體外模擬大豆種皮多糖胃腸道消化特性研究

楊立娜，王子義，蔡文琪，吳星會(huì)，王勝男，蔚彥平，周大宇，劉 賀*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州 121013 2 遼寧省糧谷類食品生物高效轉(zhuǎn)化工程研究中心 遼寧錦州 121013 3 阜新和潤(rùn)生物技術(shù)有限公司 遼寧阜新 123000）

大豆是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在大豆深加工的過(guò)程中產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物，如大豆種皮、豆渣和黃漿水等。大豆種皮經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低，一般用于牲畜的飼料[1]。然而，大豆種皮含有豐富的膳食纖維和多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，具有較高的利用價(jià)值。大豆種皮多糖是以大豆種皮為原料制備的水溶性多糖，是一種新型的天然大分子物質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)在微波輔助草酸銨和草酸提取條件下，以以上兩種提取劑提取的多糖呈蠕蟲狀，且以草酸為提取劑的多糖明顯促進(jìn)了糞便中益生菌的增殖。此外，還發(fā)現(xiàn)大豆種皮多糖通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群和抑制TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路減輕了小鼠的腸道炎癥[3]。除此之外，大豆種皮多糖還具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖以及調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等功能[4-8]，具有廣闊的應(yīng)用前景。

消化作為機(jī)體代謝和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的關(guān)鍵步驟，實(shí)現(xiàn)了將食物大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為機(jī)體可吸收的小分子物質(zhì)，并通過(guò)特定的代謝部位發(fā)揮功能。大部分多糖作為大分子物質(zhì)難以在胃腸道被人體消化吸收，主要是在大腸處被微生物酵解，產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等[9]。目前，還沒(méi)有關(guān)于大豆種皮多糖在人體消化道 （即口腔、胃、小腸、大腸）消化情況的報(bào)道。本試驗(yàn)以人體胃腸道模擬系統(tǒng)為基礎(chǔ)，探究大豆種皮多糖在體內(nèi)的消化情況。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大豆種皮，購(gòu)于山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；胰蛋白酶、胰蛋白胨、豬胃黏蛋白、L-半胱氨酸、?；悄懰徕c，購(gòu)于上海源葉生物有限公司；草酸銨、硫酸、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、乙醇、苯酚、咔唑等試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器

UV-2550 紫外-可見分光光度計(jì)，日本Shimadzu 公司；PHS-3C pH 計(jì)，上海雷磁儀器廠；NanoBrook 90Plus 粒度分析儀，美國(guó)Brookhaven儀器公司；T & J-MiniPod-Ⅱ腸道體外模擬系統(tǒng)，上海迪必爾生物工程有限公司；NANO-ZS90 電位分析儀，英國(guó)Malvern 儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖的制備 將大豆種皮粉碎，過(guò)60 目篩，按1∶10（料液比）加入乙醇溶液（1%），室溫下攪拌30 min，經(jīng)過(guò)濾后，將濾渣置于65 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干。稱取烘干后的濾渣，按料液比1∶20加入去離子水，并加入0.6%的草酸鈉，在480 W微波條件下作用30 min，過(guò)濾后，將濾液以4 000 r/min 離心10 min，并將離心后得到的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，調(diào)節(jié)pH 值至4.0，加入雙倍濃縮液體積的無(wú)水乙醇并不斷攪拌，過(guò)夜放置后過(guò)濾，將濾渣置于65 ℃恒溫干燥箱中烘干，得到大豆種皮多糖（Soy hull polysaccharide，SHP）。

1.3.2 體外消化液的配制

1） 模擬口腔液 用去離子水配制酶活力達(dá)到100 IU/mL 的α-淀粉酶溶液。模擬胃液，取濃鹽酸23.4 mL，加去離子水100 mL，配制成稀鹽酸，取上述鹽酸1.64 mL，加水約80 mL 與胃蛋白酶1 g 混勻，加去離子水稀釋成100 mL，備用。

2） 模擬小腸液 取0.68 g 磷酸二氫鉀，加500 mL 去離子水溶解，用濃度為0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液調(diào)成pH 值為6.8 的溶液，另外取1 g 胰蛋白酶，加適量去離子水溶解，將兩種溶液混勻，加水稀釋成100 mL[10]，備用。

