基于代謝組學(xué)研究原花青素B1的腸道微生物代謝

劉若男，陳婉冰，朱曉玲，楊 宏，宋 哲*，劉 睿*

（1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430070 2 武漢市蜂產(chǎn)品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心 武漢 430070 3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430070 4 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 武漢 430073）

原花青素B1是膳食多酚黃烷-3-醇類化合物二聚體的典型代表（結(jié)構(gòu)見圖1），黃烷-3-醇類化合物基本組成單位的分子骨架是C6-C3-C6，即在兩個(gè)芳香環(huán)（A 環(huán)、B 環(huán)）之間以1 個(gè)三碳鏈的吡喃環(huán)（C 環(huán)）相連，形成最基本的黃烷-3-醇單體，再以此聚合形成黃烷-3-醇聚合物（即原花青素，包括二聚體、三聚體直至高聚體等）。原花青素分為A 型原花青素和B 型原花青素，B 型原花青素是基本結(jié)構(gòu)單元之間通過(guò)C4-C8 鍵或C4-C6 鍵連接而成，而A 型原花青素在C2-C7，C2-C5 之間形成醚鍵[1]。黃烷-3-醇類化合物分布廣泛，水果及其制品、豆類、堅(jiān)果、谷物、中草藥等都是黃烷-3-醇類化合物的重要來(lái)源[1-2]。許多國(guó)內(nèi)外研究都證明黃烷-3-醇類化合物在促進(jìn)健康方面發(fā)揮著重要作用，如：抗氧化、抗炎，預(yù)防心血管疾病、癌癥以及衰老相關(guān)的代謝綜合癥[3-4]。

圖1 黃烷-3-醇的結(jié)構(gòu)單元和原花青素B1 的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of flavan-3-ols unit and procyandin B1

自1964年，Griffiths 等[5]首次提出黃烷-3-醇類化合物的某些代謝產(chǎn)物的形成依賴于腸道菌群的作用后，研究者就對(duì)黃烷-3-醇類化合物的腸道微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了極大的興趣。盡管對(duì)黃烷-3-醇類化合物的代謝機(jī)制和生物利用度的認(rèn)識(shí)有了很大的進(jìn)步，然而，不同結(jié)構(gòu)黃烷-3-醇類化合物經(jīng)腸道微生物代謝的特征還不明確。黃烷-3-醇類化合物的結(jié)構(gòu)雖有一定的相似性，但代謝產(chǎn)物出現(xiàn)差異，比較兩種均以表兒茶素（Epicatechin，簡(jiǎn)寫為EC）聚合形成的B 型二聚體和A 型二聚體的腸道微生物體外模型代謝時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩者都發(fā)生C4-C8間黃烷鍵的早期斷裂和C 環(huán)的開環(huán)，且均存在不同的代謝產(chǎn)物，在A 型二聚體的代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到一種未知的代謝產(chǎn)物及更多的低分子質(zhì)量酚酸，而在B 型二聚體中未有類似的發(fā)現(xiàn)，這可能是由于這兩種二聚體經(jīng)歷了不同的降解途徑[6-7]。此外，黃烷-3-醇類化合物低聚體間存在生理活性及作用機(jī)制的差異，荔枝核黃酮干預(yù)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的研究發(fā)現(xiàn)，相比原花青素B4，原花青素A2是更為重要的Q-maker（中藥質(zhì)量標(biāo)志物）[8]。而原花青素B1在細(xì)胞炎癥[9-10]和激活交感神經(jīng)活動(dòng)[11]等方面具有重要意義。Nakagawa 等[12]發(fā)現(xiàn)EC 以及由EC 構(gòu)成的B 型二聚體 （原花青素B2）、B 型三聚體 （原花青素C1）、B 型四聚體（[EC（4β-＞8）]3-EC） 等分別通過(guò)不同的作用機(jī)制改善小鼠能量消耗，如：二聚體和四聚體顯著提高了血漿去甲腎上腺素，而三聚體在血漿兒茶酚胺水平和棕色脂肪組織解偶聯(lián)蛋白的表達(dá)等方面有顯著的改善效果。這些可能與上述黃烷-3-醇類化合物的代謝途徑和代謝特征密切相關(guān)。確定原花青素B1的腸道微生物代謝途徑與代謝產(chǎn)物，對(duì)于探究其生理活性意義重大。

