腸缺血再灌注損傷誘導(dǎo)Cajal間質(zhì)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

車 軒，郭依然，趙國(guó)杰，喬光超，吳國(guó)華，馮運(yùn)章

(邯鄲市中心醫(yī)院 1.普外七科；2.教學(xué)科,河北 邯鄲056001)

小腸是最易受缺血再灌注損傷的器官之一，在失血性休克或小腸移植中極易受到腸缺血再灌注損傷[1]。Cajal間質(zhì)細(xì)胞在胃腸運(yùn)動(dòng)中起重要調(diào)節(jié)作用，其中一個(gè)亞群位于肌間神經(jīng)叢(ICC-MY)水平，發(fā)揮著起搏細(xì)胞的作用，在小腸中產(chǎn)生和傳播慢波[2]。另一個(gè)與深肌叢(ICC-DMP)密切相關(guān)，在腸道神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)胃腸道平滑肌的輸入中起中介作用[3]。受體酪氨酸激酶(Kit)，被認(rèn)為是Cajal間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能維持所必需的。最近的研究還表明，Kit表達(dá)下調(diào)可能與小腸缺血再灌注損傷引起的胃腸動(dòng)力障礙有關(guān)[4]。其他研究也顯示，腸道手術(shù)操作和胃腸道疾病如腸梗阻后Kit免疫陽性的喪失，這可能是腸動(dòng)力功能障礙相關(guān)的潛在機(jī)制之一[5]。然而，在缺血再灌注損傷后，在肝臟、腎臟、腸道和肺中可觀察到明顯的細(xì)胞凋亡，但尚不清楚Cajal間質(zhì)細(xì)胞是否也參與了腸缺血再灌注損傷。本研究探討了腸缺血再灌注損傷是否能誘導(dǎo)Cajal間質(zhì)細(xì)胞凋亡及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只6-8周齡雄性豚鼠，體質(zhì)量300-350 g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(冀)2019-001。所有豚鼠均飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房中,室溫(23±2)℃，相對(duì)濕度(40%-70%)，晝夜循環(huán)12 h,豚鼠可自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

1.2 腸缺血手術(shù)方法

豚鼠在麻醉后進(jìn)行手術(shù)，取正中切口剖腹，分別結(jié)扎右結(jié)腸動(dòng)脈降支與回腸動(dòng)脈升支之間、回腸降支與最后一條回腸動(dòng)脈之間、腸系膜上動(dòng)脈近端和遠(yuǎn)端空腸動(dòng)脈之間的血管弓，阻斷側(cè)支血流。同時(shí)，為了阻斷腸壁內(nèi)的側(cè)支循環(huán)，在空腸和回腸末端加用血管微夾，使其與血管拱部處于相同的結(jié)扎水平。然后用血管夾閉右側(cè)結(jié)腸動(dòng)脈近端的腸系膜上動(dòng)脈，右結(jié)腸動(dòng)靜脈和回結(jié)腸動(dòng)靜脈也進(jìn)行閉塞。在計(jì)劃的缺血時(shí)間結(jié)束后，取出血管微夾，通過腸顏色由白色變?yōu)榉奂t色和腸系膜動(dòng)脈搏動(dòng)恢復(fù)來確認(rèn)小腸的血液再灌注。將小腸回納到腹部，切口用兩層連續(xù)的3-0絲線縫合。

1.3 分組

將40只豚鼠分為實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)Sham組。實(shí)驗(yàn)組豚鼠解除缺血后分別再灌注6 h(6 h 組，n=8)、12 h(12 h 組，n=8)、7 d(7 d組，n=8)和14 d(14 d組，n=8)，分別在腸缺血手術(shù)結(jié)束后，再灌注的第6 h、12 h、7 d、14 d處死。假手術(shù)Sham組(Sham組,n=8)：除血管夾閉外，其他處理方式同前。豚鼠處死后取回腸組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 病理組織學(xué)檢測(cè)

切除豚鼠回腸，用PBS沖洗腸道內(nèi)容物。將小腸用丙酮充氣30 min，沿腸系膜切開取出黏膜，在解剖顯微鏡下制備含有ICC-MY的縱向平滑肌層和圍繞深肌叢的與Cajal間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的環(huán)狀平滑肌層，進(jìn)行顯微鏡下Cajal間質(zhì)細(xì)胞觀察。將腸組織固定在4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋后，取4μm切片，蘇木精-伊紅染色，在光鏡下進(jìn)行腸黏膜形態(tài)觀察。

