LncRNA SNHG12在惡性腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及臨床意義

邵穎穎，李 雙，何淑芬，李燦濤，丁少波，何瑞榮

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 東莞523059；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 臨床藥理研究所，湖南 長(zhǎng)沙410008)

惡性腦膠質(zhì)瘤是一種致死程度較高的惡性腦腫瘤，占成人原發(fā)性腦部腫瘤的80%[1]?，F(xiàn)有的治療手段主要以手術(shù)聯(lián)合放化療為主，雖然近年來(lái)此疾病的治療手段有了明顯提升，但是患者的預(yù)后仍不理想，中位生存時(shí)間只有14個(gè)月，五年內(nèi)的存活率小于5%[2-3]。因此，尋找到預(yù)后生物標(biāo)志物可以為此疾病的預(yù)后治療提供新的思路。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Lnc RNA)是一種長(zhǎng)度大于200nt的RNA分子，在細(xì)胞生長(zhǎng)分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、遷移侵襲、免疫反應(yīng)等多種生命活動(dòng)中均發(fā)揮重要作用[4]。其中，小核仁RNA宿主基因12(SNHG12)在多種癌癥中均有異常表達(dá)[5-10]，且在腦膠質(zhì)瘤中已有報(bào)道顯示其與此疾病病理分級(jí)、不良預(yù)后有關(guān)[11]，本研究結(jié)合公共生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中以及國(guó)內(nèi)醫(yī)院收集到的病例樣本信息，通過(guò)探討LncRNA SNHG12在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平，分析其是否可作為腦膠質(zhì)瘤預(yù)后良好指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)樣本數(shù)據(jù)收集根據(jù)研究目的與研究?jī)?nèi)容確定研究樣本的篩選標(biāo)準(zhǔn)為樣本數(shù)較大，至少大于50例且有正常對(duì)照組的數(shù)據(jù)集，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE4290數(shù)據(jù)集，對(duì)其中23例正常腦組織樣本(癲癇患者腦組織)和153例惡性腦膠質(zhì)瘤樣本中LncRNA SNHG12表達(dá)進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，同時(shí)，對(duì)從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的614例惡性腦膠質(zhì)瘤患者的LncRNA SNHG12表達(dá)進(jìn)行分析。并且，從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE4271數(shù)據(jù)集以及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載惡性腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理資料進(jìn)行整理，分析LncRNA SNHG12表達(dá)對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響。

1.2 臨床資料選取2007 年至 2013 年在湖南省中南大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院的91例Ⅰ-Ⅳ級(jí)惡性腦膠質(zhì)瘤患者和12例腦外傷患者或癲癇患者。本研究樣本采集獲得中南大學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室臨床藥理研究所獨(dú)立倫理委員會(huì)的倫理批件(CTXY-1300041-3)，患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1納入標(biāo)準(zhǔn) (1)2007年至2013年在湖南省中南大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院新診治為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，并經(jīng)該院神經(jīng)疾病病理科根據(jù)2007年版的膠質(zhì)瘤分級(jí)指南確診；(2)行根治性手術(shù)，術(shù)前未行任何放射性治療、化學(xué)藥物治療以及手術(shù)治療；(3)隨訪資料以及病例信息均完整；(4)患者知情并自愿同意參加本研究，簽署知情同意書。

1.3.2排除標(biāo)準(zhǔn) (1)復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤患者；(2)初次手術(shù)后行放射性治療、化學(xué)藥物治療以及手術(shù)治療的膠質(zhì)瘤患者；(3)死于除了腫瘤進(jìn)展病因之外原因的膠質(zhì)瘤患者；(4)病例信息或隨訪資料不完整。

1.4 隨訪采用門診或者電話的方式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為患者確診后的1-60個(gè)月，如果患者死亡隨訪時(shí)間結(jié)束。

