B7H3和c-Cbl基因在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)水平及臨床意義*

王 玨，徐桂珍，熊暮珺

湖南省郴州市第一人民醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科；2.血液內(nèi)科，湖南郴州 423000

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種以漿細(xì)胞異常增殖為特征的惡性血液系統(tǒng)疾病，其異質(zhì)性較強(qiáng)，且治愈困難、復(fù)發(fā)率較高，嚴(yán)重威脅患者生命安全[1]。MM能夠在血液或尿液中生成大量的單克隆免疫球蛋白，從而導(dǎo)致貧血、骨質(zhì)破壞及腎衰竭等[1]。因此，高效準(zhǔn)確地評估患者預(yù)后情況是目前臨床亟待解決的熱點(diǎn)問題。共刺激因子B7 同源體3(B7H3)是B7家族的新成員，定位于人15號染色體，廣泛存在于脾臟和胸腺等淋巴器官中，能夠介導(dǎo)抗原遞呈、調(diào)控T細(xì)胞增殖及啟動細(xì)胞免疫等過程[2]。有研究表明，抑制B7H3表達(dá)能夠使套細(xì)胞淋巴瘤的腫瘤細(xì)胞周期處于G0/G1期，同時抑制免疫組織化學(xué)指標(biāo)Ki-67表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的快速增殖[2]。泛素連接酶c(c-Cbl)是一種泛素蛋白酶體，定位于人染色體11q23.3，能夠在真核細(xì)胞內(nèi)特異性結(jié)合底物蛋白，使其泛素化降解，對酪氨酸激酶及其受體具有重要的調(diào)控作用[3]。有研究表明，在急性髓細(xì)胞白血病中，c-Cbl編碼基因的多個位點(diǎn)發(fā)生突變，使其轉(zhuǎn)錄受到抑制，導(dǎo)致T 細(xì)胞受體(TCR)及B細(xì)胞受體(BCR)功能異常，使其抑制白血病進(jìn)展的能力減弱[4]。目前，B7H3、c-Cbl與MM的研究較少，且二者對MM患者預(yù)后的評估能力尚不清楚。因此，本研究旨在探討B(tài)7H3和c-Cbl在MM中的表達(dá)水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2017年1月至2018年9月收治的92例MM患者納入MM組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2015年修訂)》[5]中的診斷準(zhǔn)則；(2)均經(jīng)骨髓穿刺活檢確診；(3)均為首次確診，既往無放化療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤(如淋巴瘤、肺癌及肝癌等)；(2)合并其他血液系統(tǒng)疾病，如再生障礙性貧血、特發(fā)性血小板減少癥及巨幼細(xì)胞性貧血等；(3)先天性免疫系統(tǒng)異常；(4)對硼替佐米和地塞米松過敏；(5)肝腎功能異常；(6)臨床資料缺失或不全。另選取90例同期同年齡層來本院體檢的健康者納入對照組。MM組中男50例，女42例；年齡52～70歲，平均(61.06±7.29)歲；高分化50例，中分化30例，低分化12例；有貧血71例，無貧血21例；有高鈣血癥60例，無高鈣血癥32例；國際分期系統(tǒng)(ISS)分期[6]：Ⅰ期49例，Ⅱ期35例，Ⅲ期8例。對照組中男47例，女43例；年齡50～69歲，平均(61.25±7.08)歲。所有研究對象均自愿加入本研究，且簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 采集所有研究對象外周靜脈血10 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，通過離心機(jī)(山東博科科學(xué)儀器有限公司；型號：TD-6M)離心5 min，條件為6 000 r/min，取其上清液置于試管中，在-80 ℃冰箱中保存。采用Trizol試劑(Invitrogen公司，批號：20161226)提取總RNA，嚴(yán)格遵循試劑盒的操作規(guī)定。將提取的總RNA滴入20 μL無核糖核酸酶的水中溶解，通過紫外分光光度儀(美國Promega公司)檢測A260和A280，計算其RNA的純度和濃度，選取A260/A280為1.8～2.0的標(biāo)本用于后續(xù)試驗(yàn)。采用HG TaqMan miRNA試劑盒(新?；驒z測有限公司，批號：20161230)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。B7H3 mRNA和c-Cbl mRNA的反轉(zhuǎn)錄條件均為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測B7H3 mRNA和c-Cbl mRNA的表達(dá)水平。通過SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(Qiagen公司，批號：20161221)測定二者的表達(dá)水平，嚴(yán)格遵循操作流程。PCR 擴(kuò)增體系：SYBR Premix 10.0 μL、cDNA樣品3.0 μL、ddH2O 5.0 μL、正向引物1.0 μL及反向引物1.0 μL，共計20.0 μL。B7H3 mRNA的正向引物序列為5′-GCTCCACTCCACTCAGCCAGTAC-3′；反向引物序列為5′-GCTCATCTTTGCCTTCTT-3′。內(nèi)參基因GAPDH的正向引物序列為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；反向引物序列為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。c-Cbl mRNA的正向引物序列為5′-GCCCATTAGTAGGTCCAGAGTG-3′；反向引物序列為5′-GATGTATCCAAAGGCCGTA GAG-3′。內(nèi)參基因U6的正向引物序列為5′-GAATCCTGATCTGACTGGCTTATG-3′；反向引物序列為5′-GCTGCGGCAGAAGGTCAAGT-3′。B7H3 mRNA和c-Cbl mRNA的PCR反應(yīng)條件均為預(yù)變性95 ℃ 20 s、變性95 ℃ 20 s、退火60 ℃ 30 s、延伸70 ℃ 5 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。每份標(biāo)本設(shè)置3個復(fù)孔。引物序列由蘇州瑞博生物技術(shù)股份有限公司合成。以Ct值法檢測B7H3 mRNA和c-Cbl mRNA的相對表達(dá)水平，相對于GAPDH和U6的比值為2—ΔΔCt，以ΔCt值為結(jié)果，其中ΔCt=Ct目的基因— Ct內(nèi)參基因。

