mRNA腫瘤疫苗的免疫學機制和臨床研究進展

鄧卓雅 田昱瑩 楊鵬輝

（1）解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心肝膽胰外科醫(yī)學部，全軍肝膽外科研究所，北京 100853；2）解放軍醫(yī)學院，北京 100853；3）內蒙古醫(yī)科大學，呼和浩特 010110）

近年來，盡管腫瘤治療取得了顯著進展，但惡性腫瘤仍然是世界第二大致死原因［1］。臨床上常規(guī)的腫瘤治療手段包括手術、放療、化療、靶向治療、免疫治療和綜合治療等。此外，檢查點抑制劑（checkpoint inhibitor，CPI）對多種惡性腫瘤的有效治療啟發(fā)了人們對腫瘤免疫治療的新思路［2］。腫瘤免疫治療的目的是激活宿主的抗腫瘤免疫，改變抑制腫瘤的微環(huán)境，最終達到縮小腫瘤，提高患者總體生存率的目的。腫瘤疫苗是一種有潛力的抗腫瘤免疫治療手段。針對腫瘤相關抗原（tumorassociated antigen，TAA）或 腫 瘤 特 異 性 抗 原（tumor-specific antigens，TSA）的疫苗可以特異性地攻擊和摧毀高表達腫瘤抗原的惡性腫瘤細胞，并通過免疫記憶而實現對腫瘤的持續(xù)殺傷作用。因此，與其他免疫療法相比，腫瘤疫苗提供了特異、安全和可耐受的治療方法。盡管研究者在開發(fā)腫瘤疫苗方面做出了相當大的努力，但由于腫瘤抗原的高度多樣性和相對較低的免疫反應，幾十年來將腫瘤疫苗轉化為有效的臨床治療方法仍然具有挑戰(zhàn)性［3］。mRNA疫苗作為腫瘤疫苗的重要類型，能夠編碼TAA、TSA及其相關的細胞因子，同時激發(fā)體液和細胞介導的免疫反應，增加克服疫苗耐藥性的可能性，從而達到加強患者抗腫瘤免疫的效果，成為一種具有良好前景的治療方式。mRNA疫苗具有多種優(yōu)勢，如能夠產生強有力的保護性免疫反應，mRNA的生產速度更快、更靈活、成本更低，可以用于精準和個性化的治療。體外轉錄后再加帽加尾是mRNA腫瘤疫苗公認的生產方法，它類似于真核細胞胞漿中自然加工和成熟mRNA。當接種疫苗部位的細胞吸收后，mRNA被運輸到細胞質。接著，通過核糖體合成mRNA編碼的蛋白質，然后進行翻譯后修飾，產生正確折疊的功能蛋白質。mRNA疫苗可以使其編碼的蛋白質或肽瞬時表達，持續(xù)幾天或幾周，使得mRNA更容易控制。更為重要的是從安全性出發(fā)，與DNA疫苗相比，mRNA不會整合到宿主基因組中。

本文聚焦于mRNA疫苗目前在腫瘤治療方面的應用，并總結了mRNA領域的發(fā)展和面臨的挑戰(zhàn)，將有助于更好地認識和了解mRNA疫苗的免疫學機制和臨床研究進展，為腫瘤治療提供新的研究策略。

1 mRNA制備策略

mRNA腫瘤疫苗的制備方法是體外轉錄（in vitro transcription，IVT），它模擬真核細胞胞漿中自然加工和成熟mRNA（圖1）。體外轉錄是一個相對簡單的過程，但制造高質量的、高度可翻譯的、不會引起嚴重炎癥的“治療性”mRNA一直是該領域的主要限制。最近炎癥和自身免疫得到了很大程度的解決，包括加帽加尾技術的改善、加入修飾性核苷［4］（特別是修飾的尿苷）、優(yōu)化編碼序列［5］、以及通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）［6］嚴 格 純 化IVT mRNA以去除雙鏈RNA（dsRNA）污染物。這些技術將有助于減少外源mRNA的信號，從而降低炎癥反應并改善mRNA的翻譯水平。

1.1 序列構建

首先，mRNA疫苗需要設計一條DNA模板去進行體外轉錄。該DNA模板至少需要包含目的蛋白質的開放閱讀框（open reading frame，ORF）、側翼的5′非翻譯區(qū)（5′untranslated region，5′UTR）和3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）。其次需要含有可用的RNA聚合酶（例如T7、T3或SP6噬菌體RNA聚合酶）［7］的引物結合位點啟動體外轉錄。

