紅景天苷保護(hù)砷中毒大鼠左心功能：二維斑點(diǎn)追蹤成像觀察

田芮萌，秦文娟，馮 佳，王 臻，翟子敬，蘆桂林

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，新疆 石河子 832008)

砷污染已經(jīng)成為全球普遍存在的環(huán)境問(wèn)題。自然界中，砷多以三價(jià)(As2O3)及五價(jià)(NaAsO3)形式存在于水系及土壤內(nèi)，生物體通過(guò)飲水或進(jìn)食水產(chǎn)品而攝入砷。砷具有顯著心臟毒性，可經(jīng)氧化應(yīng)激等多種途徑損害心肌細(xì)胞，造成心臟結(jié)構(gòu)及功能損傷[1-2]。紅景天苷具有抗炎、抗腫瘤及調(diào)節(jié)代謝等功能[3]，其抗氧化作用能有效降低As2O3所致心血管疾病的發(fā)病率[4]。二維斑點(diǎn)追蹤成像(two dimensional-speckle tracking echocardiography， 2D-STE)可利用分層應(yīng)變技術(shù)評(píng)價(jià)左心室不同層次、不同節(jié)段應(yīng)變能力，準(zhǔn)確、靈敏地反映左心室功能變化[5-7]。本研究以2D-STE觀察紅景天苷對(duì)砷中毒大鼠受損心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 40只8周齡雄性SD大鼠，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量180～220 g，于18～26℃、濕度40%～70%條件下飼養(yǎng)，每日12 h光照，自由采食，定量給水。將大鼠隨機(jī)分為紅景天苷高劑量組(S30組)、紅景天苷低劑量組(S15組)、模型組、無(wú)毒干預(yù)組(Sal組)及對(duì)照組，每組8只。本研究經(jīng)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：A2021-060-01)。

所用試劑及藥物：As2O3(北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司)；紅景天苷(北京索萊寶科技有限公司，純度99%)；戊巴比妥，肌肉型肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes-MB, CK-MB)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde， MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 制備模型 于適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，每日9時(shí)以As2O3(5 mg/kg體質(zhì)量)對(duì)S30組、S15組及模型組灌胃，對(duì)Sal組及對(duì)照組以無(wú)菌水灌胃，共30日。之后S30組予紅景天苷30 mg/kg體質(zhì)量、S15組及Sal組以紅景天苷15 mg/kg體質(zhì)量，模型組和對(duì)照組以無(wú)菌水灌胃，持續(xù)7日。記錄大鼠一般情況。

1.3 超聲檢查 造模后12 h經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥溶液麻醉、胸前區(qū)備皮后，以左側(cè)臥位保定于工作臺(tái)上，固定門(mén)齒及舌，連接小動(dòng)物心電圖。以Philips EPIQ 7C型彩色多普勒超聲診斷儀(12S心臟探頭，120～200幀/秒，12 MHz)連續(xù)采集>10個(gè)心動(dòng)周期圖像，獲取常規(guī)超聲心動(dòng)圖參數(shù)，包括左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter， LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter， LVESD)、左心室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening， LVFS)和左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction， LVEF)。采用2D-STE于乳頭肌短軸平面獲取左室中間段心內(nèi)膜下/中層/心外膜下心肌整體圓周應(yīng)變(global circumferential strain in subendocardial myocardium/middle myocardium/subepicardial myocardium， GCS-Endo/Mid/Epi)和心內(nèi)膜下層心肌各節(jié)段圓周應(yīng)變(circumferential strain， CS)，包括左心室中間段前壁/前間隔/后間隔/后壁/下壁/側(cè)壁(anterior/antero-septum/inferd-septum/infero-lateral/inferlor/antero-lateral of mid-cavity segments， MA/MAS/MIS/MIL/MI/MAL)。測(cè)量3次，取平均值。

1.4 實(shí)驗(yàn)室及病理檢查 經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血3 ml，檢測(cè)血清CK-MB和LDH。之后處死動(dòng)物，摘取其心臟并稱(chēng)重，計(jì)算心臟系數(shù)(心臟系數(shù)=心臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)，檢測(cè)心肌組織SOD、MDA，均重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值；行HE染色，并于光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。以±s表示符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料。采用單因素方差分析行多組間比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以Pearson相關(guān)性分析評(píng)價(jià)分層應(yīng)變參數(shù)與心肌標(biāo)志物之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠初始體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。造模后S30組、S15組和模型組大鼠精神欠佳，反應(yīng)遲鈍，采食、飲水減少，毛色暗淡；Sal組與對(duì)照組大鼠精神狀況較好，反應(yīng)迅速，采食、飲水正常，毛發(fā)光澤，體質(zhì)量增加；模型組末次體質(zhì)量小于對(duì)照組(P<0.05)。各組大鼠心臟質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均>0.05)。

模型組與S30組、S15組及對(duì)照組心臟系數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)表1。S30組、S15組及模型組心肌細(xì)胞不同程度排列紊亂，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核濃縮、深染，胞漿染色加深，細(xì)胞間隙增寬，可見(jiàn)壞死灶及紅細(xì)胞滲出，尤以模型組最著而S15組次之(圖1)；Sal組及對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核居中，細(xì)胞間隙均勻。