現(xiàn)有黃烷-3-醇類化合物腸道微生物代謝機(jī)制的研究大都以其單體（兒茶素、表兒茶素等）展開，黃烷-3-醇單體經(jīng)腸道微生物群介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化后，產(chǎn)生5-碳環(huán)裂變代謝產(chǎn)物，如：5-（羥基苯基）-γ-戊內(nèi)酯和5-（羥基苯基）-γ-戊酸，進(jìn)而可降解為幾種酚酸，即苯丙酸、苯乙酸、苯甲酸和馬尿酸[13-14]。對(duì)于不同聚合度的二聚體、三聚體以及A 型結(jié)構(gòu)和B 型結(jié)構(gòu)的黃烷-3-醇類化合物的代謝與轉(zhuǎn)化機(jī)制鮮有報(bào)道。目前對(duì)于特定結(jié)構(gòu)黃烷-3-醇類化合物代謝產(chǎn)物的研究主要有原花青素A2[15]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯構(gòu)成的A 型二聚體[7]、表兒茶素構(gòu)成的三聚體（EC-（2β-＞7，4β-＞8）- EC-（4β-＞8）-EC）[15]、原花青素B2[16]，然而，這些研究均未完全明確代謝路徑。

體外模型是探究黃烷-3-醇類化合物代謝機(jī)制的有效方法，這種方法容易進(jìn)行，且母體化合物不受體內(nèi)吸收和代謝的影響，代謝物以相對(duì)高的濃度存在[17]?，F(xiàn)有的體外模擬研究主要以大鼠糞便、人類糞便展開，然而，Almeida 等[18]的研究證實(shí)盲腸菌群與糞便微生物群有很大不同，即使采用人類糞便標(biāo)本也不能準(zhǔn)確反映黃烷-3-醇類化合物在體內(nèi)經(jīng)盲腸微生物的代謝與轉(zhuǎn)化情況。有研究進(jìn)而提出豬盲腸模型，這是因?yàn)樨i相對(duì)于其它非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物而言，與人類更加相近，消化解剖學(xué)、生理和營(yíng)養(yǎng)上都存在相似之處，而且與結(jié)腸接近的一端盲腸被認(rèn)為對(duì)攝入的食物具有最高的發(fā)酵速率[19]。也有研究采用16S rRNA 寡核苷酸探針熒光原位雜交，證實(shí)豬盲腸的微生物群特征對(duì)人體腸道微生物代謝研究的適用性[20]。豬盲腸模型不失為研究食品成分的腸道微生物群代謝的比較理想的工具。

本研究目的是嘗試解析原花青素B1的代謝路徑。主要以豬盲腸微生物體外孵育為研究模型開展，采用TOF-MS/MS 檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的代謝產(chǎn)物，借助代謝組學(xué)分析方法，根據(jù)鑒定與篩選到的代謝產(chǎn)物，明確原花青素B1可能的代謝路徑。為揭示結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的黃烷-3-醇類膳食多酚的體內(nèi)代謝及調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原花青素B1（HPLC 純度98%），源葉生物科技有限公司；刃天青，上海伊卡生物公司；L-半胱氨酸，德國(guó)Biofrox 公司；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純），美國(guó)Thermo Scientific 公司；鹽酸、乙酸乙酯，上海滬試化工有限公司；配置厭氧培養(yǎng)基的化學(xué)試劑，均來(lái)自上海滬試化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOF 5600 高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，加拿大AB Sciex 公司；ULTIMATE 300 超高效液相色譜儀，美國(guó)Thermo Scitific 公司；855-AC 厭氧操作臺(tái)，美國(guó)PLAS LABS 公司；LC-DCY-12G 干式氮吹儀，上海立辰科技有限公司；BXM-30R 高壓滅菌鍋，上海博訊公司。

1.3 方法

1.3.1 豬盲腸微生物的獲取 從新鮮屠宰的豬中獲得所需的盲腸末端內(nèi)容物。豬年齡10～12 個(gè)月，屠宰過(guò)程中取得整個(gè)腸組織，立即放入?yún)捬醮?，并迅速帶回?shí)驗(yàn)室，在厭氧操作臺(tái)中解剖盲腸，取得盲腸末端內(nèi)容物，分裝于無(wú)菌離心管中，并在厭氧條件中稱重、標(biāo)記。最后在離心管中加入50%甘油、密封、保存于-80 ℃條件下。