1.5 主要試劑與儀器Trizol(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596018)；氯仿(批號(hào)：67-66-3)，異丙醇(批號(hào)：67-63-0)，乙醇(批號(hào)：64-17-5)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，批號(hào)：RR037A)；SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：C11744-100)；引物由上海博尚生物科技有限公司合成。核酸濃度測(cè)定儀Nanodrop 2000(美國(guó)Thermoscientific公司)；普通PCR擴(kuò)增儀AG6321(德國(guó)Eppendorf公司)；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(Roche LC480公司，瑞士)；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))。

1.6 方法

1.6.1RNA的提取 取腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織解凍后，超聲勻漿，加入1 ml Trizol試劑，充分混勻后室溫靜置10 min；加入200 μl氯仿上下顛倒10次并在振蕩器上振蕩15 s，靜置5 min待充分乳化或呈乳白色后在4℃，12 000 g離心15 min；小心吸取收集上層無(wú)色水相層于新的1.5 ml EP管中并加入500 μl異丙醇，上下顛倒10次充分混勻室溫靜置10 min后4℃，12 000 g離心15 min；輕輕倒去上清加入1 ml無(wú)水乙醇慢慢加至EP管中(注意勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒10次后4℃，12 000 g離心5 min，重復(fù)操作一次后棄去上清，置于室溫干燥15 min后加入合適量(約20 μl)DEPC水溶解RNA，待溶解完全后保存在-80℃超低溫冰箱中備用。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件(IBM,SPSS,Chicago,IL)進(jìn)行一般統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Student’st檢驗(yàn)比較腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織樣本間LncRNA SNHG12的表達(dá)水平。LncRNA SNHG12表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系采用皮爾遜卡方檢驗(yàn)或費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)法來(lái)比較計(jì)算總生存率。臨床病理特征變量和LncRNA SNHG12表達(dá)水平對(duì)總生存率的影響通過(guò)單變量和多變量分析進(jìn)行評(píng)估。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA SNHG12在腦膠質(zhì)瘤組織以及正常腦組織中的表達(dá)水平比較對(duì)從GSE4290和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示LncRNA SNHG12在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平明顯高于正常腦組織，且隨著腦膠質(zhì)瘤惡性程度的升高而升高，見圖1。采用qRT-PCR法對(duì)從湖南省湘雅醫(yī)院收集到的91例Ⅰ-Ⅳ 級(jí)惡性腦膠質(zhì)瘤組織和12例正常腦組織中LncRNA SNHG12的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，腦膠質(zhì)瘤組織中LncRNA SNHG12呈現(xiàn)高表達(dá)水平，且與數(shù)據(jù)庫(kù)中的樣本分析結(jié)果一致，也隨著膠質(zhì)瘤病理等級(jí)的升高而升高，見圖2。

圖1 LncRNA SNHG12在GSE4290和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)差異

圖2 LncRNA SNHG12在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)相關(guān)

2.2 LncRNA SNHG12表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系在對(duì)湘雅醫(yī)院收集的惡性腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病例資料進(jìn)行進(jìn)一步分析，以腦膠質(zhì)瘤患者LncRNA SNHG12表達(dá)水平均值為分界線，高于平均值為高表達(dá)，低于平均值為低表達(dá)。腦膠質(zhì)瘤組織中LncRNA SNHG12表達(dá)情況與患者年齡、性別、病灶位置無(wú)關(guān)(P值分別是0.437,0.580,0.203)，與患者病理分級(jí)有關(guān)(P<0.001)，見表2。

2.3 影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后因素的Cox回歸分析為評(píng)估LncRNA SNHG12表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后價(jià)值，進(jìn)一步對(duì)湘雅醫(yī)院收集的惡性腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病例資料進(jìn)行Cox模型多因素分析結(jié)果顯示LncRNA SNHG12過(guò)表達(dá)(HR=0.161,95% CI=0.083-0.312,P<0.001)，腫瘤分級(jí)(HR=0.381,95% CI:0.220-0.659,P=0.001)和病灶位置(枕骨vs.顳部)(HR=0.211,95% CI=0.048-0.928,P=0.039) 是影響腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的危險(xiǎn)因素。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析結(jié)果顯示，LncRNA SNHG12的表達(dá)水平(HR=0.173,95% CI=0.084-0.358,P<0.001)和腫瘤分級(jí)(HR=0.458,95% CI=0.242-0.868,P=0.017) 是影響腦膠質(zhì)瘤患者生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo) ，見表2。