ORF本身編碼的目的蛋白質會影響翻譯效率，有些稀有密碼子也會降低翻譯效率。而氨基酸可由幾個密碼子共同編碼，利用密碼子的兼并性可以優(yōu)化氨基酸對應的密碼子進而優(yōu)化翻譯過程［8］。但原始序列的操縱也可能導致不利結果，有研究表明即使是同義突變也會導致疾病的發(fā)生［9］。

UTR具有重要的細胞功能，可以通過與RNA結合蛋白相互作用來影響mRNA降解速率和翻譯效率，從而調節(jié)蛋白質的表達［10］。5′UTR在翻譯的啟動和啟動前復合體的形成過程中起著重要的作用。5′UTR除了有助于啟動翻譯和提高翻譯效率外，對mRNA的穩(wěn)定性也很重要。3′UTR可以通過包含如來自α-或β-珠蛋白等序列［11］來提高翻譯效率；也可以增加miRNA的結合位點來調控靶基因在不同組織的表達，例如增加miRNA-122結合位點來減少在正常肝組織表達從而降低肝毒性［12］。此外，較高的GC含量和較低的U含量有利于降低免疫原性，最大限度地提高IVT mRNA的穩(wěn)定性［13］。

1.2 體外轉錄

體外轉錄（IVT）是將設計好的模板DNA鏈根據堿基互補原則轉錄生成RNA鏈的過程。RNA聚合酶識別轉錄啟動子后轉錄開始。在體外轉錄過程中，修飾的核苷酸可以用來進一步穩(wěn)定RNA并降低免疫原性［14］。常見的替代有N6-甲基腺嘌呤（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）、5-甲基尿嘧啶（m5U）、2-硫代尿嘧啶（s2U）或假尿嘧啶（ψ）等。特別是m5C和ψ，不僅被報道降低體外轉錄后RNA的免疫原性，甚至可以提高翻譯效率。

1.3 加帽

真核細胞中典型的5′帽結構是一個倒置的7-甲基鳥苷（m7G），它通過5′-5′三磷酸橋與RNA的第一個核苷酸共轉錄。5′帽結構的功能是增加體外轉錄后RNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，并消除其免疫原性。正常核糖體的結合與啟動轉錄需要5′帽子結構的作用，5′UTR和5′帽子結構的作用相關，在翻譯的啟動和啟動前復合體的形成過程中起著重要的作用。體外轉錄后RNA有一個高度免疫原性的5′三磷酸部分。三磷酸化的RNA在細胞質中被模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別，并引起Ⅰ型干擾素（typeⅠinterferon，IFNⅠ）反應［15］。為了防止RNA被識別為外源物質，必須去掉其三磷酸，并添加一個5′帽。有幾種方法來實現這一點［16］。加帽可以通過在體外轉錄反應中添加一個帽子類似物來進行共轉錄。添加一個帽子類似物有可能會被錯誤地結合，導致mRNA不具備翻譯能力，而抗反向帽類似物（anti-reverse cap analog，ARCA）使聚合酶以正確的方向結合ARCA［17］。也可以通過用磷酸酶去除三磷酸腺苷和用2′-O-甲基轉移酶添加m7G來完成轉錄后的封頂。無論是轉錄中還是轉錄后加帽，都不能保證所有的RNA分子都會被修飾加帽，由于錯誤封頂激活PRRs導致外源mRNA免疫原性的提高［18］。

1.4 加尾

Poly（A）尾可以使用Poly（A）聚合酶［19］在轉錄后添加，也可以構建在模板中直接轉錄。Poly（A）尾可以減緩RNA免受RNA核酸外切酶的降解過程，提高RNA穩(wěn)定性和翻譯效率。Poly（A）尾的長度一般是100~250個核苷酸，但最佳長度取決于靶細胞類型。使用修飾的腺苷可以進一步提高多聚（A）尾的穩(wěn)定性，使其不受細胞核糖核酸酶的降解［20］。在DNA模板中構建Oligo（dT）來添加Poly（A）尾可以更好地控制尾巴的精確長度，并使隨后的酶促反應失效，但作為模板的一部分其長度往往受到限制。