1.3.2 厭氧培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)基的配置參考Ou 等[21]的方法，并進(jìn)行了改良。

配置厭氧基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）： NaHCO39.240、Na2HPO4·2H2O 3.542、NaCl 0.470、KCl 0.450、Na2SO4·10H2O 0.227、CaCl20.055、MgCl2·6 H2O 0.100、尿素0.400。

配置微量元素溶液 （mg/L）： FeSO4·7H2O 3 680、MnSO4·H2O 1 159、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O 120、CuSO4·5H2O 98、（NH4）6MO24·4H2O 17.4。

每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別加入10 mL 的微量元素溶液、0.5 mL 0.1%的C12H17NO4（刃天青，厭氧指示劑）、0.5 g L-半胱氨酸（還原劑），最后使用6 mol/L 鹽酸調(diào)pH 值至6.0～6.5。

將培養(yǎng)基放在連續(xù)氮?dú)鈿饬飨麓等舾尚r(shí)，以便排除培養(yǎng)基中的氣泡，直至厭氧指示劑變?yōu)闊o(wú)色，然后進(jìn)行高壓滅菌（121 ℃、20 min）。

1.3.3 原花青素B1與豬盲腸微生物共孵育培養(yǎng) 取出預(yù)先保存好的豬盲腸內(nèi)容物，將其放在37 ℃培養(yǎng)箱中復(fù)蘇。

以下所有操作均在厭氧操作臺(tái)中進(jìn)行，并且所有使用的工具均進(jìn)行了高壓滅菌處理。

根據(jù)盲腸內(nèi)容物的質(zhì)量，用1.3.2 節(jié)的厭氧培養(yǎng)基制備菌懸液，使菌懸液濃度為10 g/100 mL 厭氧培養(yǎng)基，搖勻菌懸液，依次用1 層紗布和4 層紗布進(jìn)行過(guò)濾。將過(guò)濾的菌懸液分成3 份，其中1 份進(jìn)行高壓滅菌處理（121 ℃、20 min）。

孵育過(guò)程設(shè)置3 個(gè)分組，具體如下：1）B1組：原花青素B1樣品以0.25 mmol/L 的濃度加入未滅菌的菌懸液中，混合均勻，分裝于小培養(yǎng)皿中，制備2 mL 的厭氧孵育培養(yǎng)基；2）滅菌組：原花青素B1樣品以0.25 mmol/L 的濃度加入已滅菌的菌懸液中，混勻并制備2 mL 孵育培養(yǎng)基；3）空白組：只含有未滅菌的菌液，混勻并制備2 mL 培養(yǎng)基。

擬定孵育過(guò)程中的6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0，2，4，6，10，18 h），每種處理與每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6 個(gè)平行，將所有培養(yǎng)基放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，在37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.4 發(fā)酵液樣品的處理 樣品的處理方法參考Ou 等[21]和Stoupi 等[22]擬定孵育過(guò)程中的6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0，2，4，6，10，18 h），將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平行樣品取出立即處理。使用6 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH 值，為停止微生物反應(yīng)使pH 值接近1，加入等量乙酸乙酯萃取，進(jìn)行3 次萃取并收集上清，氮?dú)饬鞔蹈缮锨逡?，密封保存?20 ℃），

1.3.5 孵育液代謝產(chǎn)物的分析 進(jìn)行孵育液代謝產(chǎn)物的分析前，取出被氮?dú)饬鞔蹈傻臉悠?，加? mL 70%甲醇復(fù)溶，過(guò)0.45 μm 有機(jī)濾膜，然后進(jìn)行UHPLC-TOF-MS/MS 分析，分析方法參考Chen等[23]液質(zhì)條件如下：

TOF-MS/MS 分析條件：使用電噴霧電離模式（ESI-），離子噴射電壓為-4 500 mV，-60 V 電壓，毛細(xì)管溫度為550 ℃，鞘氣流速為55 Arb，輔助氣流速為35 Arb，全掃描TOF MS 模式中滯留時(shí)間為250 ms，MS/MS 模式下滯留時(shí)間為 70 ms，掃描質(zhì)量范圍（m/z）為100～1 500。

