板藍(lán)根顆粒需氧菌總數(shù)測(cè)定不確定度分析

劉文杰，井良義，郝運(yùn)偉，王 君，牛振東

（北京市藥品檢驗(yàn)研究院·中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

需氧菌總數(shù)是2020年版《中國(guó)藥典》中非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查項(xiàng)目，也是評(píng)價(jià)藥品安全性的重要指標(biāo)，可反映藥品生產(chǎn)過(guò)程中是否符合生產(chǎn)要求［1-3］。微生物限度檢查結(jié)果受到樣品中微生物分布均勻，樣品稱量、制備過(guò)程，不同檢驗(yàn)人員操作手法等因素的影響。測(cè)定不確定度是表征賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)［4-5］，由若干分量構(gòu)成，可通過(guò)不確定度的A類和B類評(píng)定，用標(biāo)準(zhǔn)偏差表征。實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證認(rèn)可明確要求，可采取多方式對(duì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室有數(shù)值要求的參數(shù)進(jìn)行不確定度評(píng)估，以保證檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性［6］。為實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)對(duì)檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室提出了應(yīng)做測(cè)定不確定度的要求［7-8］。本研究中參考2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1105，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF1059.1-2012）對(duì)藥品微生物限度檢查項(xiàng)目中的需氧菌總數(shù)進(jìn)行A類和B類不確定度評(píng)定，建立本實(shí)驗(yàn)室微生物不確定度評(píng)定方法，提高檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，查找試驗(yàn)過(guò)程的關(guān)鍵操作點(diǎn)，為更好地指導(dǎo)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢驗(yàn)檢測(cè)工作，以及建立同類制劑檢測(cè)的測(cè)量不確定度評(píng)定方法提供依據(jù)［9］?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DL-CJ-2ND型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；1300 SERIES A2型生物安全柜、DLHPQ200型恒溫?fù)u床（美國(guó)Thermo Scientific公司）；LRH-250型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；BIST-A-D型電熱脈動(dòng)真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；ME1002T型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

板藍(lán)根顆粒（廠家A，規(guī)格為每袋5 g）；pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為20201010）；胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養(yǎng)基（批號(hào)為8053765）、沙氏瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為815577），均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

供試液：取樣品10 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液定容，搖勻，使樣品分散均勻，制成供試液Ⅰ。精密量取10 mL，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL，混勻，即得供試液Ⅱ。

供試品組供試液：取供試液Ⅰ10 mL，加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，混勻，即得。

菌液組供試液：取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL，加入制備好的試驗(yàn)菌液0.1 mL（300～1 000 cfu），混勻，制成每1 mL稀釋液中含菌量30～100 cfu的菌液。

試驗(yàn)組供試液：分別取供試液Ⅰ10 mL和制備好的試驗(yàn)菌液0.1 mL，混勻，即得。

2.2 需氧菌培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

取供試液Ⅱ，逐級(jí)（10倍）稀釋，每個(gè)稀釋級(jí)各取1 mL至平皿，平行2個(gè)平皿，傾注TSA培養(yǎng)基適量，33℃培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)。另取pH 7.0無(wú)菌氧化鈉-蛋白凍緩沖液1 mL至平皿，作為陰性對(duì)照，平行2個(gè)平皿，由同一名人員操作。由公式A=KX/V計(jì)算需氧菌總數(shù)，其中，K為稀釋倍數(shù)，X為進(jìn)入TSA培養(yǎng)基的2個(gè)平皿平均菌落數(shù)，V為該稀釋級(jí)下的取樣體積，一般V取1 mL，單位為cfu/g。

2.3 不確定度來(lái)源分析

回顧整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)影響檢測(cè)結(jié)果不確定度的主要因素有樣品均勻性、檢測(cè)人員的不同，以及取樣重復(fù)性，在稱量過(guò)程中天平的使用，樣品稀釋過(guò)程中量筒和吸管的使用。本研究中主要對(duì)后三者引入的不確定度進(jìn)行評(píng)定。

2.4 方法學(xué)考察

試驗(yàn)分為供試品組、菌液組和試驗(yàn)組，分別以2.1項(xiàng)下相應(yīng)供試液處理，每組均平行3個(gè)平皿，除霉菌和酵母菌以沙氏瓊脂培養(yǎng)基于33℃下培養(yǎng)5 d外，其余菌種均以TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，采用平皿法計(jì)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 不確定度分量評(píng)定

2.5.1 A類不確定度評(píng)定

對(duì)重復(fù)性測(cè)量的不確定度進(jìn)行評(píng)定。需氧菌總數(shù)檢測(cè)中有同一人對(duì)同一個(gè)樣品按照藥典規(guī)定進(jìn)行操作，數(shù)據(jù)的發(fā)散性較大，故對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)取對(duì)數(shù)再進(jìn)行計(jì)算。采用極差法評(píng)定重復(fù)測(cè)量的不確定度，對(duì)20份注入TSA培養(yǎng)基的供試液Ⅰ的重復(fù)2次檢驗(yàn)結(jié)果取對(duì)數(shù)，計(jì)算結(jié)果的均值和殘差平方和，結(jié)果見(jiàn)表2。計(jì)算合并標(biāo)準(zhǔn)偏差為