1.5 純化

體外轉錄后需要純化mRNA，并測定其濃度，排除異常、截斷和降級產品。臨床上通過層析的技術純化mRNA，去除了由轉錄失敗而引起的較短模板片段或由自身互補3′延伸引起的dsRNA，這兩者都是造成雜質的常見原因。為了從轉錄的mRNA中去除dsRNA，人們提出了一種基于對纖維素的吸附來純化mRNA的替代方法［21］。在IVT過程中，可以通過降低Mg2+濃度或在高溫下產生RNA來減少dsRNA種類［22］。HPLC實現了dsRNA的更完整和更徹底的去除［23］。然而，HPLC純化mRNA的成本高、收率低（<50%）。最近，Baiersdorfer等［21］報道了一種快速、廉價的純化方法。該方法利用dsRNA與含有乙醇的緩沖液中的纖維素粉的選擇性結合，結合快速蛋白液相色譜（fast protein liquid chromatography，FPLC），可去除高達90%的dsRNA?，F經證明，成功的mRNA翻譯和蛋白質表達不需要使用任何修飾的核苷酸，更多地依賴于mRNA的純度和其單個部分的序列組成［24］。

2 mRNA遞送系統(tǒng)

除了構建序列、生產mRNA，開發(fā)高效、安全的mRNA疫苗遞送系統(tǒng)也是mRNA疫苗技術的關鍵。已有的傳統(tǒng)方法，如體外負載樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、結內輸送mRNA和機械方法（基因槍、電穿孔）來傳遞裸露的mRNA用于疫苗接種［25］，但這些方法要么復雜昂貴（體外負載DC），要么難以在人體內使用（結內輸送、電穿孔），因此，傳遞mRNA的理想方式是使用一種能夠保護mRNA不被降解，并促進細胞有效攝取的材料。

2.1 多聚體納米顆粒

多聚體納米顆粒封裝mRNA可保護mRNA并使其免于降解，并且其特定的化學性質可以幫助細胞攝取和內體逃逸。聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）是一種廣泛用于核酸輸送的陽離子聚合物，商品化的線性PEI衍生物jetPEI?已被用于體內和體外的mRNA轉染。脂肪鏈修飾的低分子PEI可以降低毒性［26-27］。聚酰胺胺（polyamidoamine，PAMAM）或聚丙烯亞胺樹枝狀大分子是另一類用于mRNA傳遞的陽離子高分子材料。Khan等［27］開發(fā)了脂肪鏈修飾的PAMAM樹枝狀大分子，用于系統(tǒng)地將siRNA輸送到肺內皮細胞并遞送了抗原編碼的SAM。生物可降解聚合物的開發(fā)是為了提高運載工具的清除率，同時降低其荷電毒性。聚β-氨基酯（poly beta-amino esters，PBAEs）是一種用于siRNA/mRNA遞送的生物可降解聚合物。此外，Blakeny等［28］開發(fā)的生物可還原聚CBA-co-4-氨基-1-丁醇（Pabol）被用于在小鼠體內傳遞編碼血凝素（HA）的SAM。

2.2 蛋白質-mRNA復合體

蛋白質-mRNA復合體是指將魚精蛋白等蛋白質直接綴合到RNA，該復合體通過胞吞作用進入細胞，通過涉及Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR） 的 髓 系 分 化 標 志 物88（myeloid differentiation marker 88，MyD88）依賴性途徑激活免疫系統(tǒng)。魚精蛋白是一種陽離子多肽，通過靜電相互作用自發(fā)縮合mRNA，保護包裹的mRNA不被細胞外核糖核酸酶降解。魚精蛋白-mRNA復合物還可以作為佐劑，激活TLR7/8以誘導Th-1型免疫反應［29-30］。RNActive?疫苗在Ⅰ/Ⅱ期患者中具有良好的耐受性和免疫原性，其中一些已經顯示出中等的抗腫瘤效果。陽離子細胞穿透肽（cellpenetrating peptides，CPPs）能 與RNA形 成 復 合物。研究人員推測CPPs可能促進帶負電荷的糖胺聚糖在細胞表面聚集，并引發(fā)微胞吞噬［30］。

2.3 脂質納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs）

近幾年，高效核酸輸送材料的開發(fā)取得了突飛猛進的進展。脂質納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs）最初是為小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）遞送而研發(fā)，現已成為目前使用最廣泛的體內傳遞mRNA材料［31］。Pardi等［32］證實mRNA-LNPs可以在體內表達后，多項腫瘤疫苗研究已經使用了LNPs包裹的mRNA。此外，2021年，中國國家納米科學中心王海、聶廣軍團隊［33］設計了一款水凝膠長效穩(wěn)定RNA疫苗，體內動物實驗顯示將其皮下注射后，可以至少在30 d內持續(xù)釋放RNA納米疫苗，進入引流淋巴結內部并且被抗原提呈細胞攝取，實現持久的抗腫瘤免疫治療效果。