1.3治療方法 MM患者均采用硼替佐米(西安楊森制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：J20160071)聯(lián)合地塞米松(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字：H44024469)及沙利度胺(常州制藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字：H32026130)的化療方案[7]。以21 d為1個療程，在第1、4、8、11天采用硼替佐米，劑量為1.3 mg/m2。沙利度胺每日服用100 mg，地塞米松每個療程應(yīng)用總量為80～160 mg，口服，按平均每天每次劑量應(yīng)用，具體每天每次劑量視患者具體情況而定。共計治療6個療程。采用國際骨髓瘤工作組制定的療效標(biāo)準(zhǔn)評估療效[8]，療效分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定及無效?？傆行?(完全緩解例數(shù)+部分緩解例數(shù))/總例數(shù)×100%。所有患者隨訪觀察1～36個月，隨訪時間2017年1月至2021年9月，隨訪期間無失訪病例。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清B7H3和c-Cbl表達(dá)水平比較 MM組血清B7H3表達(dá)水平較對照組升高，而c-Cbl表達(dá)水平較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清B7H3和c-Cbl表達(dá)水平比較

2.2MM患者血清B7H3與c-Cbl表達(dá)水平的相關(guān)性 MM患者血清B7H3表達(dá)水平與c-Cbl表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.818，P<0.05)。

2.3不同特征MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較 不同分化程度和ISS分期MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同年齡、性別MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。有貧血、有高鈣血癥與無貧血、無高鈣血癥MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同特征MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較

續(xù)表2 不同特征MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較

2.4B7H3、c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者一般資料比較 以MM患者血清B7H3表達(dá)水平的中位數(shù)3.53為臨界值，大于該值為B7H3高表達(dá)組，反之則為B7H3低表達(dá)組。以c-Cbl表達(dá)水平的中位數(shù)0.72為臨界值，大于該值為c-Cbl高表達(dá)組，反之則為c-Cbl低表達(dá)組。B7H3、c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3、表4。

表3 B7H3高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者一般資料比較或n(%)]

表4 c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者一般資料比較或n(%)]

