果實(shí)成熟及品質(zhì)形成的負(fù)調(diào)控因子研究進(jìn)展

薛 茂，朱本忠，吳培文，杜瑩琳，初易洋，張瑞家

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083）

果實(shí)的發(fā)育與成熟是高等植物生命周期中的一個(gè)特有階段，它包含細(xì)胞分裂與分化、細(xì)胞膨大、果實(shí)發(fā)育、果實(shí)成熟與衰老5 個(gè)階段[1]。而果實(shí)成熟是果實(shí)食用品質(zhì)形成的關(guān)鍵時(shí)期。在這個(gè)時(shí)期，大量成熟相關(guān)基因的時(shí)空特異性表達(dá)使得果實(shí)發(fā)生顏色、風(fēng)味、質(zhì)地等一系列生理、生化變化，從而形成果實(shí)獨(dú)特的成熟品質(zhì)[1]。果實(shí)成熟受諸多調(diào)控因子的共同調(diào)控，如乙烯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 的甲基化修飾等[2]。根據(jù)對(duì)果實(shí)成熟進(jìn)程的調(diào)控作用，將這些調(diào)控因子分為正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子。過(guò)去關(guān)于果實(shí)成熟和品質(zhì)調(diào)控的研究主要集中于正調(diào)控因子的挖掘與功能解析，而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)負(fù)調(diào)控因子在果實(shí)成熟及品質(zhì)形成中也扮演著十分重要的角色，這其中包括參與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的轉(zhuǎn)錄抑制子，參與轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的負(fù)調(diào)控因子，參與翻譯后水平調(diào)控的負(fù)調(diào)控因子以及其它負(fù)調(diào)控因子。本文綜述近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的參與果實(shí)成熟及品質(zhì)形成的各類(lèi)負(fù)調(diào)控因子及其作用機(jī)制，旨在為果實(shí)成熟及品質(zhì)形成的深入研究提供理論基礎(chǔ)與研究思路。

1 參與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的轉(zhuǎn)錄抑制因子

轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)具有特定功能的蛋白質(zhì)，它通過(guò)結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子一般含有DNA 結(jié)合區(qū)、寡聚化位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)、核信號(hào)定位區(qū)4個(gè)功能區(qū)[3]。其中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)決定了轉(zhuǎn)錄因子是激活還是抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此，我們可以根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的功能將其分為轉(zhuǎn)錄激活子和轉(zhuǎn)錄抑制子兩種類(lèi)型。轉(zhuǎn)錄抑制子又可以分為被動(dòng)抑制子和主動(dòng)抑制子。被動(dòng)抑制子主要通過(guò)與激活子競(jìng)爭(zhēng)相同的DNA 結(jié)合位點(diǎn)或與激活子結(jié)合并形成一個(gè)沒(méi)有激活活性的復(fù)合物來(lái)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用[4]。主動(dòng)抑制子含有一個(gè)抑制域，通常通過(guò)染色體結(jié)構(gòu)修飾（如組蛋白的去乙?；┗蛘吲c激活子相互作用而行使抑制功能[4-5]。主動(dòng)抑制子的抑制域又可分為EAR 基序[5]，LxLxL 基序[6]、富脯氨酸抑制域[7]、DLN 盒[8]以及OVATE 抑制域5 個(gè)類(lèi)型[9]。

1.1 AP2/ERFs 家族轉(zhuǎn)錄因子

AP2/ERFs 具有APETALA2 （AP2）/乙烯響應(yīng)元件結(jié)合因子（EREB）結(jié)構(gòu)域的特征，該結(jié)構(gòu)域含有40～70 個(gè)保守的與DNA 結(jié)合相關(guān)的氨基酸。AP2/ERFs 家族包含AP2、RAV、DREB 和ERF 4個(gè)主要的亞家族[10]。目前研究表明，AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)成熟及防御反應(yīng)等多種代謝途徑[12-14]，其可以作為乙烯信號(hào)通路中的響應(yīng)元件，從而調(diào)控乙烯、生長(zhǎng)素（indole-3-acetic acid，IAA）、細(xì)胞分裂素、赤霉素（Gibberellins，GAs）和脫落酸（Abscisic acid，ABA）等植物激素的生物合成[11-13]。