3 mRNA激發(fā)的免疫應答反應

注射mRNA疫苗后，編碼的蛋白質將被翻譯并呈遞給免疫系統(tǒng)。該過程類似于RNA病毒感染的自然過程及其連續(xù)誘導的保護性免疫應答。外源mRNA進入細胞質后會發(fā)生與內源性mRNA相似的反應——mRNA在細胞質中被翻譯成蛋白質，蛋白質經過翻譯后修飾通過靶向序列或跨膜結構域進入亞細胞間隔，比如分泌途徑、細胞膜、細胞核、線粒體或過氧化物酶體［34］。因此，遞送外源mRNA進入細胞質對于抗原的表達至關重要，但這個過程是通過胞內體途徑還是通過質膜直接進入尚未研究透徹［35］。

3.1 mRNA腫瘤疫苗誘導固有免疫反應

3.1.1 免疫細胞識別

外源性mRNA通常被認為是具有免疫原性的，表現為類似RNA病毒特性，通過TLR激活先天免疫細胞［7，36］。TLR屬于固有免疫反應PRR的一組，作為病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）的“感受 器”檢測PAMP。mRNA可被抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC）識別，激活TLR，如TLR3、TLR7和TLR8［37］，一旦TLR感應到PAMP，就會通過連續(xù)激活適應性免疫應答來啟動先天免疫應答［38］，產生促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），干 擾 素α（interferon-α，IFN-α），白介素-6（interleukin-6，IL-6），干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）誘導蛋白10和APC（如DC）上的共刺激分子［39］。最終導致適應性B細胞和T細胞應答的產生［38］。TLR7由B細胞［40］、巨噬細胞和DC［41］表達，并且可以檢測單鏈RNA（single stranded RNA，ssRNA）。因此，B細胞通過MYD88/TLR7依賴性信號通路快速激活，為調節(jié)mRNA疫苗誘導的適應性免疫應答提供刺激。此外，TLR7信號傳導增加促炎細胞因子的產生，增加抗原呈遞并改善記憶B細胞存活［35］。

3.1.2 非免疫細胞識別

在非免疫細胞中，細胞質維甲酸誘導基因Ⅰ（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）樣 受 體（RIG-I like receptor，RLR）和黑色素瘤分化相關基因（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）感知外源mRNA并介導細胞因子和趨化因子的產生［19，40，42-43］，進而招募先天免疫細胞，如DC和巨噬細胞到mRNA注射部位［42］。雖然早期誘導強大細胞因子的產生對提高疫苗效力來說是有利的，但由于細胞因子會導致自身免疫等嚴重的全身副作用，或削弱mRNA疫苗的免疫應答使得腫瘤疫苗不能完全發(fā)揮抗腫瘤免疫作用（圖2）。有研究表明，在慢性感染發(fā)生時，IFN-Ⅰ應答保持不變，產生的多種下游效應與持續(xù)的T細胞受體（T cell receptor，TCR）信號和其他免疫調節(jié)機制（如共抑制受體、免疫抑制細胞因子的表達和調節(jié)性T細胞數量的增加）相結合，這會導致CD8+T細胞反應功能障礙，也稱為T細胞耗竭。因此人們在mRNA疫苗技術中尋求用不同的方法來將IFNⅠ等細胞因子的誘導降至最低。例如，Miao等［15］提出，加入不飽和脂質尾部、二氫咪唑接頭和環(huán)胺頭部基團的mRNA，可以通過細胞內干擾素基因（stimulator of interferon genes，STING）途徑而不是TLR途徑激活APC，從而減少細胞因子的表達，降低由于細胞因子引起的自身免疫反應導致的副作用，提高抗腫瘤效果。

綜上所述，對于外源mRNA的先天感應可能導致mRNA翻譯停滯、mRNA降解以及連續(xù)的次要抗原特異性免疫反應［43］，這些表明在mRNA接種后先天免疫和獲得性免疫之間存在密切聯(lián)系。