2.5B7H3、c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者治療有效率比較 B7H3高表達(dá)組治療有效率較B7H3低表達(dá)組降低，而c-Cbl高表達(dá)組治療有效率較c-Cbl低表達(dá)組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.464，P=0.035；χ2=4.234，P=0.040)。見表5、表6。

表5 B7H3高表達(dá)組和低表達(dá)組治療有效率比較[n(%)]

表6 c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組治療有效率比較[n(%)]

2.6B7H3、c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者生存情況比較 B7H3高表達(dá)組3年總生存率為37.78%(17/45)， B7H3低表達(dá)組3年總生存率為61.70%(29/47)，B7H3高表達(dá)組3年總生存率較B7H3低表達(dá)組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.778，P=0.029)。c-Cbl高表達(dá)組3年總生存率為60.42%(29/48)，c-Cbl低表達(dá)組3年總生存率為36.36%(16/44)，c-Cbl高表達(dá)組3年總生存率較c-Cbl低表達(dá)組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.757，P=0.016)。見圖1。

注：A為B7H3高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者生存曲線；B為c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者生存曲線。

2.7Cox回歸模型分析MM患者預(yù)后的影響因素 Cox回歸分析結(jié)果顯示，ISS分期為Ⅱ、Ⅲ期，分化程度為中、高分化，B7H3≥3.52及c-Cbl≤0.73是影響MM患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P<0.05)。見表7。

表7 Cox回歸模型分析MM患者預(yù)后的影響因素

3 討 論

據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計，我國MM發(fā)病率為3/100 000，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中位居第二位[1]。盡管烷基化劑、腸溶酶制劑及蛋白酶體抑制劑等新型治療方案在一定程度上延長了患者的生存時間，但MM仍無法完全治愈[1]。因此，尋找合適的指標(biāo)早期評估MM患者的預(yù)后情況，對臨床進(jìn)行針對性治療至關(guān)重要。

B7H3基因編碼的B7H3蛋白屬于Ⅰ型跨膜蛋白，主要位于抗原遞呈細(xì)胞、T細(xì)胞及靶細(xì)胞內(nèi)，包含兩種同分異構(gòu)體，在輔助免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[2]。B7H3通過共刺激信號，輔助免疫細(xì)胞識別抗原，同時增強(qiáng)T細(xì)胞的黏附能力，加強(qiáng)抗原遞呈作用[2]。基礎(chǔ)研究表明，在B7H3基因表達(dá)沉默的癌細(xì)胞內(nèi)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9和轉(zhuǎn)錄激活因子3等轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄合成水平明顯下降，使癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力降低[9]。AHMED等[10]研究證實(shí)，小分子抑制劑通過結(jié)合B7H3中的FG 環(huán)結(jié)構(gòu)域，使免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的配體-受體相互作用減弱，從而恢復(fù)免疫細(xì)胞原有的效應(yīng)器功能。本研究結(jié)果表明，MM組血清B7H3表達(dá)水平較對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示B7H3可能在MM發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。其原因可能為MM患者骨髓微環(huán)境的改變誘導(dǎo)B7H3啟動子的活化，復(fù)制轉(zhuǎn)錄合成B7H3并釋放入血，使血清B7H3表達(dá)水平升高[9]。本研究結(jié)果表明， 不同分化程度和ISS分期MM患者血清B7H3表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示B7H3可能在MM進(jìn)展過程中具有促進(jìn)作用。其機(jī)制可能是B7H3能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1和核因子κB，抑制T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)錄，從而抑制T細(xì)胞啟動細(xì)胞免疫應(yīng)答，使癌細(xì)胞在血液中快速克隆增殖[11]。此外，B7H3過表達(dá)能夠抑制E-鈣粘連蛋白的轉(zhuǎn)錄合成，同時增強(qiáng)癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，有利于癌細(xì)胞侵襲至其他器官[12]。