3） 模擬大腸液 配制含有3.0 g/L 黏蛋白，0.37 g/L L-半胱氨酸，12.5 g/L NaCl 和0.9 g/L 胰酶的基本培養(yǎng)基[11]，收集在過(guò)去的半年中沒(méi)有胃腸道疾病和抗生素治療的一個(gè)健康志愿者的新鮮糞便并按等比例混合，以1∶10（g/L）與0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）混合制備糞便漿液，將其以比例為1∶10 添加到無(wú)菌培養(yǎng)基中，備用。

1.3.3 體外模擬消化 2 mg/mL 滅菌的SHP 溶液與20 mL 過(guò)0.22 μm 濾膜的模擬唾液充分混合，在37 ℃恒溫下反應(yīng)2 min，取10 mL 消化液滅酶終止反應(yīng)，保存到-80 ℃冰箱待測(cè)。繼續(xù)加入過(guò)0.22 μm 濾膜的模擬胃液150 mL，消化6 h，用1 mol/L HCl 控制pH 值為1.5，在2，4，6 h 時(shí)取樣10 mL 滅酶保存。繼續(xù)加入過(guò)0.22 μm 濾膜的模擬小腸液200 mL，消化6 h，用1 mol/L NaHCO3控制pH 值為6.8，在2，4，6 h 時(shí)取樣10 mL 滅酶保存。最后加入滅菌后的大腸液，模擬消化48 h，在12，24，36，48 h 時(shí)取樣10 mL 滅酶保存。將多糖溶液換成去離子水作為空白組，重復(fù)上述操作。

1.3.4 模擬消化產(chǎn)物中的總糖、還原糖、糖醛酸含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[12]測(cè)定總糖含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0098x-0.0779，R2=0.9994，x 為葡萄糖的質(zhì)量濃度（μg/mL）。采用DNS 法[13]測(cè)定還原糖含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.577x-0.1305，R2=0.9984，x 為葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）。糖醛酸含量測(cè)定采用咔唑-硫酸比色法[14]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.9243x+0.0272，R2=0.9907，x 為半乳糖醛酸的質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.5 粒徑的測(cè)定 根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射的原理[15]，采用NanoBrook 90Plus 粒度分析儀來(lái)測(cè)定不同時(shí)間樣液等效直徑以及粒度分布情況。參數(shù)設(shè)置：散射角90°，激光波長(zhǎng)640 nm，氣溫37 ℃，粒子折射率1.59，水溶劑，溶劑的折射率1.33。

1.3.6 Zeta-電位的測(cè)定 參考Liang 等[16]的方法，略改。利用NANO-ZS90 電位分析儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試溫度為25 ℃，取1 mL 樣品于樣品皿中，在儀器內(nèi)平衡2 min，每組試驗(yàn)測(cè)定3 次。

1.3.7 pH 值的測(cè)定 重復(fù)1.3.2 節(jié)的操作，不加酸堿控制pH 值。采用腸道模擬器消化并監(jiān)測(cè)pH值的變化情況。

1.3.8 流變特性的檢測(cè) 采用 Discovery HR-1流變儀對(duì)消化液進(jìn)行流變學(xué)分析。將樣品滴加到流變儀平板（直徑40 mm，間隙50 μm）上，剪切速率為0.01～1 000 s-1，37 ℃下線性剪切300 s，檢測(cè)多糖消化液的表觀黏度隨剪切速率的變化情況。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0 軟件作圖。采用SSPS 軟件對(duì)多組均數(shù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)經(jīng)變量轉(zhuǎn)換達(dá)到方差齊性） 和單因素方差分析。采用Ducan 法比較各組間差異，P＜0.05 時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 總糖、還原糖、糖醛酸含量變化