表1 方法適用性考察結(jié)果Tab.1 Investigation results of the applicability of the method

2.5.2 B類不確定度評(píng)定

樣品稱量引入不確定度：采用電子天平稱取樣品，電子天平的分度值為0.01 g，最大量程為1 200 g，檢定分度值為0.1 g，根據(jù)JJG1036-2008標(biāo)準(zhǔn)中電子天平檢定規(guī)程，電子天平的允許誤差為±0.1 g，天平最大允許誤差（MPE）認(rèn)為矩形均勻分布，樣品由二次稱量完成。標(biāo)準(zhǔn)不確定度Um=0.1/3=0.057 7，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（m）=Um/m=0.057 7/10=0.005 8。

表2 檢驗(yàn)結(jié)果及分析Tab.2 Testing results and analysis

樣品稀釋引入不確定度：取樣品適量用量筒加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL，置100 mL容量瓶中，定容，混勻，制成1∶10（m/V）稀釋液。用校準(zhǔn)級(jí)別為A級(jí)的10 mL吸管吸取9 mL pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，用校準(zhǔn)級(jí)別為A級(jí)的1 mL吸管取1 mL（1∶10，m/V）至9 mL pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中制成1∶100（m/V）稀釋液，依此類推。稀釋過(guò)程引起的相對(duì)不確定度見(jiàn)表3。

表3 稀釋過(guò)程引入的相對(duì)不確定度Tab.3 Relative uncertainty induced by dilution process

2.5.3 合成不確定度評(píng)定

2.5.4 擴(kuò)展不確定度評(píng)定

本研究中考察了20組測(cè)量結(jié)果，置信區(qū)間（CI）為95%，自由度（df）為19.00，查t0.025分布表可知K=2.093，故擴(kuò)展不確定度為，U=KUc（lgX）=2.093×0.044 0=0.092 1。

2.6 需氧菌計(jì)數(shù)結(jié)果

本研究中需氧菌總數(shù)（Y）為，Y=lgX±U=（2.696 8±0.092 1）cfu/g，即2.604 8≤Y≤2.788 9。取反對(duì)數(shù)，95%CI時(shí)20份樣品需氧菌總數(shù)為402～615 cfu/g。任一樣品的需氧菌總數(shù)均可根據(jù)Y=lgX±0.092 1估算，如第一個(gè)樣品，2.761 4±0.092 1，取反對(duì)數(shù)為需氧菌總數(shù)為466～713 cfu/g。

3 討論

對(duì)于檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)，測(cè)量結(jié)果不確定度評(píng)定既是《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（CNAS-CL01）的要求，又是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量評(píng)價(jià)與改進(jìn)的重要參考，也是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性的重要保障。近年來(lái)在食品領(lǐng)域菌落總數(shù)定量檢測(cè)均有測(cè)量不確定度的報(bào)道，藥品領(lǐng)域也有一定報(bào)道。呂婷婷等［10］對(duì)板藍(lán)根顆粒霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行了不確定度的評(píng)定。王娟等［11］對(duì)荊防顆粒需氧菌總數(shù)的不確定度進(jìn)行了考察。需氧菌總數(shù)作為微生物限度檢查項(xiàng)目之一，是保障藥品安全的重要指標(biāo)。本研究中建立了板藍(lán)根顆粒需氧菌總數(shù)的不確定度分析方法，可以為實(shí)驗(yàn)室同劑型制劑的相關(guān)檢測(cè)提供參考。

本研究中列出了天平、量筒和吸管等引入不確定度分量，基于培養(yǎng)基、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)條件、實(shí)驗(yàn)室溫濕度等引入的不確定度不易量化［12］，對(duì)合成不確定度的貢獻(xiàn)較小，可以通過(guò)規(guī)范實(shí)驗(yàn)室操作，制訂相應(yīng)的作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控，強(qiáng)化人員培訓(xùn)等減少這些不確定度因素的引入［13］。

雖然當(dāng)前不確定度評(píng)定技術(shù)在微生物檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用較少，隨著檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)不確定度評(píng)定認(rèn)識(shí)的加深，在對(duì)微生物檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定時(shí)將會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用。通過(guò)對(duì)藥品需氧菌總數(shù)測(cè)定不確定度的評(píng)價(jià)能客觀地反映實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的可靠性和有效性，降低誤判概率，從而減少檢測(cè)機(jī)構(gòu)的風(fēng)險(xiǎn)。