液相分析條件： 采用Thermo Hypersil GOLD C18 （100 mm×2.1 mm，1.9 μm） 色譜柱，柱溫30℃。A 相為0.2%甲酸水溶液，B 相為色譜純乙腈，分析采用梯度洗脫。具體的洗脫條件如下：0 min，5% B、3 min，5% B、10 min：30% B、25 min，40%B、26 min，5% B；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 非靶向代謝組學(xué)分析代謝產(chǎn)物： 使用Progenesis QI 軟件 （Waters，美國(guó)）對(duì)UHPLC-TOF-MS/MS 原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、峰對(duì)齊、歸一化等處理。

使用Ezinfo 進(jìn)行采用主成分分析 （PCA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）和變量重要性投影分析（VIP）來(lái)篩選各組間具有顯著差異的代謝物。對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行帕累托標(biāo)度后進(jìn)行PCA 分析，考察無(wú)監(jiān)督模式下各組差異。進(jìn)而分別選取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)B1組/滅菌組、B1組/空白組進(jìn)行OPLSDA 分析篩選組間差異代謝產(chǎn)物，篩選條件為：選擇協(xié)方差|p（1）|＞0.05、最小OPLS-DA 載荷系數(shù)|pcorr（1）|＞0.5、VIP ＞1.5，同時(shí)P＜0.05（雙因素方差分析）。將各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異性代謝產(chǎn)物合并，使用人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù) （HMDB）（http：//www.hmdb.ca/）及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)其進(jìn)行解譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素B1 與豬盲腸微生物孵育后的代謝組學(xué)研究

首先，采用主成分分析法（PCA）進(jìn)行代謝組學(xué)研究，該模型的第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）占個(gè)體變異的45.9%。結(jié)果顯示滅菌組與空白組和B1組形成顯著的差異（見圖2）。滅菌組幾乎不隨孵育過(guò)程發(fā)生明顯變化，而空白組和B1組隨孵育時(shí)間的增加，孵育樣品中代謝產(chǎn)物也在不斷地發(fā)生變化，PCA 得分圖顯示了各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品具有良好的聚類。

圖2 原花青素B1 在豬盲腸微生物培養(yǎng)中的代謝組學(xué)變化（n=6）Fig.2 Metabolomics changes of procyandin B1 incubation with pig cecum microbiota （n=6）

為了進(jìn)一步說(shuō)明原花青素B1的代謝與腸道菌群的關(guān)系，將微生物作為因變量，計(jì)算PCA 圖中滅菌組和B1組的歐氏距離（圖3），B1組由于微生物的代謝作用持續(xù)發(fā)生變化，滅菌組在0～18 h變化不顯著，兩組樣品的代謝產(chǎn)物之間的差異在2 h 時(shí)表現(xiàn)差異（P＜0.01），并且在6 h 時(shí)這種差異達(dá)到最大。經(jīng)過(guò)豬盲腸菌群孵育后，原花青素B1代謝組學(xué)產(chǎn)生的顯著變化是因微生物的作用而引起的。

圖3 PCA 圖中滅菌組和B1 組的歐式距離Fig.3 The Euclidean distance of the sterilized group and the B1 group in PCA diagram

為了篩選原花青素B1產(chǎn)生的主要差異代謝產(chǎn)物，我們采用監(jiān)督多變量統(tǒng)計(jì)分析OPLS-DA 對(duì)各個(gè)時(shí)間段各組間代謝物進(jìn)行篩選，從6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)中分別篩選出64，88，88，83，70，100 個(gè)差異性成分，合并后共有205 個(gè)。

2.2 原花青素B1 的差異代謝產(chǎn)物鑒定

基于HMDB 數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)OPLS-DA 和VIP 篩選得到的所有代謝物進(jìn)行解析，共解析出21 種差異代謝物，結(jié)果見表1。

表1 原花青素B1 代謝組學(xué)分析中鑒定的代謝產(chǎn)物的MS 信息Table 1 The MS information of deference metabolites in the metabolomics analysis of procyanidin B1

這些化合物在孵育18 h 期間的動(dòng)態(tài)變化在熱圖（圖5）中顯示，顏色深淺反映了這些代謝物的標(biāo)準(zhǔn)化豐度變化，該豐度由質(zhì)譜峰進(jìn)行l(wèi)og2 轉(zhuǎn)化后的平均豐度值計(jì)算得到。