在番茄果實(shí)中，SlAP2a 基因的表達(dá)水平與果實(shí)成熟進(jìn)程呈正相關(guān)，并在紅熟期維持較高的水平。在番茄植株中通過(guò)RNA 干擾（RNA interference，RNAi）沉默SlAP2a 基因后，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)發(fā)育及成熟發(fā)生了顯著改變，包括果實(shí)體積變小，果實(shí)成熟提前及軟化提前等。同時(shí)，SlAP2a 基因沉默的番茄果實(shí)乙烯合成增加，番茄紅素的積累顯著降低，而β-胡蘿卜素及葉綠素含量顯著增加，成熟相關(guān)基因（ACS2、ACS4、ACO1、E4、E8、RIN 以及PG2a）的表達(dá)水平上升，這表明SlAP2a 可以通過(guò)抑制乙烯與類(lèi)胡蘿卜素的生物合成負(fù)向調(diào)控果實(shí)成熟[14]。利用RNAi 沉默番茄中的SlERF6，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的類(lèi)胡蘿卜素含量以及乙烯釋放量均升高，同時(shí)乙烯合成相關(guān)基因ACS2、ACO1 和ACO3 的表達(dá)量升高，表明SlERF6 能夠通過(guò)直接或間接的方式抑制番茄果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素的積累和乙烯的合成，是番茄果實(shí)成熟的抑制子[15]。

在枇杷果實(shí)中，轉(zhuǎn)錄因子EjAP2-1 可以通過(guò)負(fù)調(diào)控木質(zhì)素的生物合成從而影響枇杷果實(shí)成熟過(guò)程中的質(zhì)地和風(fēng)味。Zeng 等[16]從低溫貯藏的枇杷果實(shí)中分離了18 個(gè)AP2/ERF 家族基因，發(fā)現(xiàn)EjAP2-1 的表達(dá)水平與果實(shí)木質(zhì)化程度呈負(fù)相關(guān)，且序列分析表明其具有1 個(gè)EAR 抑制基序。同時(shí)，雙熒光素酶分析表明，EjAP2-1 可以抑制木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵基因Ej4CL1 啟動(dòng)子的活性，但EjAP2-1 并未直接作用于Ej4CL1 的啟動(dòng)子區(qū)域。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EjAP2-1 與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的EjMYB1 和EjMYB2 蛋白之間存在互作，其通過(guò)與EjMYB1 或EjMYB2 結(jié)合共同抑制Ej4CL1啟動(dòng)子的活性。因此，EjAP2-1 是木質(zhì)素生物合成的間接轉(zhuǎn)錄抑制子，其抑制作用主要來(lái)源于EAR抑制區(qū)域，并通過(guò)與EjMYB 蛋白的互作來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在獼猴桃果實(shí)中，Yin 等[17]研究發(fā)現(xiàn)AdERF9基因也含有EAR 抑制域，其能夠與細(xì)胞壁降解相關(guān)基因AdXET5 的啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，從而在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)調(diào)控獼猴桃果實(shí)的成熟和軟化。

在蘋(píng)果果實(shí)中，利用病毒誘導(dǎo)基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)瞬時(shí)沉默MdERF2 基因后，蘋(píng)果果實(shí)的乙烯釋放量顯著增加且果實(shí)成熟提前。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子MdERF2 通過(guò)和乙烯生物合成關(guān)鍵基因MdACS1的啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，同時(shí)，MdERF2 還可以通過(guò)抑制MdERF3 啟動(dòng)子的活性，間接抑制MdACS1 的表達(dá)。因此，MdERF2 通過(guò)多種機(jī)制抑制MdACS1 的轉(zhuǎn)錄，從而負(fù)調(diào)控蘋(píng)果果實(shí)的乙烯生物合成及成熟進(jìn)程[18]。

在香蕉果實(shí)中，轉(zhuǎn)錄因子MaERF11 可以將MaHDA1 蛋白募集到乙烯合成關(guān)鍵基因MaACO1和果實(shí)軟化相關(guān)基因MaEXP2/7/8 的啟動(dòng)子上并抑制其轉(zhuǎn)錄，同時(shí)通過(guò)組蛋白去乙?；瘉?lái)抑制這些基因的表達(dá)，說(shuō)明MaERF11 通過(guò)抑制乙烯合成和細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)負(fù)調(diào)控香蕉果實(shí)成熟[19]。此外，在香蕉中與番茄SlAP2a 同源性較高的轉(zhuǎn)錄因子MaAP2a-1 也是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子，其通過(guò)與香蕉果實(shí)中15 個(gè)淀粉降解基因的啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制香蕉果實(shí)采后成熟過(guò)程中的淀粉降解[20]，負(fù)向調(diào)控香蕉果實(shí)的后熟過(guò)程。MaDEAR1 是香蕉中的DREB 亞家族基因，預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)具有與DRE 結(jié)合的APETALA2 （AP2） 域和負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄抑制的EAR 基序，雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)也表明其具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。在香蕉果實(shí)成熟過(guò)程中，MaDEAR1 調(diào)控區(qū)域的組蛋白H3 和H4 乙酰化水平降低，同時(shí)MaDEAR1 可直接與細(xì)胞壁修飾基因 （包括Ma-EXP1/3，MaPG1，MaXTH10，MaPL3 和MaPME3）的啟動(dòng)子上的DRE/CRT 基序結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)而負(fù)調(diào)控香蕉果實(shí)的成熟軟化[21]。Kuang 等[22]通過(guò)ChIP-Seq 在香蕉基因組上確定了697 個(gè)MaDREB2 的潛在靶標(biāo)，其結(jié)合位點(diǎn)分布在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的啟動(dòng)子區(qū)域。大多數(shù)MaDREB2 的靶標(biāo)均包含保守的（A/G）CC（G/C）AC 基序，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，MaDREB2 可能直接調(diào)控了許多與果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)，且可同時(shí)作為轉(zhuǎn)錄激活子和轉(zhuǎn)錄抑制子調(diào)控香蕉果實(shí)成熟。