多糖在水體系內(nèi)容易形成聚集體，因此很難判斷出聚集體分子質(zhì)量的改變是由于聚集體的破壞造成的還是聚集體鏈上的共價(jià)鍵斷裂造成的[17]。DNS 法顯色只與糖類游離出還原基團(tuán)有關(guān)，因此通過(guò)DNS 法檢測(cè)還原糖含量可以判斷聚集體的共價(jià)鍵斷裂情況[18]。如表1所示，總糖含量在口腔、胃和小腸內(nèi)變化不大（P＞0.05），在大腸酵解階段，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，總糖含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，糖醛酸也表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。而還原糖的含量在口腔、胃和小腸階段是逐漸增加的，在大腸酵解階段急劇降低，這說(shuō)明在口腔、胃和小腸內(nèi)，多糖部分糖苷鍵發(fā)生了斷裂導(dǎo)致還原糖增加，因此產(chǎn)生了帶有還原性末端的多糖鏈[17]，但是總糖的含量沒(méi)有因?yàn)槎嗵瞧位淖?。而且有?bào)道表明，胃腸道消化可能導(dǎo)致多糖中還原糖的產(chǎn)生[19]，具體的原因可能是酸性環(huán)境對(duì)多糖鏈有一定的破壞作用[20]。在大腸酵解階段，腸道菌群酵解SHP[19]，還原糖和糖醛酸含量最終表現(xiàn)出隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而下降的趨勢(shì)。

2.2 SHP 消化過(guò)程中的粒徑變化

黏液粒徑是消化產(chǎn)物的重要指標(biāo)，它直接影響流變特性和消化性能[21]。多分散指數(shù)（Polydispersity Index，PDI）在0.07～0.8 之間，表明測(cè)量系統(tǒng)的顆粒分布均勻。由圖1可以看出，在胃和小腸的消化階段內(nèi)，等效粒徑是隨著時(shí)間逐漸變小的。尤其是胃2 h 到胃6 h，明顯下降。在胃到小腸的過(guò)渡階段，加入了模擬腸液，因此在小腸初期（2 h），出現(xiàn)了粒徑的小幅度增加，這是由于酶剛加入的模擬液中酶顆粒尚未完全與多糖發(fā)生反應(yīng)，存在的酶顆粒導(dǎo)致粒徑突然增大，同樣的，胃初期的粒徑增加也是此原因。而在大腸階段，隨著酵解的進(jìn)行，粒徑也是不斷減小。在胃和小腸的消化階段內(nèi)，粒徑減小的原因是多糖糖苷鍵遭到破壞[17]，產(chǎn)生了較小的多糖片段，并且隨著消化的進(jìn)行，多糖鏈逐步變?yōu)楹€原性末端的片段多糖，這與還原糖的含量增加的現(xiàn)象相符。大腸階段是微生物的分解導(dǎo)致粒徑變小，隨著酵解的進(jìn)行，消化液中的物質(zhì)被繼續(xù)消耗和分解成小分子物質(zhì)，隨后被微生物利用，這與總糖含量在大腸酵解階段的變化相符[22]。

2.3 SHP 消化過(guò)程中的Zeta 電位變化

Zeta 電位是對(duì)顆粒之間相互排斥或吸引力的強(qiáng)度的度量，分散粒子越小，Zeta 電位的絕對(duì)值（正或負(fù)）越高。電位值變化如圖2所示，所有樣品表面均帶負(fù)電，這與鐘碧疆[23]研究的可溶性大豆多糖不帶正電結(jié)論相似。在胃和小腸的消化階段，電位絕對(duì)值是上升的趨勢(shì)，從最初的（3.57±0.35）mV 上升到（20.10±0.78）mV，電位絕對(duì)值的變化很明顯（P＜0.05）。結(jié)合粒徑和電位我們發(fā)現(xiàn)，胃和小腸階段可能只是單純的糖苷鍵斷裂，并沒(méi)有單糖或者寡糖的產(chǎn)生，只是產(chǎn)生了帶有還原糖的多糖片段，因此溶液中的粒子逐步變小，液滴之間的靜電斥力越強(qiáng)，從而導(dǎo)致電位絕對(duì)值的上升[24]。大腸階段在菌群降解作用下，糖分子改變表面電荷分布，其靜電屏蔽效應(yīng)使表面電荷量減少，因此電位絕對(duì)值下降，隨后被微生物利用，消化液中的物質(zhì)被利用減少，因此隨后的酵解過(guò)程中，電位絕對(duì)值逐漸下降[25]。