上述解譜所得到的代謝產(chǎn)物主要分為3 類。

第一類是具有完整C6-C3-C6 分子骨架的代謝產(chǎn)物，主要包括兒茶素和原花青素B1及其衍生化代謝產(chǎn)物，這一部分的鑒定主要依賴于原花青素B1的特征碎片：m/z 577.1242 [M-H]-、m/z 451.0929[經(jīng)歷雜環(huán)裂解途徑后（HRF heterocyclic ring fission）形成]、m/z 425.0855 [由RDA （Retro Diels-Alder reaction） 途徑形成]、m/z 407.0750 [經(jīng)歷RDA 途徑，并脫去一分子H2O 形成]、m/z 289.0739[C15H13O6]-[24-25]。具體有6 種：兒茶素（Catechin）、原花青素B1（Procyanidin B1）、原花青素B1水合物（Procyanidin B1·2H2O）、原花青素B1·二硫酸鹽（Procyanidin B1·2 sulfate）、二水合-3'/4'--甲氧基-原花青素B1-硫酸鹽（3'/4'-O-methyl procyanidin B1sulfate·H2O）、二水合-3'/4'-甲氧基原花青素B1（3'/4'-O-methyl procyanidin B1·2H2O）。大多數(shù)原花青素B1都經(jīng)過(guò)了水合化、甲基化和硫酸鹽化的作用。原花青素易發(fā)生的這類衍生化，在原花青素B2的代謝研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)[25]。這幾種代謝產(chǎn)物在B1組和滅菌組中均有出現(xiàn)。這表明可能不是微生物的作用導(dǎo)致了這一變化，可能是與培養(yǎng)基的相互作用自發(fā)形成的。在60 ℃的水溶液中，（-）-表兒茶素、（-）-兒茶素、原花青素B2等都自發(fā)地發(fā)生了異構(gòu)和聚合等化學(xué)變化[26]。

第二類是基本骨架中C 環(huán)開環(huán)的代謝產(chǎn)物，這類化合物是黃烷-3-醇類化合物代謝途徑中的關(guān)鍵步驟，在本研究中僅發(fā)現(xiàn)了1 種，即1-（3'，4' -二羥基苯基）-3-（2''，4''，6''-二羥苯基）-2-丙醇（1-（3'，4'-Dihydroxyphenyl）-3-（2''，4''，6''-dihydroxyphenyl）-2-propan-ol 簡(jiǎn)寫為DHP-OL），m/z 為：291.0870 [C15H15O6]-。

第三類代謝產(chǎn)物完全失去了C6-C3-C6 分子骨架，它們主要是通過(guò)離子碎片和HMDB 比對(duì)完成鑒定工作，這類化合物共有14 種：5-（3'，4'-二羥基苯基）-γ-戊內(nèi)酯（5-（3，'4'-Dihydroxyphenyl）-γ-valerolactone）、4-羥基-5-（4'-羥基苯基）-戊酸 （4-（Hydroxyphenyl）-5-（4'-Hydroxy）valeric acid）、苯甲酸（Benzoic acid）、3-羥基苯甲酸（3-Hydroxybenzoic acid）、4-羥基苯甲酸（4-Hydroxybenzoic acid）、鄰苯二酚（Pyrocatechol）、4-羥基異戊酸（4-Hydroxyisovaleric acid）、3，4-二羥基扁桃酸 （3，4-Dihydroxymandelic acid）、異阿魏酸（Isoferulic acid）、3-苯丙酸 （3-Phenylpropionic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、3-甲氧基苯甲酸（3-Methoxybenzoic acid）、3-羥基苯丙酸 （3-Hydroxyphenylpropanoic acid）、3，4-二羥基苯丙酸（3，4-Hydroxyphenylpropanoic acid）。其中苯基戊內(nèi)酯、苯甲酸、3-羥基苯甲酸也被鑒定為原花青素二聚體的主要代謝產(chǎn)物[27-29]。熱圖（圖4）中差異性酚酸代謝產(chǎn)物主要是苯甲酸、4-羥基苯甲酸、3-羥基苯丙酸、3-苯丙酸和異阿魏酸等。

圖4 原花青素B1 與豬盲腸菌群孵育過(guò)程中主要差異代謝物的變化Fig.4 Changes of major difference metabolites that procyandin B1 incubation with pig cecum microflora