3.2 mRNA腫瘤疫苗誘導獲得性免疫

3.2.1 抗原呈遞

在注射mRNA疫苗后，其編碼的蛋白質將被翻譯并呈遞給免疫系統(tǒng)，并激發(fā)獲得性免疫。mRNA編碼的蛋白質被翻譯后通過微吞飲、內吞或吞噬作用被APC（如DC）攝?。?4］，可能形成含有抗原蛋白的吞噬小體或內小體［45］，通過DC上的主要組織相容性復合體Ⅰ（MHC-Ⅰ）和主要組織相容性復合體Ⅱ（MHC-Ⅱ）提呈。APC可以將外源抗原通過MHC-II呈遞給CD4+T細胞，并在MHCI上交叉呈遞給CD8+T細胞。由此產生的細胞毒性T淋巴細胞誘導稱為交叉激發(fā)。CD4+T細胞為B細胞和CD8+T細胞提供幫助。最后，抗原特異性B細胞和T細胞的克隆擴增導致靶細胞消除。此外，所有有核細胞都有能力去處理mRNA并在MHC-Ⅰ上呈遞翻譯的蛋白質或多肽，但只有APC能夠在MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ上呈遞，進而誘導CD4+T細胞和B細胞產生免疫反應（圖3）。此外，DC可以內化活細胞的胞漿和細胞膜物質來啟動T細胞反應［46］。

3.2.2抗原分類

為了誘導獲得性免疫，需要將特定的抗原提呈給免疫細胞。mRNA腫瘤疫苗通常編碼TAA，這些抗原在癌細胞上優(yōu)先表達。對這些腫瘤來源的抗原進行分類，可以細分為：a.組織分化抗原如人類癌胚抗原（human carcinoembryonic antigen，CEA）或MART-1，也可在健康組織上表達；b.腫瘤種系（睪丸癌）抗原（例如NY-ESO-1或MAGE-3）；c.腫瘤細胞過表達的正常蛋白（如EGFR、MUC1、Her2/neu）；d.病毒蛋白（如EBV、HPV）；e.腫瘤特 異 性 突 變 抗 原（如MUM-1、β-catenin或CDK4）［47-48］?；虍惓Ｊ悄[瘤發(fā)展的重要驅動因素［49］。體細胞突變可能產生新抗原表位，這些表位是腫瘤衍生的肽并且可以與MHC結合［50］并被T細胞識別，因此編碼新抗原的mRNA疫苗被認為是最佳的腫瘤疫苗候選［49］。同樣，識別這些抗原的T細胞在過繼轉移或免疫檢查點抑制后介導臨床反應［51］。且有研究表明含有較高新抗原表位負荷的腫瘤，如黑色素瘤、非小細胞肺癌和錯配修復缺陷的結直腸癌，都對免疫檢查點抑制劑有較好的反應［52］。

3.2.3 免疫效應

基于多肽的疫苗受到MHC限制，而mRNA疫苗允許組合編碼不同抗原的mRNA。mRNA電穿孔的樹突狀細胞具有多種MHC-I和MHC-II限制性多肽，并能誘導多克隆的CD4+和CD8+T細胞應答。CD4+輔助T細胞對于有效誘導細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和B細胞應答非常重要［53］，并且mRNA疫苗在存在輔助表位時可以進一步提高免疫應答。將mRNA導入樹突狀細胞后，誘導CD4+T細胞反應是由自噬介導的［54］。最后，疫苗組合物中可以包括編碼免疫調節(jié)蛋白的mRNA，可以進一步提高其效力。綜上所述，編碼兩個或更多蛋白質或長肽的mRNA疫苗可以實現廣泛的多克隆免疫反應，避免了對某些MHC分子的限制和由于抗原丟失而導致的免疫逃逸風險。

應用編碼突變抗原表位的mRNA可產生強烈的抗原特異性CD8+T細胞反應和有效持久的CD4+T細胞介導的腫瘤消退。Kreiter等［55-56］證明，大多數腫瘤特異性突變是由CD4+T細胞識別的，這種細胞具有很強的抗腫瘤活性。CD4+T細胞應答主要由一種以Th1為主的免疫應答以及由CD4+和CD8+T細胞產生的IFN-γ組成。對于這種強烈的Th1反應，不同的研究試圖利用mRNA疫苗作為工具來調節(jié)Th分化。例如，對于Ⅱ型免疫反應（其特征是分泌細胞因子IL-4、IL-5、IL-13和過敏原特異性IgE），應用了mRNA疫苗從而減少了過敏性輔助T細胞（T helper 2，Th2）反應。

除了誘導T細胞免疫外，mRNA疫苗還誘導中和抗體。T濾泡輔助細胞（T follicular helper，Tfh）不僅對生發(fā)中心（germinal center，GC）的發(fā)生至關重要，還驅動免疫球蛋白類的轉換、親和力成熟和持久的B細胞記憶反應。盡管Tfh的確切機制尚未清楚，但這種細胞會被mRNA疫苗激活，然后產生足夠數量、有效和持久的中和抗體［57］。Pardi等［58］將脂質納米顆粒包裹的mRNA疫苗用于皮下注射，發(fā)現可以誘導小鼠和非人靈長類動物產生抗原特異性CD4+T細胞、B細胞和漿細胞反應以及高效的中和抗體。疫苗的接種方式決定了抗原表達的持續(xù)時間（肌肉注射較皮內注射表達的時間長），持續(xù)的抗原表達導致高抗體滴度以及生發(fā)中心B細胞和Tfh反應［59］。