1.2 MYB 家族轉(zhuǎn)錄因子

MYB 家族轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列上都有一段保守的DNA 結(jié)合區(qū)域，該結(jié)構(gòu)域的N 端是高度保守的，包含1～3 個(gè)串聯(lián)且不完全重復(fù)的結(jié)構(gòu)：R1/R2/R3。根據(jù)MYB 轉(zhuǎn)錄因子含有的R 結(jié)構(gòu)個(gè)數(shù)將其分為4 類(lèi)：R1-MYB 蛋白、R2R3-MYB 蛋白、R1R2R3-MYB 蛋白以及含有4 個(gè)R 結(jié)構(gòu)的MYB轉(zhuǎn)錄因子[23]。具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的MYB 轉(zhuǎn)錄因子一般C 端具有1 個(gè)EAR 抑制基序或者TLLLFR抑制基序[24]。

在香蕉果實(shí)中，轉(zhuǎn)錄因子MaMYB3 可以與淀粉降解的關(guān)鍵酶基因MaGWD1 的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并抑制其表達(dá)。同時(shí)，MaMYB3 還抑制了其它9個(gè)與淀粉降解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括MaSEX4、MaBAM7/8、MaAMY2B、MaAMY3、MaAMY3A、MaAMY3C、MaMEX1 和MapGlcT2-1。同時(shí)，與淀粉降解相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活子MabHLH6 的啟動(dòng)子活性也被MaMYB3 抑制。在番茄中異源過(guò)表達(dá)MaMYB3 會(huì)下調(diào)淀粉降解相關(guān)基因的表達(dá)水平，抑制淀粉降解并延遲果實(shí)成熟。因此，MaMYB3 可以通過(guò)直接結(jié)合并抑制淀粉降解相關(guān)基因的啟動(dòng)子，同時(shí)抑制淀粉降解相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活子編碼基因MabHLH6 的轉(zhuǎn)錄來(lái)負(fù)調(diào)控香蕉果實(shí)的成熟[25]。

在番茄果實(shí)中，Cao 等[26]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)依賴(lài)于EAR 基序的轉(zhuǎn)錄抑制子SlMYB70。SlMYB70 可以通過(guò)直接結(jié)合乙烯合成關(guān)鍵基因SlACS2 和SlACO3 的啟動(dòng)子區(qū)域并抑制其轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致乙烯生物合成受到抑制，進(jìn)而負(fù)調(diào)控番茄果實(shí)的成熟進(jìn)程。

在茄子果實(shí)中，利用VIGS 技術(shù)沉默Sm-MYB19 后，茄子果實(shí)中的花青素含量顯著增加，并且花青素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因CHI、F3GT、PAL、DFR、ANS、5GT、UFGT 的表達(dá)模式發(fā)生明顯改變，這說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子SmMYB19 可抑制茄子果實(shí)花青素的積累，從而調(diào)控茄子果實(shí)的成熟過(guò)程中的品質(zhì)形成[27-28]。

在柑桔果實(shí)中，R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子CrMYB68 可以直接結(jié)合CrBCH2 和CrNCED5 的啟動(dòng)子并抑制其轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化以及ABA 的生物合成受到抑制，從而負(fù)調(diào)控柑桔果實(shí)的成熟和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的形成[29]。CsMYB77 結(jié)構(gòu)上也屬于R2R3 類(lèi)MYB 轉(zhuǎn)錄因子，過(guò)表達(dá)CsMYB77 基因的柑桔果實(shí)破色時(shí)間延長(zhǎng)3 d，說(shuō)明其可能負(fù)調(diào)控柑桔果實(shí)的成熟進(jìn)程[30]。

在鴨梨果實(shí)中，轉(zhuǎn)錄因子PbMYB120 被認(rèn)為是一種潛在的花青素生物合成調(diào)節(jié)因子。Pb-MYB120 的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)抑制了花青素的積累和花色苷生物合成關(guān)鍵基因PbUFGT1 的表達(dá)。進(jìn)一步研究表明PbMYB120 可與PbUFGT1 的啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其啟動(dòng)子的活性，進(jìn)而負(fù)調(diào)控花色苷的生物合成。此外，PbMYB120 可能與花色苷轉(zhuǎn)錄激活因子協(xié)同作用，平衡鴨梨果實(shí)成熟進(jìn)程中的花色苷積累[31]。