2.3 主要代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化

主要代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化見圖5。

圖5 豬盲腸微生物降解過(guò)程中構(gòu)成中原花青素B1 主要代謝Fig.5 Changes in main metabolites of procyandin B1 produced by pig ceum microbial degradation

原花青素B1的含量隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，豐度逐漸降低，在2 h 時(shí)50%的原花青素B1消失，在6 h 時(shí)基本消耗殆盡，這一代謝過(guò)程速度相當(dāng)快。同樣地，在Van't 等[30]的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)，他們也使用了豬盲腸微生物體外代謝模型，研究顯示2 h 內(nèi)62%的原花青素B5被分解，之后降解率降低，但是仍然幾乎在4 h 內(nèi)完全消失；而原花青素B2也是在4 h 內(nèi)幾乎完全降解。原花青素A2與豬盲腸微生物群孵育6 h 后，約80%的原花青素A2消失[15]，這些都表明黃烷-3-醇二聚體能被腸道微生物以較高的速率進(jìn)行代謝。但是在0 h 時(shí)，B1組和滅菌組的母體化合物豐度差異較大，這一現(xiàn)象可能與原花青素B1形成硫酸鹽有關(guān)，0 h 時(shí)，B1組形成硫酸鹽衍生物的比例高于滅菌組，可能是未高壓滅菌的培養(yǎng)基更容易發(fā)生與硫酸鹽的結(jié)合。原花青素B1與其硫酸鹽衍生物的豐度之和在0 h 是趨于相等。我們的研究中整個(gè)孵育過(guò)程中滅菌組的母體化合物也同樣在逐漸降低，這一現(xiàn)象同樣在原花青素B2腸道菌群孵育中出現(xiàn)，VAN'T SLOT[31]的研究發(fā)現(xiàn)在滅菌的菌懸液中孵育原花青素二聚體8 h 后，接近50%二聚體消失，卻未形成任何代謝產(chǎn)物，研究者將這種現(xiàn)象解釋為原花青素B2與培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的結(jié)合。原花青素二聚體、三聚體等低聚物的生物利用度因其與蛋白的相互作用受到影響[32]。

雖然B 型原花青素的腸道微生物機(jī)制未被明確，但是其與腸道微生物共孵育過(guò)程中黃烷鍵斷裂形成黃烷-3-醇單體一直被認(rèn)為是其微生物代謝的代表路徑之一，本研究中發(fā)現(xiàn)了兒茶素的產(chǎn)生，但是對(duì)于B1的初始豐度來(lái)說(shuō)，相當(dāng)于僅有4%左右的B1通過(guò)形成單體兒茶素的途徑發(fā)生了代謝。此前就有報(bào)道指出，原花青素B2與人類糞便菌群孵育過(guò)程中只有不到10%的B2通過(guò)斷裂黃烷鍵這一途徑代謝[33]。本研究中表兒茶素在2～4 h之間豐度最高，4 h 之后基本消失。事實(shí)上，Aura等[34]發(fā)現(xiàn)單體黃烷-3-醇的代謝速度很快，1 μmol黃烷-3-醇單體在10 mL 5%的糞便懸浮液發(fā)酵體系中2 h 內(nèi)就可以完全代謝。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，在0 h 時(shí)滅菌組也出現(xiàn)了兒茶素，這可能是由于自然降解或者孵育基質(zhì)引起的化學(xué)降解。Van't等[31]在沒食子兒茶素沒食子酸酯的滅菌組中也檢測(cè)到少量沒食子酸和沒食子酸兒茶素，孵育基質(zhì)的復(fù)雜性使我們不得不考慮到這種可能性。