4 mRNA疫苗的抗腫瘤免疫應答策略

多種技術可以改善mRNA的傳遞、組成、免疫原性或可譯性。然而，大多數腫瘤疫苗試驗很難在晚期或難治性腫瘤患者中發(fā)揮作用，其中，主要原因是無法高效誘導T細胞免疫反應。TAA是一種非突變自身抗原，通常能誘導中樞T細胞耐受［60］。所以針對腫瘤的免疫反應需要考慮幾個具體的因素：疫苗應用的最佳時機、靶抗原的選擇、與免疫佐劑的聯(lián)用、對腫瘤微環(huán)境的改變以及與其他腫瘤治療結合（圖4）。這些策略可能會產生協(xié)同甚至相加的抗腫瘤效果。

4.1 疫苗應用時機

腫瘤疫苗通常在腫瘤達到一定大小或已經轉移時使用。這時癌細胞與免疫系統(tǒng)進行了長時間的“互動”，可能已經形成了逃離免疫系統(tǒng)的機制，并削弱了疫苗誘導的抗癌免疫的治療效果［61］。因此，為提高mRNA疫苗治療效果，應在疾病的早期階段（如輔助治療期間）應用。如在一項隨機的II期臨床試驗中，招募黑色素瘤術后且無復發(fā)的患者，進行自體DC遞送編碼TriMix的mRNA和編碼4種TAA（MAGE-A3、MAGE-C2、酪 氨 酸 酶 或gp100）之一的mRNA共電穿孔治療并與HLA II類靶向信號相關的療效［62-63］。這種治療耐受性良好，提高了患者1年無病存活率。研究者提出，與CPI聯(lián)合治療或靶向治療可能會進一步提高高復發(fā)風險患者的存活率［63］。

4.2 靶抗原選擇

腫瘤患者個體間的異質性會阻礙有效的免疫誘導，使產生的腫瘤免疫反應明顯不同。腫瘤累積了數以千計的基因組突變，其中一小部分會產生新的抗原表位，這些表位可以被免疫系統(tǒng)識別，并抑制腫瘤生長。下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術的進步可破譯腫瘤患者的基因組、外顯子組和轉錄組，從而針對腫瘤患者的個體免疫原性突變構建個性化mRNA疫苗，并實現快速大量生產，極大地推動了個性化腫瘤治療的進展［64-65］。

4.3 免疫佐劑聯(lián)用

在mRNA疫苗系統(tǒng)中添加免疫佐劑可以增強mRNA疫苗的免疫原性。如用諾華公司生產的佐劑MF59和陽離子納米乳劑（cationic nanoemulsion，CNE）配制的自擴增RNA疫苗，在各種動物模型中被證明可以增強mRNA疫苗的免疫原性和有效性［7，66］。某些免疫調節(jié)分子也具有佐劑活性。TriMix是布魯塞爾大學開發(fā)的一種新的佐劑策略，由編碼三種免疫激活蛋白的mRNA組成CD70、CD40配 體（CD40L）和TLR4［30，62，67］。TriMix mRNA可以增加裸露的、未修飾的、未純化的mRNA的免疫原性，它還與增強DCs的成熟度和細胞毒性T淋巴細胞反應有關［67］。2018年，Leal等［68］采用TriMix裸體mRNA策略治療獲得性免疫缺陷綜合征 （acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者。使用大劑量TriMix mRNA的治療表明，可以刺激和檢測到高的人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）特異性T細胞反應。這項研究已經證明了這種策略的高度安全性和耐受性。CureVac公司還開發(fā)了具有所謂自佐劑活性的RNActive?疫苗。它們只包含有體外轉錄的mRNA和魚精蛋白復合的絡合物［69-70］。這種遞送的mRNA尤其增強了B和T細胞反應，包括T細胞效應和記憶反應，以及Th1和Th2細胞和GC B細胞等亞群的擴張［42，69］。在臨床前模型中，RNActive?疫苗可有效預防不同的流感病毒株，并顯示出抗腫瘤效果［42，70-72］。疫苗可有效預防不同的流感病毒株，并顯示出抗腫瘤效果［72-73］。

