miRNA在膿毒癥病原微生物診斷中的研究進展*

孫文杰，張國安，楊曉暉 綜述，劉英富,2△ 審校

1.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州 061000；2.滄州市納米抗體技術(shù)創(chuàng)新中心，河北滄州 061000

最新國際共識對膿毒癥的定義為機體對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙性疾病[1]。膿毒癥是一個全球性公共衛(wèi)生問題，是感染導(dǎo)致死亡的主要原因。膿毒癥每年新增病例高達(dá)1 900萬，病死率大于25%[2]，據(jù)統(tǒng)計約一半的病死率是由繼發(fā)性感染引起的[3]。膿毒癥確診后應(yīng)盡快啟動抗菌藥物治療，每延遲1 h，病死率就會明顯升高[4]。近年來，抗菌藥物的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性問題愈演愈烈，抗菌藥物的合理使用急需臨床早期快速的膿毒癥診斷和病原學(xué)檢測。膿毒癥的病原微生物90%以上為細(xì)菌[5]，除此之外還有真菌、病毒及其他微生物。長期以來，通過血培養(yǎng)技術(shù)檢測到病原微生物被視為診斷膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)[6]，但其臨床應(yīng)用仍存在培養(yǎng)周期長、工作量大、靈敏度低、有假陰性風(fēng)險等缺點。目前常用的膿毒癥生物學(xué)診斷指標(biāo)有降鈣素原、可溶性CD14亞型、C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6、脂多糖結(jié)合蛋白等，均存在特異性有限，且無法提供致病微生物信息的缺點。正常情況下，小分子RNA(miRNA)在人體液中保持穩(wěn)定，而疾病狀態(tài)下miRNA呈現(xiàn)出差異性表達(dá)的特點，這對膿毒癥的診斷具有重要意義。近年來，miR-25、miR-122、miR-133a、miR-150、miR-233等[7]在膿毒癥的生物標(biāo)志物研究領(lǐng)域均取得了一定進展。通過miRNA檢測感染微生物的類型，提高膿毒癥診斷的特異性，從而改善膿毒癥的診療策略，具有重要研究意義和臨床價值。

1 miRNA的特征

miRNA是一類由21～25個核苷酸組成的小分子非編碼RNA，主要通過靶向mRNA抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯或降解mRNA，使基因沉默發(fā)揮調(diào)控作用[8]。也有少部分miRNA能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或上調(diào)蛋白的表達(dá)[9]。miRNA在生物體中廣泛存在，至今已被發(fā)現(xiàn)有高達(dá)數(shù)萬種，僅人類基因組中就已發(fā)現(xiàn)2 000～3 000種miRNA。miRNA在細(xì)胞質(zhì)中合成，然后通過核糖體蛋白復(fù)合物、細(xì)脂質(zhì)囊泡、外泌體等形式釋放到細(xì)胞外，不被RNA酶消化，在血漿、血清、尿液、唾液、精液等體液中可穩(wěn)定存在[10]。循環(huán)miRNA具有穩(wěn)定性高、特異性強、化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單、無轉(zhuǎn)錄后修飾、易獲得、可反復(fù)凍融和長期保存、便于快速檢測等優(yōu)點[10]，在疾病診斷方面具有成為理想生物標(biāo)志物的潛力。miRNA以囊泡轉(zhuǎn)運或蛋白載體機制被細(xì)胞輸出或輸入，介導(dǎo)不同組織間的通訊，從而調(diào)節(jié)遠(yuǎn)端細(xì)胞功能，參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過程的發(fā)生和發(fā)展。

2 miRNA與膿毒癥相關(guān)的生物學(xué)功能

膿毒癥的發(fā)病機制復(fù)雜且尚不明確，除了病原微生物及其毒素的直接損傷作用外，感染還能夠?qū)е聶C體處于炎癥激活和免疫功能紊亂狀態(tài)，進而發(fā)展為器官功能障礙，以致危及生命。微生物感染主要通過宿主Toll樣受體(TLR)識別革蘭陰性菌(GNB)的脂多糖(LPS)或革蘭陽性菌(GPB)的脂磷壁酸(LTA)兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑觸發(fā)病原體與宿主之間復(fù)雜的相互作用。病原體刺激機體后，miRNA異常表達(dá)，通過介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞調(diào)控基因表達(dá)，從而調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，對炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及器官組織損傷等發(fā)揮調(diào)控作用。生物體內(nèi)存在多種miRNA，能夠廣泛參與各種細(xì)胞的活動，涉及多條信號通路。有研究報道顯示，在膿毒癥中miR-181a對TLR信號傳導(dǎo)通路起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，并且能夠調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生[11]。miR-125b可調(diào)節(jié)膿毒癥中內(nèi)皮細(xì)胞的功能和血管屏障作用，從而減輕組織器官損傷[12]。miR-146和miR-125通過參與膿毒癥先天免疫應(yīng)答信號的調(diào)節(jié)，調(diào)控炎癥反應(yīng)及機體的抗感染功能[13]。在膿毒癥中miR-31表達(dá)下調(diào)，可促進CD4+T淋巴細(xì)胞向Th2表型轉(zhuǎn)化，從而促進其從高炎癥狀態(tài)到免疫抑制狀態(tài)的轉(zhuǎn)變[14]。所以，膿毒癥發(fā)生和發(fā)展的各個階段幾乎都涉及miRNA的調(diào)控作用。