c-Cbl基因?qū)儆贑BL家族，其全長約為11 242 bp，僅存在一種剪切方式，主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在造血組織中廣泛表達(dá)[3]。c-Cbl主要包含TKB結(jié)構(gòu)域和RF結(jié)構(gòu)域，具有調(diào)節(jié)泛素連接酶活性和結(jié)合磷酸酪氨酸殘基的功能[13]。RASHID等[4]通過基因測序發(fā)現(xiàn)，急性髓系白血病(AML)患者c-Cbl基因的RF結(jié)構(gòu)域中的谷氨酸錯義突變?yōu)楦拾彼?，c-Cbl外顯子處存在多處突變位點(diǎn)是AML發(fā)病的遺傳易感因素。有研究表明，c-Cbl能夠結(jié)合表皮生長因子受體酪氨酸殘基位點(diǎn)，經(jīng)磷酸化使其形成非對稱聚合物，最終通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)完成泛素化過程，使癌細(xì)胞的增殖速度降低[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MM組血清c-Cbl表達(dá)水平較對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示c-Cbl可能在MM發(fā)病的某個環(huán)節(jié)具有調(diào)控作用。其原因可能是MM患者血清c-Cbl基因發(fā)生甲基化，使c-Cbl沉默，無法進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致血清c-Cbl表達(dá)水平下降[13]。本研究結(jié)果表明，不同分化程度和ISS分期MM患者血清c-Cbl表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示c-Cbl可能參與MM進(jìn)展的調(diào)控。其原因可能是c-Cbl表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)生長因子受體結(jié)合蛋白2與干細(xì)胞因子(SCF)受體結(jié)合，使SCF受體泛素化，誘導(dǎo)干細(xì)胞無限單克隆分裂增殖，促進(jìn)MM進(jìn)展[14]。此外，c-Cbl沉默能夠誘導(dǎo)FMS樣酪氨酸激酶3磷酸化，激活其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5信號通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖及分化，并抑制機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，使MM易于免疫逃避，同時增強(qiáng)其侵襲能力[15]。

本研究結(jié)果顯示，MM患者血清B7H3表達(dá)水平與c-Cbl表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示B7H3和c-Cbl在MM的發(fā)生和發(fā)展過程中可能具有一定聯(lián)系。上述結(jié)果的具體機(jī)制目前尚不清楚，但可能與c-Cbl通過氧化還原反應(yīng)使自身磷酸化，激活蛋白激酶B信號通路，通過正反饋?zhàn)饔?，誘導(dǎo)B7H3上調(diào)有關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，B7H3高表達(dá)組治療有效率較B7H3低表達(dá)組降低，而c-Cbl高表達(dá)組治療有效率較c-Cbl低表達(dá)組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示B7H3高表達(dá)和c-Cbl低表達(dá)能夠促進(jìn)MM的演化，降低治療有效率。其原因可能是B7H3高表達(dá)能夠使其受體髓樣細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2 失活，抑制CD8和CD4合成，降低機(jī)體中CD8+和CD4+T細(xì)胞的比例，減弱機(jī)體的免疫能力，促進(jìn)MM的進(jìn)展，降低藥物治療的有效率[16]。磷酸化的c-Cbl通過其酪氨酸殘基結(jié)合磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的SH2 結(jié)構(gòu)域，激活PI3K信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖分裂，降低治療有效率[8,15]。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，B7H3水平升高和c-Cbl水平降低時MM患者生存率更低，提示B7H3和c-Cbl表達(dá)水平可能影響MM患者的預(yù)后生存周期。Cox回歸分析進(jìn)一步證明， B7H3及c-Cbl表達(dá)水平可能是預(yù)測MM患者預(yù)后生存時間的潛在標(biāo)志物。

綜上所述，MM患者血清B7H3水平升高，而c-Cbl水平降低，且均與分化程度和ISS分期有關(guān)。血清B7H3表達(dá)水平與c-Cbl表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。B7H3水平升高和c-Cbl水平降低時，不僅降低了MM患者的治療有效率，更降低了患者的生存率，這對臨床進(jìn)行針對性干預(yù)治療具有重要指導(dǎo)意義。但受本研究條件的限制，血清B7H3和c-Cbl水平變化的具體機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。