4.4 改變腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中存在的幾個免疫細胞是免疫抑制環(huán)境中的關鍵調節(jié)細胞，促進了腫瘤的發(fā)生以及血管生成和轉移［74］。其中，癌相關成纖維細胞（cancerassociated fibroblasts，CAF）和腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）可被認為是在TME中發(fā)現的最豐富的非腫瘤細胞且TAMs對環(huán)境刺激有顯著的反應潛力，許多研究表明，TAMs的調節(jié)可以誘導抗腫瘤T細胞反應［75-78］。已有研究表明，使用IVT mRNA編碼TAMs［79］，通過CAR-T納米顆粒技術將其送入腫瘤內，可以誘導腫瘤相關DCs（tumor-associated DCs，TADC）的局部調節(jié)［80］。TME中腫瘤細胞與各種免疫組分的相互作用可以顯著影響腫瘤細胞的生長。大多數腫瘤細胞通過表達免疫抑制蛋白如程序性死亡配體1（PD-L1）、產生免疫抑制因子如IL-10和趨化因子、招募免疫抑制細胞如調節(jié)性T細胞、M2巨噬細胞和髓系來源的抑制細胞來進行免疫逃逸，這種促進腫瘤生長的微環(huán)境導致T細胞的無能和耗盡，從而延長了腫瘤細胞的存活期［61，81］。因此，理想的腫瘤疫苗可以改善局部免疫細胞組成，恢復腫瘤免疫監(jiān)視。免疫檢查點已被證明能影響腫瘤微環(huán)境的結構，并且有重新激活和擴大原有T細胞或誘導新的抗癌免疫反應的潛力［82］。免疫檢查點抑制劑能夠維持一次誘導的免疫反應，并防止T細胞耗竭標志物的上調，這使它們成為mRNA疫苗的有效伴侶［83］。例如，免疫檢查點抑制劑與編碼Trp2的mRNA疫苗相結合，在C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤模型中誘導了強大的TAA特異性免疫反應，從而抑制了腫瘤的生長［83］。在這個模型中，PD-L1 siRNA和mRNA疫苗的聯(lián)合傳遞下調了抗原呈遞DC中PD-L1的表達，從而增加了T細胞的激活和增殖［83］。

5 mRNA腫瘤疫苗臨床研究進展

mRNA經DC遞送的疫苗是第一個進入臨床試驗的mRNA治療性腫瘤疫苗［30］。目前基于IVT mRNA的疫苗主要分為3部分，mRNA編碼免疫刺激劑、TAA和TSA。在大多數臨床試驗中，mRNA腫瘤疫苗已被應用于治療侵襲性、難治性和轉移性實體腫瘤，并進一步與檢查點調節(jié)劑或細胞因子結合以增強抗腫瘤效果。這一部分綜述了mRNA編碼的免疫刺激劑、腫瘤相關抗原和腫瘤特異性抗原腫瘤疫苗在臨床的應用，以及討論個性化疫苗和帶有檢查點阻斷調節(jié)劑的聯(lián)合免疫療法的優(yōu)勢。

mRNA編碼的免疫刺激劑通常是細胞因子或趨化因子，它們誘導APC成熟和并激活APC，激活T細胞介導的免疫，并調節(jié)功能失調的免疫腫瘤微環(huán)境。已經被用來編碼免疫刺激劑的mRNA，目前大多數評估處于I/II階段，并評估單一治療或與其他藥物（包括PD-1/PD-L1抗體或腫瘤疫苗）聯(lián)合治療的耐受性（表1）。

抗原選擇是開發(fā)有效的腫瘤疫苗的基礎。腫瘤疫苗可以被設計成針對在惡性腫瘤細胞中優(yōu)先表達的TAA。例如，酪氨酸酶、gp100、MAGE-A3、MAGE-C2已被確定為黑色素瘤的TAA。在多項臨床研究中，編碼所有TAA的mRNA疫苗已經用于治療轉移性黑色素瘤（表2）。