1.5 TUNEL凋亡檢測(cè)

腸組織用4%多聚甲醛固定20 min，用PBS清洗兩次30 min，然后用0.1%Triton X-100在冰上處理20 min。用含有45 μl標(biāo)記液和5 μl酶液的TUNEL反應(yīng)緩沖液在37℃黑暗環(huán)境中孵育1 h。然后用PBS清洗切片三次，每次15 min，以去除未結(jié)合的熒光素-dUTP。立刻在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)在450-500 nm之間。

1.6 ELISA檢測(cè)

PBS沖洗豚鼠腸組織，稱重、剪碎。加入含蛋白酶抑制劑的預(yù)冷PBS進(jìn)行勻漿。吸取勻漿液到離心管，4℃、5 000 g條件下離心10 min，取上清，-80℃保存，避免反復(fù)凍融。采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、乳酸、IL-12、IL-23水平，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.7 Western blot檢測(cè)

腸組織勻漿，然后用BioRad蛋白分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品在8%-10%的SDSPAGE上電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%的脫脂牛奶封閉。將膜與STAT2一抗(1∶1 000稀釋，Abcam公司)、JAK2一抗(1∶1 000稀釋，Abcam公司)、Bcl2一抗(1∶1 000稀釋，Abcam公司)、Bax一抗(1∶1 000稀釋，Abcam公司)在4℃共同孵育過夜，然后與二抗反應(yīng)，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影印跡條帶，并用BioRad成像系統(tǒng)檢測(cè)，其中條帶信號(hào)強(qiáng)度用Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用多因素方差檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD法進(jìn)行。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠腸道黏膜損傷比較

Sham組豚鼠腸上皮結(jié)構(gòu)完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。7 h組豚鼠可見腸上皮結(jié)構(gòu)部分破壞，可見部分腸皮上細(xì)胞脫落及小潰瘍形成。14 h組豚鼠腸上皮結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞，可見大量潰瘍及明顯上皮細(xì)胞脫落。7 d組及14 d組上皮細(xì)胞仍有損傷，但可見炎癥明顯緩解，上皮結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)。見圖1。

圖1 各組豚鼠腸黏膜病理檢查結(jié)果(×400)

2.2 Cajal間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的變化

與Sham組相比，在6 h組腸道細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)基本完整；12 h組豚鼠腸道細(xì)胞突起的密度和厚度均顯著降低。再灌注7 d、14 d后，腸道細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)部分恢復(fù)，且再灌注恢復(fù)時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)越完整，在第14 d時(shí)，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)已基本恢復(fù)正常。見圖2。

圖2 各組Cajal間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化(×200)

2.3 Cajal間質(zhì)細(xì)胞凋亡檢測(cè)

TUNEL法檢測(cè)腸道細(xì)胞凋亡。在Sham組中，沒有檢測(cè)到明顯的凋亡細(xì)胞。6 h組、12 h組、7 d組、14 d組的凋亡細(xì)胞比例分別為(6.84±0.89)%、(48.6±6.85)%、(22.14±4.82)%、(9.64±1.41)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。12 h組豚鼠腸道細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例顯著最高，隨著康復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，7 d組、14 d組腸道凋亡細(xì)胞逐漸下降。見圖3。

圖3 各組腸道細(xì)胞TUNEL凋亡檢測(cè)(×200)

2.4 各組豚鼠腸組織中炎癥因子水平比較

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，12 h組豚鼠腸組織中的炎癥因子，包括TNF-α、乳酸、IL-12、IL-23的表達(dá)水平達(dá)到峰值，顯著高于其他組豚鼠(P<0.05)。與12 h組相比，7 d組及14 d組豚鼠腸道炎癥因子水平逐漸下降；14 d組豚鼠腸道的IL-12、IL-23的表達(dá)水平與Sham組無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組豚鼠腸組織中炎癥因子水平比較

2.5 Western blot檢測(cè)JAK2/STAT2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)顯示，與Sham組相比，6 h組豚鼠腸組織中STAT2、JAK2、Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，Bax蛋白水平明顯升高(P<0.05)。12 h組豚鼠腸組織STAT2、JAK2、Bcl2蛋白水平進(jìn)一步降低(P<0.05)，而7 d組、14 d組豚鼠的STAT2、JAK2、Bcl2蛋白水平逐漸升高，Bax水平下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)JAK2/STAT2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