1.3 MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子

MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物中，其在植物中行使多種重要的生物學(xué)功能，特別是在花器官發(fā)育，果實(shí)發(fā)育與成熟過(guò)程中[32]。MADS-box 結(jié)構(gòu)域通常位于MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子的N 末端，是MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合單元，負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子。MADSbox 蛋白間通常存在相互作用，可結(jié)合成同源二聚體，有時(shí)也能與其它蛋白或輔助因子結(jié)合形成異源二聚體[32]。與果實(shí)成熟及品質(zhì)形成相關(guān)的MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄抑制子在番茄中發(fā)現(xiàn)較多，下面主要介紹在番茄中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄抑制子。

轉(zhuǎn)錄因子SlMADS1 屬于SEPALLATA（SEP）亞家族。研究表明，SlMADS1 主要在番茄果實(shí)中表達(dá)，并且表達(dá)水平隨著果實(shí)的發(fā)育和成熟而逐漸降低。通過(guò)RNAi 技術(shù)沉默SlMADS1 后，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)成熟時(shí)間提前3～6 d，類(lèi)胡蘿卜素水平顯著提高，果實(shí)的乙烯生成量提高了約2～4 倍。果實(shí)成熟相關(guān)基因ACS2、ACO1、ACO3、E4 以及E8 基因表達(dá)量上升，兩個(gè)參與脅迫應(yīng)答的基因ERF1 和Pti4 表達(dá)水平下降，表明SlMADS1 在番茄果實(shí)成熟過(guò)程中起著負(fù)調(diào)控作用[33]。

轉(zhuǎn)錄因子SlFYFL 被證實(shí)是番茄果實(shí)成熟的負(fù)調(diào)控因子。在番茄中過(guò)表達(dá)SlFYFL 后，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)成熟延遲，類(lèi)胡蘿卜素積累減少，乙烯生物合成水平和乙烯響應(yīng)基因表達(dá)水平顯著下調(diào)。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因果實(shí)離層不能正常形成，并且離層發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)量下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)YFL 可以分別與RIN，MADS1 和JOINTLESS 相互作用，表明FYFL 可以通過(guò)與果實(shí)成熟和離層發(fā)育相關(guān)的MADS-box 蛋白相互作用來(lái)調(diào)控果實(shí)成熟進(jìn)程和離層的發(fā)育[34]。

MADS 家族轉(zhuǎn)錄因子SlMBP8 也以負(fù)調(diào)控因子的形式參與番茄果實(shí)成熟的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。與野生型番茄果實(shí)相比，SlMBP8 沉默的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的成熟時(shí)間縮短了2～4 d。轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的乙烯生成量和類(lèi)胡蘿卜素水平上升，乙烯合成途徑相關(guān)基因ACO1、ACO3、ACS2、ERF1、E4 和E8 和類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的關(guān)鍵基因PSY1、PDS和ZDS 的表達(dá)水平上調(diào)，細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因如PG，EXP，HEX，TBG4，XTH5 和XYL 的表達(dá)水平也同樣上調(diào)。這些結(jié)果表明SlMBP8 在果實(shí)成熟和軟化中起重要的負(fù)調(diào)控作用[35]。

轉(zhuǎn)錄因子SlSL4 也被認(rèn)為參與番茄果實(shí)成熟的負(fù)調(diào)控。在番茄果實(shí)中過(guò)表達(dá)SlSL4，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)成熟時(shí)間推遲，且轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中乙烯生物合成相關(guān)基因（ACO1、ACO3、ACS2）和成熟相關(guān)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因RIN 的表達(dá)水平在果實(shí)成熟階段被顯著下調(diào)，乙烯響應(yīng)基因（E4、E8、ERF1）的表達(dá)水平同樣下調(diào)，類(lèi)胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶基因PSY1 的表達(dá)水平在成熟前期顯著低于野生型果實(shí)，說(shuō)明SlSL4 基因可能通過(guò)抑制乙烯合成和類(lèi)胡蘿卜素合成途徑，從而負(fù)調(diào)控番茄果實(shí)的成熟[36]。

此外，在枇杷果實(shí)中，MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子EjMADS1 被發(fā)現(xiàn)可以結(jié)合參與木質(zhì)化調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活子EjMYB8 的啟動(dòng)子，并顯著抑制其活性。結(jié)合其表達(dá)模式與序列結(jié)構(gòu)信息，推測(cè)Ej-MADS1 是枇杷果實(shí)木質(zhì)素合成的轉(zhuǎn)錄抑制子[37]。

