles）結(jié)構(gòu)復(fù)雜，橫貫上皮和真皮兩層，上皮成分包括內(nèi)根鞘（inner-root sheath）、外根鞘（outer-root sheath）和毛干（hair shaft），真皮成分包括毛乳頭（dermal papilla）和結(jié)締組織鞘（connective tissue sheath）［69］。Weber等［70］利用體外液滴法，將新生兒包皮角質(zhì)形成細(xì)胞與頭皮真皮細(xì)胞結(jié)合，在真皮聚集處表皮細(xì)胞突起形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了首例體外分化的毛囊類器官，但真皮細(xì)胞尚未在培養(yǎng)中實現(xiàn)擴(kuò)增。同時，液滴法不適合大規(guī)模生成用于篩選分析研究和臨床應(yīng)用的類器官。Su等［71］優(yōu)化了這一研究成果，他們使用胎兒頭皮真皮祖細(xì)胞和成人包皮表皮干細(xì)胞的簡單懸浮液，可以在24 h內(nèi)形成大量毛囊類器官。毛乳頭位于毛囊底部毛球內(nèi)，是一種由上皮基質(zhì)細(xì)胞和上皮干細(xì)胞包裹的真皮凝集物［72］。Gupta等［73］由絲膠蛋白水凝膠包封的毛乳頭細(xì)胞球體、毛囊角化細(xì)胞和干細(xì)胞，構(gòu)建了體外三維多細(xì)胞類器官模型。由此可以深入探討毛囊形態(tài)發(fā)生的潛在機制以及毛發(fā)生長中更加復(fù)雜的分子信號傳遞。

皮脂腺（sebaceous gland）是皮膚表皮內(nèi)的一個全分泌附屬物，也是毛皮脂腺單位的重要組成部分，在皮膚內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著核心作用［74］。Feldman等［75］從小鼠中分離的單個Blimp1細(xì)胞具有在體外產(chǎn)生皮脂腺類器官的潛力。同時，新構(gòu)建的皮脂腺類器官在研究痤瘡致病機理中起重要作用，這有助于尋找痤瘡治療的新途徑，并且可用于藥物篩選以及研究皮脂腺穩(wěn)態(tài)、功能和病理研究。

汗腺（sweat glands）在體內(nèi)具有多重生理功能，如分泌汗液、排泄廢物、維持體溫等作用，與其他皮膚成分一樣起源于表皮祖細(xì)胞，其在全層損傷后的再生能力有限，尤其嚴(yán)重?zé)齻蠛瓜俳Y(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)與再生是臨床治療面臨的巨大挑戰(zhàn)。Diao等［76］利用酶消化法將成年小鼠爪墊真皮中汗腺上皮細(xì)胞嵌入基質(zhì)膠中而建立了小鼠汗腺類器官，并且移植在受傷部位后，可參與汗腺再生，能夠有效整合到組織中并使皮膚再生。這項研究成果為今后汗腺重建提供了一種新的策略，即可以在深度受傷的皮膚傷口中再生功能性汗腺樣結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)傷口愈合。

目前已有多種人、小鼠及犬類等來源的皮膚附屬物類器官在實驗室構(gòu)建完成，并進(jìn)行了相關(guān)病理機制和藥物測試應(yīng)用研究（表2）。

Table 2 Established skin organoids and its function and application表2已建立皮膚類器官功能及應(yīng)用

3 皮膚類器官的應(yīng)用

隨著類器官的廣泛研究與應(yīng)用，皮膚類器官的應(yīng)用從構(gòu)建實驗室研究模型向傷后愈合、皮膚癌癥、免疫代謝疾病和炎癥疾病治療及藥物測試領(lǐng)域不斷擴(kuò)展。