3 miRNA可作為膿毒癥診斷的生物標(biāo)志物

膿毒癥的非特異性臨床表現(xiàn)導(dǎo)致診斷延遲一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點問題。正常生理條件下，miRNA在人外周循環(huán)中保持穩(wěn)定，而在膿毒癥患者體液中呈現(xiàn)差異性表達(dá)，因此，檢測患者體液中miRNA水平可起到預(yù)測或診斷膿毒癥的作用。近年來有研究證實，miRNA可作為膿毒癥的潛在生物標(biāo)志物[7]，還可特異性檢測膿毒癥導(dǎo)致的臟器損傷[15]，區(qū)分膿毒癥的嚴(yán)重程度[7]，以及鑒別感染的病原微生物類型[16-18]。通過miRNA檢測病原菌類型，聯(lián)合其他生物學(xué)指標(biāo)，可提高膿毒癥診斷的特異性，為膿毒癥早期抗感染策略提供依據(jù)。

3.1miRNA與GNB性膿毒癥的診斷 導(dǎo)致膿毒癥的常見GNB包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等。近年來，已發(fā)現(xiàn)多種miRNA在GNB感染致膿毒癥中的差異性表達(dá)。在不同GNB(大腸埃希菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌、沙門菌、沙雷菌)來源的LPS誘導(dǎo)小鼠感染模型中均檢出了let-7d、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107和miR-451這8種miRNA特異性差異表達(dá)，可能是LPS感染的潛在標(biāo)志物。在細(xì)菌感染與盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)致膿毒癥模型的對比研究中，大腸埃希菌組中有l(wèi)et-7i/7d、miR-16、miR-20a、miR-26a/26b、miR-106a/106b、miR-451等在24 h內(nèi)表達(dá)上調(diào)2倍以上，且CLP致膿毒癥以GNB感染為主[16]。在GNB感染泌尿系統(tǒng)的膿毒癥患者中，miRNA-150和let-7a表達(dá)水平明顯降低，可能是GNB感染泌尿系統(tǒng)致膿毒癥的潛在生物標(biāo)志物[17]。在大腸埃希菌、類鼻疽菌、土拉桿菌感染的人外周血單核細(xì)胞模型中，miR-30-5p均出現(xiàn)顯著性差異表達(dá)[18]，也可能是GNB感染的潛在標(biāo)志物。此外，還有些miRNA在特定GNB感染中呈差異性表達(dá)，可能與其特異性感染相關(guān)。在大腸埃希菌感染牛乳腺上皮細(xì)胞中的miRNA分析表明，miR-18、miR-24-3p、miR-148、miR-486、let-7a-5P具有大腸埃希菌特異性[19]。綠膿桿菌感染會引起miR-302b、miR-301b、miRNA-155、let-7、miRNA-233等表達(dá)變化，其中miR-301b可作為靶點調(diào)控感染引起的炎癥反應(yīng)和先天免疫應(yīng)答[20]。布魯菌感染會引起let-7b、miR-92a、miR-93、miR-181b、miR-1981水平明顯變化[21]。在沙門菌感染情況下，miRNA-146的表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，而且在先天免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[22]。不同GNB感染致膿毒癥可能存在共同的生物標(biāo)志物，如let-7a/7d、miR-16、miR-150、miR-30-5p等，而不同的GNB感染還可能具有其特異性的生物標(biāo)志物，尚需研究加以驗證。

3.2miRNA與GPB性膿毒癥的診斷 GPB致膿毒癥以金黃色葡萄球菌(SA)、腸球菌、表皮葡萄球菌等為主，而miRNA作為其生物標(biāo)志物的研究也取得了一定進展。在枯草桿菌、糞鏈球菌和SA來源的LTA分別誘導(dǎo)小鼠感染模型的對比研究發(fā)現(xiàn)，miR-451、miR-668、miR-1902和miR-1904表達(dá)均明顯上調(diào)，并且呈劑量和時間依賴性，可能成為LTA感染的潛在生物標(biāo)志物[23]。WU等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在SA感染致膿毒癥模型中，miR-133a/133b、miR-122、miR-205、miR-1899、miR-714、miR-291b的血清水平與SA特異性相關(guān)。RAU等[24]在大腸埃希菌和SA感染模型的對比研究中發(fā)現(xiàn)，miR-193b-3p、miR-133a-1-3p和miR-133a-2-3p是SA感染最常見的miRNA靶標(biāo)，也有可能成為GPB感染的特異性標(biāo)志物。還有些miRNA在特定GPB感染中呈差異性表達(dá)，可能與其感染特異性相關(guān)。在SA感染牛乳腺上皮細(xì)胞模型中檢測出miR-2339、miR-499、miR-23a、miR-99b這4種miRNA與SA感染特異性相關(guān)[19]。李斯特菌感染后，miRNA-146、miRNA-155、miR-125a-3p/5p、miR-149呈顯著差異表達(dá)，并且可能參與固有免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)[25]。不同GPB感染致膿毒癥也可能存在共同的生物標(biāo)志物，如miR-133a、miR-668、miR-1902、miR-1904等，而不同GPB感染還具有其特異性生物標(biāo)志物，有待進一步研究。