1.4 鋅指蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子

鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其結(jié)構(gòu)域是由鋅原子作為核心、半胱氨酸和組氨酸包圍鋅原子形成的穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)[38]。根據(jù)與鋅離子結(jié)合的半胱氨酸和組氨酸殘基數(shù)目，可分為C2H2、C2C2、C2HC、C2HC5、CCCH、C3HC4、C4、C4HC3、C6、C8 這10 種不同類(lèi)型。鋅指蛋白主要通過(guò)與DNA、RNA 結(jié)合以及與其它蛋白互作來(lái)激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，在植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[39]。

在番茄果實(shí)中，鋅指蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子SlCOL4 可作為果實(shí)成熟過(guò)程中ABA 和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)互作位點(diǎn)，且對(duì)果實(shí)成熟進(jìn)程起負(fù)調(diào)控作用。通過(guò)VIGS 沉默SlCOL4 可以促進(jìn)番茄果實(shí)成熟。與野生型果實(shí)相比，SlCOL4 沉默果實(shí)中乙烯合成通路上關(guān)鍵基因ACO1、ACS2 和ACS4的表達(dá)水平顯著上升，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子SlCOL4 在果實(shí)中通過(guò)負(fù)調(diào)控乙烯的生物合成對(duì)果實(shí)成熟過(guò)程起負(fù)調(diào)控作用[40]。

在香蕉果實(shí)中，MaDof23 也是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子，其可以與促進(jìn)香蕉果實(shí)成熟的轉(zhuǎn)錄激活子MaERF9 互作。同時(shí)，這兩個(gè)蛋白之間存在拮抗作用，競(jìng)爭(zhēng)MaEXP1/2/3/5、MaXET7、MaPG1、MaPME3等果實(shí)成熟相關(guān)基因的啟動(dòng)子位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控果實(shí)成熟過(guò)程中的細(xì)胞壁降解和香氣合成[41]。

2 轉(zhuǎn)錄后水平的負(fù)調(diào)控因子

2.1 MicroRNAs（miRNAs）類(lèi)負(fù)調(diào)控因子

miRNAs 是一類(lèi)擁有20～24 個(gè)核苷酸（或堿基對(duì)），可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控真核生物基因表達(dá)的特殊小分子非編碼RNA。在植物中，miRNAs 通過(guò)對(duì)含有高度互補(bǔ)序列的靶mRNA 進(jìn)行切割或翻譯抑制，進(jìn)而負(fù)調(diào)控靶mRNA 的進(jìn)一步表達(dá)[42]。成熟的miRNAs 來(lái)源于單鏈RNA 轉(zhuǎn)錄本，具有不完善的莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)[43]。這些二級(jí)結(jié)構(gòu)被DCL1 加工成細(xì)胞核中的miRNA 雙鏈，并被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中[44-45]，隨后miRNAs 被整合到RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 （RNA-induced silencing complex，RISC）中，RISC 利用miRNAs 作為向?qū)?lái)識(shí)別互補(bǔ)的靶mRNA，并通過(guò)降解或抑制其翻譯來(lái)負(fù)調(diào)控它們的表達(dá)[46-47]。植物miRNAs 參與多種重要的生物學(xué)過(guò)程，如葉片形態(tài)建成、花器官識(shí)別、逆境應(yīng)答以及果實(shí)成熟等[42]。

在柿子果實(shí)中，原花青素（Proanthocyanidin，PA）的生物合成受相關(guān)結(jié)構(gòu)基因控制，而這些結(jié)構(gòu)基因又受到一系列轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，例如PA 生物合成途徑中的轉(zhuǎn)錄激活子DkMYB19 和DkMYB20。miRNAs 是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子，在果實(shí)中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)miR858b會(huì)抑制DkMYB19、DkMYB20 以及PA 生物合成通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而負(fù)調(diào)控柿子果實(shí)成熟進(jìn)程中PA 的積累[48]。

在獼猴桃果實(shí)中，miR858 在花色苷生物合成和積累中起負(fù)調(diào)控作用。過(guò)表達(dá)miR858 使得獼猴桃果實(shí)的著色程度很低，且花青素的積累幾乎被完全阻斷。在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)miR858 可以靶向MYB-R2R3 型花色苷生物合成轉(zhuǎn)錄激活子AaMYBC1 的編碼基因，且miR858 過(guò)表達(dá)比AaMYBC1 沉默對(duì)獼猴桃果實(shí)著色的抑制作用更強(qiáng)。類(lèi)似的，在番茄果實(shí)中，miR858 通過(guò)抑制兩個(gè)MYB-R2R3 型轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)負(fù)調(diào)控番茄果實(shí)中的花色苷生物合成[49]。