圖2 體外模擬消化液的電位Fig.2 Potential of simulated digestive juice in vitro

2.4 SHP 消化過(guò)程中的pH 值變化

pH 值是多糖酵解過(guò)程中的主要考察指標(biāo)之一，一些容易產(chǎn)生致癌物質(zhì)的腐生菌在較高pH值環(huán)境下生長(zhǎng)活躍，pH 值的降低能有效抑制腸道中腐生菌的生長(zhǎng)，同時(shí)較低的pH 值可以防止對(duì)pH 值敏感的病原菌過(guò)度生長(zhǎng)，如腸桿菌科（Enterobacteriaceae）和梭狀芽孢桿菌（Clostridia），從而達(dá)到預(yù)防和治療腸道疾病的作用[26]。多糖消化過(guò)程的pH 值變化如表2所示，胃液pH 值沒(méi)有明顯變化，維持正常胃液pH 值1.5 左右。而正常小腸液（pH 6.8），在加入小腸液后，pH 值僅約為4。在這兩個(gè)階段，多糖沒(méi)有發(fā)生降解，可能只有一些還原性的多糖片段產(chǎn)生，因此沒(méi)有明顯的變化（P＞0.05）。堿性的大腸液加入使得初期發(fā)酵液的pH值呈弱堿性，然后隨著大腸發(fā)酵的進(jìn)行，pH 值從（7.91±0.00）下降到（5.93±0.00），下降得很明顯，（P＜0.05），且pH 值的下降速度在發(fā)酵12～24 h 內(nèi)較快，在隨后的24 h 內(nèi)趨于平穩(wěn)，這是發(fā)酵液內(nèi)的SHP 被充分消耗了。pH 值的下降表明多糖酵解產(chǎn)物中可能產(chǎn)生了短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）[26]。Hu 等[27]發(fā)現(xiàn)在車前子多糖酵解過(guò)程中，糞便培養(yǎng)物的pH 值從6.10 降低至5.10。山茶花多糖的酵解產(chǎn)物酵解0 h 的pH 值為6.48，酵解6 h 時(shí)的pH 值為5.00，pH 值隨著酵解時(shí)間的延長(zhǎng)降低[28]。

表2 體外模擬SHP 消化的pH 值Table 2 pH of simulated SHP digestion in vitro

2.5 SHP 消化過(guò)程中的流變特性

高分子聚合物的鏈長(zhǎng)直接影響消化液的流變性，而消化液的流變性通常會(huì)影響腸道菌群的定植、分布與生長(zhǎng)，進(jìn)而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收效果[29]。K 值為稠度系數(shù)，是黏度的度量。n 值為流動(dòng)指數(shù)，當(dāng)n＜1 時(shí)，液體為假塑性流體。如圖3和表1所示，所有樣品均為假塑性流體，消化液的黏度隨剪切速率的增加而迅速降低，因?yàn)樵陟o電斥力的作用下，外力剪切驅(qū)使多糖鏈成平行流動(dòng)并且多糖鏈斷裂，導(dǎo)致阻力減小，表觀黏度下降[31]。從口腔、胃、小腸到大腸階段，多糖鏈不斷被破壞，粒徑不斷減小，多糖含量不斷下降，從而導(dǎo)致消化液黏度下降。Xu 等[30]研究了覆盆子多糖表觀黏度隨剪切速率的變化特性，與本研究結(jié)果相近。

圖3 剪切速率對(duì)發(fā)酵液表觀黏度的影響Fig.3 Effects of shear rate on the apparent viscosities of fermentation fluid

表3 冪律模型擬合參數(shù)Table 3 Power law model fitting parameters

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)體外模擬人體消化系統(tǒng)，分別模擬了唾液、胃液、小腸和大腸液對(duì)多糖的消化作用，研究表明：在口腔、胃、小腸消化過(guò)程中，SHP不會(huì)被消化，只是發(fā)生糖苷鍵的斷裂，生成含有還原性末端的片段，而在大腸酵解階段，SHP 會(huì)被微生物利用，最終被微生物降解生成酸性物質(zhì)。SHP具有膳食纖維的特性，在人體胃腸道內(nèi)不會(huì)被消化分解，而是通過(guò)在大腸的酵解產(chǎn)生一些物質(zhì)來(lái)改善腸道環(huán)境。