3.3miRNA與病毒感染的診斷 病毒致膿毒癥的高發(fā)人群主要是免疫力低下人群。有研究報道顯示，42.7%的膿毒癥患者存在兩種及兩種以上的病毒感染[26]，包括流感病毒、腺病毒、腸道病毒、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)等[27]。TUDOR等[28]通過對比膿毒癥患者和健康者的白細(xì)胞miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miR-K-10b和miR-K12-12的表達(dá)水平特異性顯著上調(diào)，能夠通過靶向TLR8促進白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-10分泌，參與膿毒癥的發(fā)展。在手足口病患者血清中發(fā)現(xiàn)6種miRNA，包括miR-148a、miR-143、miR-324-3p、miR-628-3p、miR-140-5p、miR-362-3p，具有腸道病毒特異性，有助于區(qū)分腸道病毒與其他微生物[29]。LI等[30]在VZV感染患者的循環(huán)miRNA分析中發(fā)現(xiàn)了6種miRNA，包括miR-190b、miR-571、miR-1276、miR-1303、miR-943、miR-661，其表達(dá)水平明顯上調(diào)，可能成為VZV感染的生物標(biāo)志物。還有研究顯示，miR-34/449 家族包括miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-449a、miR-449b 和 miR-449c，能夠參與免疫反應(yīng)和病毒感染的調(diào)節(jié)[31]，有可能成為病毒感染診斷和治療的新靶點。

3.4miRNA與真菌感染的診斷 膿毒癥的真菌病原體以念珠菌為主，而念珠菌感染通常與長期服用抗菌藥物、植入異物、免疫力低下和慢性病等有關(guān)。MUHAMMAD等[32]在念珠菌感染的呼吸道上皮細(xì)胞miRNA表達(dá)譜分析中發(fā)現(xiàn)，miR-16-1明顯上調(diào)，而miR-17-3p明顯下調(diào)。WU等[33]在白色念珠菌感染的巨噬細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p表達(dá)上調(diào)，而miR-223-3p表達(dá)下調(diào)，且參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的過程。MARIOTO等[34]研究發(fā)現(xiàn),miR-let-7f-5p、miR-let-7a-5p、miR-5p-26b、miR-let-7e-5p、miR-369-3p、miR-466k 在小鼠肺部感染巴西芽生菌后表達(dá)水平明顯增加，可能參與了巴西芽生菌感染期間的免疫反應(yīng)。還有研究顯示，通過miRNA檢測可有效區(qū)分口腔上皮細(xì)胞感染的高致病性或低致病性念珠菌類型[35]，提示miRNA對不同類型的真菌感染檢測也具有重要意義。

此外，有研究證實，在多種寄生蟲感染性疾病中也已發(fā)現(xiàn)miRNA的差異性表達(dá)[34-35]。miRNA作為生物標(biāo)志物有望用于區(qū)分不同的病原微生物感染，優(yōu)化抗感染策略及監(jiān)測患者對抗感染藥物治療的反應(yīng)。

4 小 結(jié)

綜上所述，大量研究已證實，多種miRNA的差異性表達(dá)與感染的病原微生物特異性相關(guān)，可能作為膿毒癥致病微生物診斷的潛在生物標(biāo)志物[34-35]，對GNB、GPB、病毒、真菌等的特異性檢測具有重要意義。目前研究結(jié)果之間存在重大差異，可能是因為研究多在重癥監(jiān)護病房或動物實驗中進行，研究設(shè)計和實驗標(biāo)本等存在差異，患病時長的差異也會在數(shù)據(jù)中產(chǎn)生干擾。miRNA檢測方法與研究方法的標(biāo)準(zhǔn)化及miRNA水平的縱向研究將提供膿毒癥進程中miRNA的表達(dá)信息，可能會解決一些矛盾。盡管目前miRNA與膿毒癥的發(fā)病機制、診斷與治療中的作用尚不明確，仍處于研究的初期階段，但是已經(jīng)越來越受到科研人員和臨床人員的關(guān)注，越來越多的特異性miRNA被發(fā)現(xiàn)在膿毒癥診斷中具有重要作用。隨著大量研究和調(diào)控機制的明確，miRNA可能會成為新型的膿毒癥診斷標(biāo)志物及快速、準(zhǔn)確檢測致病微生物，快速啟動定向治療，檢測抗感染療效，改善患者預(yù)后，降低病死率，優(yōu)化膿毒癥的診療策略。