在番茄果實(shí)中，過(guò)表達(dá)Sly-miR157 前體和成熟體基因均能顯著延緩Ailsa Craig 番茄果實(shí)的成熟進(jìn)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Sly-miR157 在體內(nèi)高豐度表達(dá)時(shí)，可直接對(duì)LeSPL-CNR mRNA 進(jìn)行切割，抑制LeSPL-CNR 基因表達(dá)和后續(xù)的蛋白翻譯。但當(dāng)Sly-miR157 表達(dá)量降低時(shí)，其僅在翻譯水平上抑制LeSPL-CNR 而不影響LeSPL-CNR mRNA 表達(dá)[50]。

2.2 長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）類(lèi)負(fù)調(diào)控因子

LncRNA 是長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA。LncRNA 可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后以及表觀遺傳水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而在染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)在已有的研究表明lncRNA 在應(yīng)對(duì)非生物和生物脅迫[51]、開(kāi)花[52]以及果實(shí)成熟[53]等過(guò)程中起重要作用。

在沙棘果實(shí)中，通過(guò)VIGS 沉默LNC1 會(huì)導(dǎo)致果實(shí)花青素含量增加和花青素生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因F3’H、DFR 和LDOX 的表達(dá)水平上升。同時(shí)，LNC1 的沉默也會(huì)導(dǎo)致miR156a 表達(dá)水平上升以及花青素合成負(fù)調(diào)控因子SPL9 表達(dá)水平下調(diào)?，F(xiàn)有的研究表明，miR156a 能抑制花青素生物合成途徑的轉(zhuǎn)錄抑制子SPL9 的豐度從而正調(diào)控花青素的合成過(guò)程[54]。因此，LNC1 可能通過(guò)抑制miR156a 的表達(dá)來(lái)增加轉(zhuǎn)錄因子SPL9 的豐度，從而負(fù)向調(diào)控花青素的合成和累積[55]。

在荔枝果實(shí)中，lncNAC13 能夠負(fù)調(diào)控花青素生物合成相關(guān)基因LcCHS1/2、LcCHI、LcF3H、LcF3’H、LcDFR 和LcMYB1 的表達(dá)，從而抑制荔枝果實(shí)成熟進(jìn)程中花青素的積累[56]。

3 翻譯后水平的負(fù)調(diào)控因子

在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，蛋白質(zhì)的泛素化修飾發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，包括參與調(diào)控細(xì)胞生命周期，激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和機(jī)體的損傷修復(fù)等幾乎一切生命活動(dòng)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)可以介導(dǎo)泛素化的靶蛋白選擇性降解，其中泛素通過(guò)3 種酶：泛素激活酶E1，泛素結(jié)合酶E2 和泛素連接酶E3 的作用與靶蛋白共價(jià)連接，泛素首先被E1 激活，活化的泛素被轉(zhuǎn)移至E2、E3 募集靶蛋白和泛素分子并將泛素轉(zhuǎn)移至靶蛋白，隨后泛素化的靶蛋白可被蛋白酶體降解，進(jìn)而形成多種生物學(xué)效應(yīng)[57]。

在香蕉果實(shí)中，通過(guò)蛋白互作驗(yàn)證試驗(yàn)和泛素降解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RING 類(lèi)E3 泛素連接酶MaXB3可與轉(zhuǎn)錄因子MaNAC2、乙烯生物合成途徑關(guān)鍵酶MaACS1 和MaACO1 互作，并通過(guò)26S 蛋白酶體途徑泛素化降解MaNAC2、MaACS1 和MaACO1，削弱MaNAC2 對(duì)成熟負(fù)調(diào)控因子MaERF11編碼基因的轉(zhuǎn)錄抑制能力和乙烯生物合成，進(jìn)而負(fù)調(diào)控香蕉果實(shí)的成熟進(jìn)程[58]。MaLUL2 基因編碼香蕉中的一個(gè)環(huán)狀E3 泛素連接酶，其在體外具有E3 泛素連接酶活性。在香蕉果皮中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)MaLUL2 提高了果實(shí)的泛素化水平，并導(dǎo)致了持綠表型，同時(shí)葉綠素降解代謝基因的表達(dá)下調(diào)。這表明MaLUL2 可能作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子調(diào)控香蕉果實(shí)成熟和葉綠素降解[59]。

在番茄果實(shí)中，F(xiàn)-box 蛋白SlAMR1 可能通過(guò)其保守結(jié)構(gòu)域F-box 構(gòu)成SCF E3 泛素連接酶（Skp1-Cul1-F-box 蛋白），進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能。在番茄中過(guò)表達(dá)SlAMR1 后，對(duì)轉(zhuǎn)基因果實(shí)做泛素表達(dá)水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其泛素表達(dá)水平上調(diào)，抗壞血酸的積累減少，而沉默SlAMR1 的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中抗壞血酸積累增多。這表明SlAMR1 可能通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑負(fù)調(diào)控番茄果實(shí)成熟過(guò)程中抗壞血酸的生物合成[60]。