表1 大鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量變化情況

圖1 大鼠心肌組織病理圖(HE，×100) A.S30組； B.S15組； C.模型組； D.Sal組； E.對(duì)照組

2.1 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) S30組、S15組及模型組CK-MB、LDH及MDA水平均高于、SOD水平均低于對(duì)照組(P均<0.05)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均<0.05)；Sal組與對(duì)照組各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.2 超聲參數(shù) S30組、S15組及模型組LVFS、LVEF均較對(duì)照組減低(P均<0.05)，且S30組及S15組明顯高于模型組(P均<0.05)；S30組與S15組、 Sal組與對(duì)照組LVFS、LVEF差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。各組間LVEDD、LVESD差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3。

S30組、S15組及模型組GCS-Endo、GCS-Mid和GCS-Epi均較對(duì)照組減低(P均<0.05)，且組間GCS-Endo兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；Sal組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。S30組、S15組及模型組各節(jié)段應(yīng)變參數(shù)均較對(duì)照組減低(P均<0.05)，S30組和S15組CS-MA、CS-MAS、CS-MIS、CS-MIL及CS-MI均高于模型組(P均<0.05)，S30組CS-MA、CS-MIL和CS-MI均高于S15組(P均<0.05)；Sal組與對(duì)照組各節(jié)段應(yīng)變參數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3及圖2～4。

表3 各組大鼠超聲參數(shù)比較

圖2 大鼠GCS-Endo及各節(jié)段CS A.S30組； B.S15組； C.模型組； D.Sal組； E.對(duì)照組

2.3 相關(guān)性 GCS-Endo、GCS-Mid、GCS-Epi與CK-MB(r=-0.926、-0.813、-0.738，P均<0.05)和LDH(r=-0.908、-0.803、-0.737，P均<0.05)均呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

血清CK-MB、LDH水平可反映心肌受損程度[8]，心肌組織SOD、MDA含量代表其過(guò)氧化及抗過(guò)氧化水平[9]，由此可觀察砷中毒后心肌損傷及恢復(fù)情況[10]。本研究以As2O3對(duì)大鼠灌胃，構(gòu)建砷中毒大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型鼠活動(dòng)逐漸遲緩，毛發(fā)稀疏，精神欠佳，S30組、S15組和模型組較對(duì)照組CK-MB、LDH及MDA上升、SOD下降，LVEF、LVFS降低，且病理見(jiàn)心肌細(xì)胞受損表現(xiàn)，表明砷中毒可致大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能受損；予紅景天苷灌胃后S30組、S15組大鼠一般情況好轉(zhuǎn)，CK-MB、LDH及MDA下降而SOD上升，心肌細(xì)胞病理形態(tài)有所好轉(zhuǎn)，LVFS和LVEF也有所升高，而S30組與S15組間并無(wú)明顯差異，提示紅景天苷可在一定程度上促進(jìn)砷中毒大鼠心肌細(xì)胞和心臟結(jié)構(gòu)功能恢復(fù)；但常規(guī)超聲心動(dòng)圖敏感度欠佳，且受心率、檢測(cè)角度等因素影響較大，無(wú)法用于評(píng)估紅景天苷劑量與心肌功能恢復(fù)程度的關(guān)系[5]。

2D-STE可標(biāo)記并追蹤心內(nèi)膜位移，利用后處理技術(shù)直接觀察各層心肌不同節(jié)段的應(yīng)變能力，更加精確、直接地反映左心室功能[6]。本研究2D-STE結(jié)果顯示，砷中毒大鼠心肌應(yīng)變能力低于正常大鼠，且模型組改變較S30組及S15組更為明顯，與常規(guī)超聲心動(dòng)圖所見(jiàn)相符。砷對(duì)大鼠各層心肌的毒害作用有所不同[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)砷中毒后大鼠GCS-Endo下降最為明顯，而予紅景天苷后GCS-Endo恢復(fù)也最快，且相關(guān)性分析提示各層心肌GCS與CK-MB、LDH均呈負(fù)相關(guān)，尤以GCS-Endo相關(guān)性最高，提示心內(nèi)膜下心肌細(xì)胞對(duì)砷和紅景天苷均更為敏感，可能原因在于砷進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后最先累及由冠狀動(dòng)脈終末支供血的內(nèi)層心肌細(xì)胞[13]。

圖3 大鼠GCS-Mid及各節(jié)段CS A.S30組； B.S15組； C.模型組； D.Sal組； E.對(duì)照組

本研究中，砷中毒大鼠心肌所有節(jié)段CS均較對(duì)照組降低；予紅景天苷后，除MAL外，各節(jié)段 CS均較模型組增高，且S30組MA、MIL及MI的CS均高于S15組，提示砷中毒可損傷左心室各節(jié)段心肌，而紅景天苷有助于大部分節(jié)段恢復(fù)，且藥物劑量對(duì)各節(jié)段心肌細(xì)胞產(chǎn)生的效果可能不同，原因可能在于不同節(jié)段心肌細(xì)胞對(duì)紅景天苷的敏感度不同。本研究Sal組與對(duì)照組間超聲應(yīng)變參數(shù)、生化指標(biāo)及心肌病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)均無(wú)顯著差異，提示對(duì)正常個(gè)體短期使用紅景天苷不會(huì)對(duì)心臟結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生顯著影響，即無(wú)明顯心臟毒副作用。

綜上，2D-STE可早期發(fā)現(xiàn)砷中毒大鼠左心室功能變化，評(píng)估心肌受損及使用紅景天苷后恢復(fù)情況，具有較高敏感度。本研究的主要局限性：①行超聲心動(dòng)圖檢查時(shí)，因切面受限，未能與縱向應(yīng)變參數(shù)進(jìn)行對(duì)比；②僅設(shè)置2組不同劑量紅景天苷，觀察劑量依賴(lài)性的價(jià)值有限，有待進(jìn)一步觀察。