多種因素限制了TAA疫苗的廣泛應用，如：a.僅在某些實體腫瘤中發(fā)現有限的TAA，從而限制了其應用；b.TAA具有廣泛的變異性，導致免疫效應逃逸和產生耐藥性；c.正常組織中也存在TAA。針對TAA的疫苗可能會引發(fā)中樞和外周免疫耐受反應，從而降低疫苗接種效率。腫瘤特異性抗原，又稱為新抗原，是目前mRNA疫苗的核心靶點。新抗原來源于腫瘤細胞中的隨機體細胞突變，而正常細胞中不存在。新抗原可以被宿主免疫系統(tǒng)識別為一個“非我”組分，因此是腫瘤疫苗的一個顯著靶點［84］。開發(fā)個性化新抗原疫苗最關鍵的的一步是鑒定和確認患者腫瘤中表達的特異性免疫原性非同義體細胞突變。首先進行腫瘤組織活檢。腫瘤組織的活檢是為了進行完整的外顯子組、RNA或轉錄組測序。可以通過比較腫瘤和匹配的健康組織的序列來識別腫瘤中的非同義體細胞突變，如點突變和插入缺失。接著使用MHC-Ⅰ類表位預測算法篩選、分析和鑒定具有最高免疫原性的突變。進一步確認候選抗原的排序列表。基于新抗原的個性化疫苗可以針對各種類型的變異突變［84］（表3）。

Table 1 Clinical trials of mRNA encoding an immunostimulant表1編碼免疫刺激劑的mRNA的臨床試驗

Table 2 Clinical trials of mRNA encoding TAAs表2編碼TAAs的mRNA的臨床試驗

Table 3 Clinical trials of mRNA encoding neo-antigen(Neo-Ag)表3編碼新抗原（Neo-Ag）mRNA的臨床試驗

續(xù)表3

6 安全與挑戰(zhàn)

直到2020年，世界上還沒有批準單一的mRNA疫苗治療方案。自新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情爆發(fā)以來，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準了針對嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的不同mRNA疫苗，證明mRNA疫苗針對新出現的傳染病大流行具有快速有效的生產優(yōu)勢。然而，與傳染病類疫苗針對明確抗原的預防性接種不同，大多數腫瘤靶標抗原表現出高度的個體間異質性，且數量有限、特征不明顯，mRNA腫瘤疫苗安全性、有效性問題顯得尤為突出。開發(fā)腫瘤疫苗的另一挑戰(zhàn)在于抗癌治療性疫苗需要激活MHC-Ⅰ介導的CD8+T細胞反應，這進一步增加了有效抗腫瘤免疫的難度。作為一種治療性腫瘤疫苗，需要較大用藥劑量、且多次重復給藥。治療性腫瘤疫苗需要對mRNA的生產有更高的安全性標準［85］。

mRNA疫苗的安全性體現在以下幾個方面。a.mRNA腫瘤疫苗可以同時編碼多種抗原，具有非整合性、高度可降解性、無插入誘變潛力等特點。b.IVT產生的mRNA不含細胞和致病病毒成分，沒有感染的可能性，在正在進行的臨床試驗中測試的大多數mRNA疫苗通常耐受性良好，很少出現注射部位免疫反應［86］。全身性炎癥也可以通過去除dsRNA等污染物或改變給藥途徑等方式將先天免疫反應限制在局部注射部位。由于I型干擾素反應的激活可能與自身免疫有關，所以在mRNA疫苗接種之前必須評估個體自身免疫反應增加的風險［25］。c.mRNA腫瘤疫苗的另一個優(yōu)點是生產速度快。成熟的mRNA制造技術可以在短時間內生產出新型疫苗。最近新抗原的發(fā)現和鑒定促進了個性化疫苗治療的發(fā)展。mRNA疫苗先驅BioNTech和Moderna領導的治療實體腫瘤的臨床試驗展示了個性化疫苗強大的抗腫瘤免疫功能［87］，開啟了治療性腫瘤疫苗的新紀元。為了進一步提高mRNA疫苗的抗癌效力，應當聯(lián)合使用特定佐劑、CPIs、T細胞激活單克隆抗體、調節(jié)腫瘤微環(huán)境（如細胞因子）或聯(lián)合放射治療或化療，以克服免疫逃逸機制以提高疫苗效力。目前有多項以評估m(xù)RNA疫苗與其他腫瘤療法的聯(lián)合應用療效的臨床試驗正在進行。這些臨床試驗有助于發(fā)現更安全、更高效的抗腫瘤療法，以提高腫瘤患者的生存質量。

綜上所述，mRNA是一種功能強大、用途廣泛的腫瘤疫苗治療方式，有望顯著提高腫瘤臨床治療效果。未來的研究應集中（但不限于）解決mRNA矛盾的免疫原性、設計先進和可耐受的遞送系統(tǒng)，來提高抗原表達和提呈的效率，以及優(yōu)化mRNA的結構以達到延長和控制表達持續(xù)時間的目的。此外，應繼續(xù)發(fā)展腫瘤個性化疫苗，提高患者的生存率和生活質量。