在蘋(píng)果果實(shí)中，RING 型E3 泛素連接酶Md-MIEL1 可與蘋(píng)果花色苷生物合成和果實(shí)著色的關(guān)鍵正調(diào)節(jié)因子MdMYB1 的互作，并促進(jìn)MdMYB1泛素化降解，從而負(fù)調(diào)控蘋(píng)果果實(shí)花青素的積累[61]。同時(shí)，蘋(píng)果泛素E3 連接酶MdCOP1 也可以與MdMYB1 互作，并通過(guò)泛素化降解MdMYB1 蛋白來(lái)負(fù)調(diào)控蘋(píng)果果實(shí)成熟進(jìn)程中的果皮著色[62]。此外，SmCOP1 也可以在番茄果實(shí)成熟、類(lèi)胡蘿卜素積累以及乙烯生成等方面發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[63]。BTB 蛋白是CUL3-RING E3 連接酶和底物蛋白之間的橋梁，是蛋白泛素化降解途徑中的必要元件。MdMYB9 是蘋(píng)果果實(shí)花青素和原花青素生物合成途徑中的正調(diào)控因子，MdWRKY40 是創(chuàng)傷誘導(dǎo)的花色苷生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。MdBT2 可以與MdMYB9 和MdWRKY40 相互作用，并通過(guò)26S 蛋白酶體系統(tǒng)負(fù)調(diào)控MdMYB9 和Md-WRKY40 蛋白的豐度，進(jìn)而降低花色苷和原花色素相關(guān)基因的表達(dá)水平，減少蘋(píng)果果實(shí)成熟進(jìn)程中花色苷和原花色素的積累[64]。

在葡萄果實(shí)中，E3 連接酶VlPUB38 是葡萄果實(shí)成熟的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。在草莓中異源過(guò)表達(dá)VlPUB38 會(huì)導(dǎo)致草莓果實(shí)表現(xiàn)出顯著的成熟抑制表型，但外源ABA 處理可以使其恢復(fù)為正常的成熟表型。進(jìn)一步研究表明，VlPUB38 的U-box 保守結(jié)構(gòu)域具有泛素連接酶活性，其通過(guò)與ABA 生物合成途徑中的關(guān)鍵因子脫落醛氧化酶（VlAAO）相互作用，并通過(guò)26S 蛋白酶體系統(tǒng)靶向降解VlAAO，從而抑制ABA 的生物合成，進(jìn)而負(fù)調(diào)控葡萄果實(shí)的成熟過(guò)程[65]。

4 其它負(fù)調(diào)控因子

除轉(zhuǎn)錄因子和泛素化途徑相關(guān)蛋白外，部分其它蛋白也可以通過(guò)不同途徑參與果實(shí)成熟及品質(zhì)形成的負(fù)調(diào)控。乙烯受體蛋白ETR 是果實(shí)成熟的負(fù)調(diào)控因子，其通過(guò)激活下游的蛋白激酶CTR抑制乙烯信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而負(fù)調(diào)控果實(shí)成熟。沉默SlETR4 或SlETR6，可導(dǎo)致番茄果實(shí)提早成熟。位于ETR 下游的蛋白激酶CTR 也是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子，其通過(guò)使乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件EIN2 發(fā)生磷酸化抑制乙烯信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，從而負(fù)調(diào)控果實(shí)成熟[66]。利用VIGS 技術(shù)沉默番茄果實(shí)中的CTR1 基因，發(fā)現(xiàn)番茄果實(shí)CTR1 基因沉默部位提前成熟，證實(shí)了SlCTR1 對(duì)番茄果實(shí)成熟具有負(fù)調(diào)控作用[67]。此外，Polycomb-group（PcG）蛋白是一類(lèi)可以通過(guò)甲基化和泛素化等染色質(zhì)修飾來(lái)調(diào)控靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子。在番茄中，PcG 蛋白SlMSI1 通過(guò)負(fù)調(diào)控成熟相關(guān)基因（RIN，CNR、TDR4、ACS2、ACS4、PG、MAN4） 的表達(dá)來(lái)抑制果實(shí)成熟[68]。Han 等[69]發(fā)現(xiàn)高溫可以顯著加速草莓果實(shí)成熟的啟動(dòng)，且高溫條件下一系列果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)水平會(huì)迅速上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)草莓蛋白激酶基因FaSnRK2.6 可以抑制高溫誘導(dǎo)的成熟相關(guān)基因的表達(dá)，且成熟相關(guān)基因的表達(dá)水平始終與FaSnRK2.6 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，這表明FaSnRK2.6 可能負(fù)調(diào)控高溫誘導(dǎo)的草莓果實(shí)成熟。