3.1 皮膚創(chuàng)傷再生

在近10年中，干細(xì)胞在皮膚創(chuàng)面愈合和組織再生中的作用逐漸成為研究熱點［77］。臨床上認(rèn)為傷口愈合包括止血、炎癥、增殖和重建4個連續(xù)且程序化的重疊階段［78］。該過程的一個標(biāo)志是表皮完整性的恢復(fù)或上皮再生，任何直徑超過4 cm的全層皮膚損失，均需要植皮治療［79］。人工皮膚在植皮方面應(yīng)用最廣，有非細(xì)胞材料、自體、同種異體、異種或人工合成多種途徑獲得，而且已有多種商業(yè)化人工皮膚應(yīng)用于治療。但仍存在一些局限性，如血管生成減少、機械完整性差、無法整合、瘢痕和免疫排斥［80］。除一些暫時替代性人工皮膚外，大部分人工皮膚無法產(chǎn)生深層真皮等問題未來可以通過構(gòu)建皮膚類器官解決。Lee等［18］發(fā)現(xiàn)移植后的皮膚類器官會整合到裸鼠皮膚中，表皮層定向形成毛囊。Takagi等［17］將附有毛囊和皮脂腺的3D人體皮膚類器官移植到裸鼠體內(nèi)，皮膚類器官功能完全正常，與表皮、立毛肌和神經(jīng)纖維等宿主組織正確連接，且不會發(fā)生腫瘤。

在臨床治療中，實施的大面積創(chuàng)面愈合移植，不僅可能出現(xiàn)異體排異反應(yīng)，而且會形成大面積瘢痕。Tang等［81］利用人工皮膚聯(lián)合負(fù)壓封閉引流技術(shù)（vacuum sealing drainage，VSD），治療18例由交通事故引起的大面積皮膚缺損，術(shù)后14 d傷口縫線全部拆除，如遇感染時，大面積皮膚缺損則很難閉合。Lei等［82］將VSD結(jié)合皮膚拉伸裝置治療感染創(chuàng)面，通過在傷口邊緣反復(fù)進(jìn)行間歇性和有控制的拉伸，可以在不影響血液供應(yīng)或拉伸皮膚質(zhì)量的情況下獲得健康的皮膚。VSD在修復(fù)皮膚軟組織缺損方面發(fā)揮了前所未有的作用，它的三期治療實行自體皮膚移植，針對大面積燒傷、皮膚缺損廣泛應(yīng)用。未來針對大面積皮膚傷口，自體皮膚數(shù)量不能滿足移植需求時，可以將自體多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的皮膚類器官與VSD技術(shù)相結(jié)合，有望避免排異反應(yīng)，加速創(chuàng)面愈合，應(yīng)用于治療大面積皮膚損傷。

3.2 皮膚腫瘤

經(jīng)典的腫瘤癌癥模型，多以癌細(xì)胞體外培養(yǎng)及動物模型實現(xiàn)。有研究表明，皮膚類器官可含有每種主要皮膚癌（基底細(xì)胞癌（basal cell carcinoma）、鱗 狀 細(xì) 胞 癌 （squamous cell carcinoma）、黑色素瘤和默克爾細(xì)胞癌（Merkel cell carcinoma））的前體細(xì)胞，并能及時監(jiān)測細(xì)胞生長和分化，因此，皮膚類器官模型在疾病建模應(yīng)用中有巨大潛力。

皮膚鱗狀細(xì)胞癌是白種人最常見的惡性腫瘤之一，由表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖分化失衡所引起，主要入侵真皮和表皮交界處的基底膜。Commandeur等［83］建立了含有皮膚鱗狀癌細(xì)胞的人體外皮膚三維模型，用于治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌的藥物篩選。黑素細(xì)胞是人類皮膚正常細(xì)胞，一旦惡性轉(zhuǎn)化成黑色素瘤（melanoma），將會導(dǎo)致一種高度侵襲性的癌癥，且轉(zhuǎn)移潛力大大增加。Kim等［84］從海洋微生物天然產(chǎn)物中分離得到(-)-4-羥基沙他酸，將其抗色素作用在以懸滴法建立的人工黑色素瘤球體皮膚模型中，可以降低黑素合成量。默克爾細(xì)胞癌是一種主要發(fā)生在皮膚真皮層的侵襲性惡性腫瘤，具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征。Loke等［85］將多瘤病毒陽性的默克爾細(xì)胞嵌入人角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等效物之間的膠原蛋白中，導(dǎo)致真皮等效物內(nèi)出現(xiàn)默克爾細(xì)胞癌樣病變。這種3D組織培養(yǎng)系統(tǒng)提供了一個新的體外平臺，未來有望以皮膚類器官進(jìn)行研究，用于研究病毒抗原在腫瘤發(fā)生中的作用，確定參與該過程的其他因素，以及篩選潛在的皮膚癌癥治療策略。