近年來，隨著免疫抑制劑和術(shù)后處理方案的改進(jìn)，小腸移植已成為短腸綜合征患者在全腸外營(yíng)養(yǎng)治療中出現(xiàn)危及生命的并發(fā)癥的首選治療方法。然而，缺血再灌注損傷是小腸移植的一個(gè)重要限制因素，因?yàn)樾∧c是最易受缺血影響的器官之一。小腸移植物的損傷不僅發(fā)生在缺血期間，也發(fā)生在再灌注后。小腸的缺血再灌注損傷可引起黏膜水平的顯著改變，黏膜屏障功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌易位和內(nèi)毒素血癥增加[6]。這可能會(huì)促進(jìn)嚴(yán)重的系統(tǒng)性、多器官反應(yīng)。因此，控制移植物缺血再灌注損傷是小腸移植成功的關(guān)鍵。雖然小腸缺血再灌注損傷的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，但各種介質(zhì)，如細(xì)胞因子(TNF-α和IL-23)、活性氧中間體、血小板活化因子和一氧化氮等，已被證實(shí)與內(nèi)毒素血癥和小腸再灌注損傷有關(guān)[7]。在這些介質(zhì)中，炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-23被認(rèn)為在炎癥反應(yīng)的早期階段起著重要作用。本研究通過ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，12 h組豚鼠腸組織中的炎癥因子，包括TNF-α、乳酸、IL-12、IL-23的表達(dá)水平達(dá)到峰值。與12 h組相比，7 d組及14 d組豚鼠腸道炎癥因子水平逐漸下降；14 d組豚鼠腸道的IL-12、IL-23的表達(dá)水平與Sham組無明顯差異。IL-12在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中可引起血流動(dòng)力學(xué)休克和組織損傷。最近研究表明，TNF-α和IL-12在肝臟和心臟的缺血再灌注損傷中起重要作用[8]。細(xì)胞因子抑制劑FR 167653被證明能抑制脂多糖刺激的人單核細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α，并能通過抑制TNF-α的產(chǎn)生來改善內(nèi)毒素誘導(dǎo)的休克和彌散性血管內(nèi)凝血[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)腸缺血再灌注損傷后Kit陽性的Cajal間質(zhì)細(xì)胞凋亡、數(shù)量減少，但隨著腸灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯恢復(fù)。缺血再灌注損傷可導(dǎo)致胃腸功能障礙，如胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)延遲，移行運(yùn)動(dòng)復(fù)合體改變，在體外可導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的機(jī)械收縮減少[10]。豚鼠腸缺血再灌注損傷模型顯示Kit陽性的Cajal間質(zhì)細(xì)胞的丟失伴隨著自發(fā)性機(jī)械收縮的減弱，這種收縮可能是由Cajal間質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的。因此，有研究者認(rèn)為Cajal間質(zhì)細(xì)胞在缺血再灌注引起的運(yùn)動(dòng)障礙中起核心作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在腸缺血再灌注豚鼠模型中，ICC-MY中Kit陽性細(xì)胞的數(shù)量減少了50%，Kit表達(dá)丟失可能是運(yùn)動(dòng)障礙相關(guān)的潛在機(jī)制之一。另一些研究者根據(jù)Kit信號(hào)阻斷實(shí)驗(yàn)，推測(cè)Kit的丟失可能導(dǎo)致Cajal間質(zhì)細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)分化[11]。在肝臟、腎臟、心臟以及腸缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型中，細(xì)胞凋亡通常存在于組織[12]。本研究采用TUNEL法證實(shí)了腸道缺血再灌注造成了腸細(xì)胞的凋亡，這可能也是導(dǎo)致腸功能障礙的原因之一。

缺血再灌注損傷可造成線粒體Ca2+超載和活性氧大量釋放，導(dǎo)致線粒體嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)和功能破壞，是組織細(xì)胞缺血再灌注損傷的主要原因[13]。JAK2/STAT2信號(hào)通路具有抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔開放、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和促進(jìn)核因子NF-E2相關(guān)因子2激活轉(zhuǎn)位從而起到抗氧化及抗細(xì)胞凋亡等作用，在缺血再灌注損傷中起著重要保護(hù)作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)與Sham組相比，6 h組豚鼠腸組織中STAT2、JAK2、Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著下降，Bax蛋白水平明顯升高，而7 d組、14 d組豚鼠的STAT2、JAK2、Bcl2蛋白水平逐漸升高，Bax水平下降(P<0.05)。這表明，缺血再灌注損傷導(dǎo)致的組織細(xì)胞凋亡，使Bcl2/Bax蛋白比例失衡，使JAK2/STAT2信號(hào)通路活性被抑制。但隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，豚鼠的腸道細(xì)胞穩(wěn)態(tài)得到恢復(fù)，JAK2/STAT2信號(hào)通路活性得到一定程度緩解，這與組織病理學(xué)所觀察到的結(jié)果一致。

綜上所述，腸缺血再灌注損傷可導(dǎo)致Cajal間質(zhì)細(xì)胞凋亡、數(shù)量減少，這可能與抑制JAK2/ STAT3信號(hào)通路的活性有關(guān)。