DNA 甲基化修飾的相關(guān)因子可參與果實(shí)成熟及品質(zhì)形成的調(diào)控。DNA 甲基化修飾是DNA序列上的特定堿基在DNA 甲基化酶的作用下從S-腺苷甲硫氨酸獲得1 個(gè)甲基并與之共價(jià)結(jié)合的過(guò)程，該過(guò)程主要通過(guò)調(diào)控色素、芳香族化合物和植物激素生物合成以及細(xì)胞壁降解途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平來(lái)調(diào)控番茄、草莓、甜橙等各類(lèi)果實(shí)的成熟進(jìn)程[70-72]。利用VIGS 技術(shù)將甜椒中編碼甲基化酶的CaMET1-like1 基因沉默可以使辣椒果實(shí)成熟提前4～8 d，且可促進(jìn)六氫番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、葉黃素等在辣椒果實(shí)中的積累，說(shuō)明甲基化酶CaMET1-like1 是辣椒果實(shí)成熟的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子[73]。

植物激素在果實(shí)成熟和品質(zhì)形成的過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。例如GAs 通常被認(rèn)為可以抑制果實(shí)成熟[74]，而IAA 通常被認(rèn)為是非呼吸躍變型果實(shí)成熟的抑制因子，其通過(guò)拮抗ABA 的作用而對(duì)果實(shí)成熟起到負(fù)調(diào)控作用[75]。水楊酸可通過(guò)抑制乙烯生物合成關(guān)鍵酶ACO 的活性負(fù)調(diào)控乙烯的生物合成，進(jìn)而抑制果實(shí)成熟進(jìn)程[76]。此外，褪黑素作為一種重要的植物內(nèi)源激素，近年也被認(rèn)為是一種果實(shí)成熟的負(fù)調(diào)控因子，并廣泛應(yīng)用于延緩果實(shí)采后衰老，例如外源褪黑素處理可通過(guò)誘導(dǎo)提高荔枝果實(shí)的內(nèi)源褪黑素水平和抗氧化能力以延緩荔枝果實(shí)在常溫貯藏期間的衰老進(jìn)程，通過(guò)抑制芒果果實(shí)乙烯和脫落酸的生物合成延緩采后芒果果實(shí)的成熟進(jìn)程[77]。

植物體內(nèi)的生物活性分子NO 也是果實(shí)成熟過(guò)程中重要的負(fù)調(diào)控因子。在果實(shí)成熟過(guò)程中，NO 含量逐漸降低，同時(shí)伴隨著蛋白質(zhì)硝化和亞硝化水平的上升。而大量研究表明，外源NO 處理可有效延緩果實(shí)成熟，抑制果實(shí)冷害的發(fā)生，提高果實(shí)的抗病能力和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[78]。此外，NO 供體硝酸鹽也是柑桔果實(shí)成熟的負(fù)調(diào)控因子，其可以通過(guò)促進(jìn)葉綠素的生物合成并抑制類(lèi)胡蘿卜素的積累，進(jìn)而延遲柑桔果實(shí)破色[79]。

5 結(jié)語(yǔ)

植物果實(shí)具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制來(lái)精確調(diào)控果實(shí)成熟及品質(zhì)形成，以適應(yīng)各種發(fā)育和環(huán)境信號(hào)。對(duì)果實(shí)成熟及品質(zhì)形成調(diào)控的大量研究發(fā)現(xiàn)了一系列相關(guān)正調(diào)控因子，但研究也表明，果實(shí)的成熟及品質(zhì)形成過(guò)程中也受到諸多負(fù)調(diào)控因子的調(diào)控，這可能是植物為了平衡在相同代謝路徑中產(chǎn)生潛在的有毒物質(zhì)，降低對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的不良影響，或是降低果實(shí)成熟過(guò)程中物質(zhì)和能量的消耗，從而更好地適應(yīng)多變的環(huán)境。盡管目前關(guān)于負(fù)調(diào)控因子的研究取得了較大進(jìn)展，但仍然有很多科學(xué)問(wèn)題亟待解決，例如還有許多果實(shí)成熟與品質(zhì)形成的負(fù)調(diào)控因子尚未被發(fā)現(xiàn)、負(fù)調(diào)控因子與正調(diào)控因子協(xié)同作用的具體機(jī)制、負(fù)調(diào)控因子與正調(diào)控因子在特殊條件下的相對(duì)性等。因此，繼續(xù)挖掘相關(guān)負(fù)調(diào)控因子并深入研究其對(duì)果實(shí)成熟及品質(zhì)形成的調(diào)控機(jī)制具有重要的生物學(xué)意義，這有助于完善植物果實(shí)成熟及品質(zhì)形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)為深刻認(rèn)識(shí)植物的發(fā)育與適應(yīng)性進(jìn)化提供重要的參考。