3.3 免疫及代謝類疾病

在免疫代謝方面，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）治療自身免疫性疾病，包括Ⅰ型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，同時還可用于非免疫性疾病治療，如2型糖尿病、阿爾茨海默病等［86-88］。以Treg為基礎(chǔ)的治療可以減少毒副作用，并最終誘導(dǎo)免疫耐受，而不會出現(xiàn)與惡性腫瘤和感染相關(guān)的免疫抑制［89］。Landman等［90］向人源化小鼠皮膚炎癥模型中注射Treg，發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞的IFN-γ、IL-17A和抗菌肽hBD2表達(dá)減少，表皮標(biāo)志物表達(dá)正常化，抑制表皮增厚。針對特殊傷口愈合，最近也出現(xiàn)了新的模型。代謝性疾病糖尿病的主要并發(fā)癥之一便是傷口愈合受損，而對糖尿病人傷口愈合潛在機制缺乏研究。León等［91］開發(fā)了一種糖尿病誘導(dǎo)的延遲人源化傷口愈合模型，與糖尿病患者的皮膚轉(zhuǎn)錄組圖譜非常接近。未來有望應(yīng)用皮膚類器官構(gòu)建相關(guān)模型，再現(xiàn)此類皮膚修復(fù)缺陷的主要組織學(xué)特征，剖析在這種臨床前模型中糖尿病傷口修復(fù)損害的早期分子機制，為糖尿病治療帶去新希望。

3.4 炎癥疾病

皮膚作為一個可以用原代細(xì)胞模擬的器官，可以有效展示人類皮膚的多層結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)模式，這為利用相關(guān)的原代細(xì)胞在復(fù)雜的疾病模式下有針對性地研究目標(biāo)分子機制提供了可能。特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD），又稱特應(yīng)性濕疹（atopic eczema），是一種慢性炎癥性皮膚病，以劇烈瘙癢和反復(fù)濕疹為特征［92］。Elias等［93］使用來自健康個體的成纖維細(xì)胞，通過siRNA介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)建立皮膚類器官模型，發(fā)現(xiàn)微絲蛋白（filaggrin）缺乏可能是特應(yīng)性皮炎的誘因。Sriram等［94］利用纖維蛋白真皮基質(zhì)和無血清培養(yǎng)條件，在IL-4等細(xì)胞因子培養(yǎng)下，誘導(dǎo)建立了特應(yīng)性皮炎樣皮膚模型。Kitisin等［95］以皮膚念珠菌建立體外感染模型，高通量篩選出針對多種抗真菌耐藥病原體的藥物，有助于未來更有效的靶向治療。iPSC來源的角質(zhì)形成細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中也具有巨大的潛力，可作為一種快速組織替代治療皮膚病的無限細(xì)胞源，如人角質(zhì)形成細(xì)胞可以通過分泌IL-1β、TNF-α和基質(zhì)金屬蛋白酶，協(xié)同觸發(fā)或加劇抗球蟲感染的免疫應(yīng)答。Ishibashi等［96］研究已經(jīng)證明，在球形分枝桿菌感染期間，人類角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生IL-5的增加在皮膚炎癥和過敏反應(yīng)中擔(dān)任重要角色。如果構(gòu)建相應(yīng)皮膚類器官模型，或能更好地研究及治療炎癥性疾病。