表2 LncRNA SNHG12與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 LncRNA SNHG12表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系根據(jù)LncRNA SNHG12表達(dá)的中位數(shù)，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。結(jié)果顯示，在TCGA(圖3A)和GSE4271(圖3B)數(shù)據(jù)集中，LncRNA SNHG12的高表達(dá)均與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后生存不佳相關(guān)。為了進(jìn)一步評(píng)估驗(yàn)證這一結(jié)果，對(duì)湘雅醫(yī)院收集的91例病人樣本進(jìn)行同樣的分析，結(jié)果顯示與前述數(shù)據(jù)庫(kù)中分析結(jié)果一致，腦膠質(zhì)瘤患者中LncRNA SNHG12高表達(dá)者的總存活率顯著低于低表達(dá)患者的總存活率(HR=1.984,95% CI=0.809-4.865,P<0.0001)(圖3C)。

圖3 LncRNA SNHG12在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)和識(shí)別用于診斷、治療和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物已成為改善癌癥患者生存狀態(tài)不佳的重要途徑。越來(lái)越多的證據(jù)表明，LncRNA參與了多種生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、周期調(diào)控、凋亡以及癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[12]。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的LncRNA被鑒定為癌癥患者的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。腦膠質(zhì)瘤作為一種5年生存率極低的惡性腫瘤，迫切需要新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[13]。

研究表明，LncRNA在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14-16]。Ruan W.等闡明了LncRNA SNHG12通過(guò)誘導(dǎo)AMOT基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移[17]。Lan等發(fā)現(xiàn)LncSNHG12在肝癌細(xì)胞中可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-199 a/b-5p而間接影響NF-κB通路來(lái)調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡和遷移[18]。在結(jié)直腸癌中，上調(diào)的LncRNA SNHG12可以通過(guò)抑制癌細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展[19]。近年來(lái)，在腦膠質(zhì)瘤的研究中雖已有報(bào)道顯示LncRNA SNHG12與此疾病病理分級(jí)、不良預(yù)后有關(guān)[20]，本研究通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中以及從湘雅醫(yī)院收集到的患者病例資料信息以及qRT-PCR檢測(cè)LncRNA SNHG12表達(dá)水平進(jìn)行分析，在不同人種不同國(guó)家地區(qū)來(lái)源的惡性腦膠質(zhì)瘤患者中LncRNA SNHG12的表達(dá)水平顯著高于正常腦組織，且在高級(jí)別病理分級(jí)的惡性腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于低級(jí)別(P<0.05)；且LncRNA SNHG12高表達(dá)的惡性腦膠質(zhì)瘤患者的總存活率顯著低于低表達(dá)患者(HR=1.984,95% CI=0.809-4.865,P<0.0001)。在對(duì)湘雅醫(yī)院收集的惡性腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病例資料進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在惡性腦膠質(zhì)瘤組織中LncRNA SNHG12的表達(dá)情況與患者年齡、性別以及病灶位置無(wú)關(guān)(P值分別是0.437,0.580,0.203)，與患者的腫瘤病理分級(jí)有關(guān)(Ⅰ-Ⅱ級(jí) vs.Ⅲ-Ⅳ級(jí),P<0.0001)；Cox模型多因素分析結(jié)果顯示，患者的腫瘤病理分級(jí)是影響惡性腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=0.173,95% CI=0.084-0.358,P<0.001)。因此，結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫(kù)樣本以及醫(yī)院收集的臨床樣本信息，對(duì)國(guó)內(nèi)外患者進(jìn)行統(tǒng)一分析后認(rèn)為L(zhǎng)ncRNA SNHG12可能成為膠質(zhì)瘤患者潛在預(yù)后療效的生物標(biāo)志物且不受人種地域等條件的限制，具有普適性。