3.5 藥物篩選

臨床試驗前和疾病治療中的藥物研發(fā)與篩選，需要更高通量、大規(guī)模、快速且低成本的藥物篩選最優(yōu)模型。而傳統(tǒng)的皮膚疾病研究主要基于2D和3D皮膚細(xì)胞模型，這些模型缺乏傷口微環(huán)境和異質(zhì)性，不能真實反映疾病的發(fā)生發(fā)展機制、藥物反應(yīng)等。Wang等［97］利用聚乳酸-羥基乙酸多孔微球共載人肝癌細(xì)胞（human hepatocellular carcinoma cells，HepG2）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human hepatocellular carcinoma cells，HUVECs）的3D內(nèi)皮化肝腫瘤組織模型，與傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)相比，模型能顯著延長藥物分子進(jìn)入內(nèi)部的內(nèi)化時間，且藥物對不同位置細(xì)胞的可得性不同，在腫瘤藥物篩選中具有重要作用。與體內(nèi)細(xì)胞相比，2D培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)扁平且信號通路差異，影響了其對藥物的真實反應(yīng)［98］。當(dāng)細(xì)胞形成3D細(xì)胞簇或球體時，有時會出現(xiàn)多細(xì)胞耐藥性［99］。類器官模型則可以最大程度還原體內(nèi)生理特征，降低異質(zhì)性，在藥物開發(fā)早期階段應(yīng)用，可以在動物實驗前實現(xiàn)高效低成本的篩選大批量的候選藥物［100］。因此，皮膚類器官作為模型和方法，針對個體癥狀建立精準(zhǔn)的藥物篩選系統(tǒng)靶向治療，同時也使不合適的藥物在更早的階段被發(fā)現(xiàn)，未來在實驗室階段和臨床研究前的皮膚疾病研究治療領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。

4 討論與展望

現(xiàn)有類器官種類較多，但皮膚類器官的研究相對較少。以全球發(fā)病最多的非黑色素瘤皮膚癌為例，國內(nèi)發(fā)病率位列第6［101］，惡性黑素瘤發(fā)病率雖較低，但黑素瘤發(fā)病率正在快速增長，相關(guān)研究和論文數(shù)量遠(yuǎn)低于小腸、肝臟等器官，亟待研究并建立皮膚類器官以用于科學(xué)研究和皮膚病臨床治療［102］。

無論是最早研究的腸類器官，還是最新研究展示的皮膚類器官，都遵循自然發(fā)育程序，由干細(xì)胞定向分化，而構(gòu)建起與體內(nèi)對應(yīng)物相似的結(jié)構(gòu)功能。但是，類器官在研究和應(yīng)用中大都存在以下兩個重要問題：一是類器官培養(yǎng)缺乏一致性，目前無法達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；二是現(xiàn)有類器官附屬物種類不全，無法真實模擬脂質(zhì)代謝、血液循環(huán)等體內(nèi)生理情況。

類器官培養(yǎng)缺乏一致性，可能與細(xì)胞的來源、形態(tài)大小和培養(yǎng)條件難以實現(xiàn)嚴(yán)格控制有關(guān)。針對前述多種細(xì)胞來源所制備的皮膚類器官，需要統(tǒng)一特定的細(xì)胞來源。在培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基、生長因子等試劑耗材同樣需要做統(tǒng)一規(guī)格。類器官中常用的三維水凝膠同樣需要標(biāo)準(zhǔn)化。Gjorevski等［24］利用ECM力學(xué)的局部圖案化和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的水凝膠支架來構(gòu)建初始大小和形狀可控的類器官，通過從外部控制小腸干細(xì)胞的自組織過程，實現(xiàn)及時預(yù)測和影響其發(fā)育過程，并有利于確定上皮模式形成的潛在機制。皮膚類器官的一致性可以參考以上條件做出相應(yīng)改進(jìn)，如統(tǒng)一類器官三維培養(yǎng)所使用的凝膠，繼而控制細(xì)胞培養(yǎng)初始形態(tài)。促進(jìn)多能干細(xì)胞的擴(kuò)增，可以使用完全重組的ECM蛋白、表面植有促進(jìn)細(xì)胞黏附的多肽和合成聚合物涂層［103-105］。Lee等［65］在從小鼠肉瘤細(xì)胞中提取的凝膠狀蛋白質(zhì)混合物Matrigel?基質(zhì)膠中培養(yǎng)的多能干細(xì)胞衍生的皮膚類器官模型顯示，在小鼠體內(nèi)30 d內(nèi)可產(chǎn)生皮脂腺、脂肪細(xì)胞和毛囊。但動物源性基質(zhì)存在批次間差異和高成本的限制，無法輕松定制以獲得特定器官的獨特類器官生態(tài)位。于是，研究人員將目光投向了可以提供化學(xué)基質(zhì)的生物工程材料——由納米材料注入的復(fù)合水凝膠［106］。具有一致性高的可重復(fù)性復(fù)合水凝膠有望提高類器官培養(yǎng)的效率和一致性。

類器官培養(yǎng)過程中的生長情況應(yīng)及時監(jiān)測，是否達(dá)到應(yīng)用要求也需在生長后期制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法。近年發(fā)展起來的器官芯片（organ-on-achip，OOC）技術(shù)和微流控芯片（lab-on-a-chip，LOC）可以對結(jié)構(gòu)和功能清晰的人體器官進(jìn)行設(shè)計，模擬器官和器官系統(tǒng)活動、生物力學(xué)及生理代謝反應(yīng)，精確控制細(xì)胞及微環(huán)境，實現(xiàn)在特定環(huán)境中研究特定器官的人體生理學(xué)。應(yīng)用含有微型細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備的皮膚芯片技術(shù)，可以見證細(xì)胞360°的擴(kuò)散、遷移、增殖、分化以及相互作用，同時模擬皮膚多種生理代謝功能，如脂質(zhì)代謝、代謝產(chǎn)物分析、皮膚滲透性等，并可建立相應(yīng)的體外皮膚刺激評估模型［107-108］。器官芯片與類器官技術(shù)有效結(jié)合，可以實現(xiàn)體外重建人體器官的最終目標(biāo)。目前，研究人員也正在積極探索結(jié)合這兩種技術(shù)的可能性和最佳方法。

缺乏定植于皮膚類器官的附屬物，也無法實現(xiàn)在體外模擬真實的皮膚系統(tǒng)。毛囊可以由干細(xì)胞培養(yǎng)成皮膚類器官后生成，也可在直接類器官生長前期加入毛囊角化細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞和干細(xì)胞共同培養(yǎng)，皮脂腺和汗腺則需各自生成單個類器官。皮膚血管支持血液及代謝循環(huán)，目前已有應(yīng)用于腦、腎類器官的模型，但尚未出現(xiàn)在皮膚類器官模型中［109-110］。然而，血管生成在傷口愈合中尤為重要，基于水凝膠血管化構(gòu)建的類器官模型，將血管生成相關(guān)因子直接加入水凝膠基質(zhì)中，以此調(diào)節(jié)生物信號的傳遞，加速血管形成，未來有望構(gòu)建血管化的皮膚類器官［111］。通過產(chǎn)生黑色素以防止紫外線對人體皮膚細(xì)胞產(chǎn)生損傷的黑素細(xì)胞也已在實驗室建立了相應(yīng)的黑素瘤類器官模型，可以高通量測試單藥和組合治療策略的功效，之后有望應(yīng)用于皮膚類器官中［112］。未來還可以嘗試將不同類型的免疫細(xì)胞引入類器官以構(gòu)建具有免疫能力的皮膚模型，這將有助于研究表皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的復(fù)雜串?dāng)_，更好地了解皮膚組織對由皮膚微生物等有害因素引發(fā)感染的免疫反應(yīng)機制。

現(xiàn)階段，實驗室體外培養(yǎng)的2D/3D細(xì)胞模型、類器官以及動物實驗在藥物研發(fā)領(lǐng)域被作為必要的評價流程。通過較易控制個體一致性的2D/3D細(xì)胞模型或類器官的驗證和大規(guī)模篩選，可以獲得大量前期數(shù)據(jù)，為后期動物實驗的開展提供支撐，并節(jié)約成本、縮短實驗周期。然而，無論是普通細(xì)胞模型還是類器官技術(shù)，仍存在眾多局限性，相關(guān)研究仍然不能滿足實際應(yīng)用要求，未來還需要能夠大規(guī)模穩(wěn)定生產(chǎn)的技術(shù)和方法。相信在不遠(yuǎn)的將來，皮膚類器官所涵蓋的細(xì)胞和組織種類將越來越豐富，具備免疫反應(yīng)、代謝、血液循環(huán)等體內(nèi)功能，可以在體外環(huán)境下實現(xiàn)更接近真實狀態(tài)的皮膚生理生態(tài)系統(tǒng)。