DHP-OL 和5-（3'，4'-二羥基苯基）-γ-戊內(nèi)酯也被檢出，它們也是原花青素經(jīng)過(guò)體內(nèi)微生物代謝過(guò)程中的關(guān)鍵性產(chǎn)物。DHP-OL 在18 h 時(shí)達(dá)到峰值，5-（3'，4'-二羥基苯基）-γ-戊內(nèi)酯在2 h時(shí)達(dá)到峰值，由此可見5-（3'，4'-二羥基苯基）-γ-戊內(nèi)酯不一定只能經(jīng)歷C 環(huán)開環(huán)途徑后形成，更容易由原花青素結(jié)構(gòu)單元直接裂解形成，并且這一過(guò)程非常迅速。Serra 等[29]在一項(xiàng)兒茶素的體外發(fā)酵研究中，發(fā)現(xiàn)在孵育24 h 后仍然有兒茶素開環(huán)產(chǎn)物存在，在孵育48 h 后仍然有5-（3'，4'-二羥基苯基）-戊內(nèi)酯存在，由此他們認(rèn)為形成兒茶素開環(huán)產(chǎn)物的途徑與形成5-（3'，4'-二羥基苯基）-戊內(nèi)酯的途徑是兩個(gè)平行但不獨(dú)立的代謝途徑，可以同時(shí)產(chǎn)生，兒茶素開環(huán)產(chǎn)物和兒茶素都可以直接形成5-（3'，4'-二羥基苯基）-γ-戊內(nèi)酯。本研究中苯基戊內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化率僅有1.5%，已有研究表明兒茶素和表兒茶素轉(zhuǎn)化為羥基苯基戊內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化率最高可以達(dá)到22%，而原花青素低聚體的轉(zhuǎn)化非常有限，僅為單體轉(zhuǎn)化率的1/10[35]。在空白組中從0 h 開始，整個(gè)孵育過(guò)程中都有少量的5-（3'，4'-二羥基苯基）-γ-戊內(nèi)酯出現(xiàn)，這可能與豬盲腸樣品中殘留的纖維發(fā)酵有關(guān)[29]。

3-羥基苯丙酸、苯甲酸和4-羥基苯甲酸產(chǎn)生峰值的時(shí)間大約是6 h。3-羥基苯丙酸的出現(xiàn)時(shí)間主要在4～10 h；苯甲酸和4-羥基苯甲酸主要出現(xiàn)在4～18 h，含量高于5-（3'，4'-二羥基苯基）-γ-戊內(nèi)酯，說(shuō)明苯甲酸和4-羥基苯甲酸的形成不依賴于5-（3'，4'-二羥基苯基）-γ-戊內(nèi)酯和4-羥基-5-（4'-羥基苯基）-戊酸等上游代謝產(chǎn)物。Stoupi等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)基于原花青素B2上部結(jié)構(gòu)單元A 環(huán)裂解或C 環(huán)裂解形成了5-（2'，4'-二羥基）苯基-2-烯戊酸、5-（3'，4'-二羥基苯基） 戊酸、3-羥基苯丙酸和苯乙酸，因此原花青素二聚體上部結(jié)構(gòu)單元可以直接裂解形成酚酸，本研究中苯甲酸和4-羥基苯甲酸的大量形成可能是基于原花青素B1上部結(jié)構(gòu)單元的裂解。

2.4 原花青素B1 的腸道微生物路徑

根據(jù)原花青素B1非靶向代謝組學(xué)分析，推測(cè)原花青素B1的代謝路徑見圖6。

圖6 原花青素B1 的代謝途徑Fig.6 The metabolic pathway of procyandin B1

早期代謝路徑1： 原花青素B1首先經(jīng)歷黃烷鍵斷裂，下部結(jié)構(gòu)形成兒茶素，兒茶素進(jìn)一步發(fā)生C 環(huán)開環(huán)，形成開環(huán)產(chǎn)物（DHP-OL），進(jìn)一步代謝為5-（3'，4'-二羥基-苯基-）-γ-戊內(nèi)酯。

早期代謝路徑2： 原花青素B1下部結(jié)構(gòu)單元經(jīng)歷A 環(huán)裂解形成苯基戊內(nèi)酯。路徑1 和路徑2可以同時(shí)進(jìn)行。

早期代謝路徑3： 本研究中可能存在原花青素B1上部結(jié)構(gòu)單元裂解直接形成酚酸類化合物的路徑，這可能是導(dǎo)致酚酸類化合物在原花青素B1代謝產(chǎn)物占主導(dǎo)的原因。

晚期代謝路徑： 主要是5-（3'，4'-二羥基-苯基-）-γ-戊內(nèi)酯繼續(xù)代謝為4-羥基-5-（4'-羥基苯基）-戊酸。其次，晚期代謝路徑中α-氧化、β-氧化引起的側(cè)鏈縮短和脫羥基作用也很重要，使苯基戊酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為3，4-二羥基苯丙酸、3-羥基苯丙酸、4-羥基苯甲酸和苯甲酸等。

3 結(jié)論

通過(guò)代謝組學(xué)的分析方法，在豬盲腸微生物體外代謝研究中篩選和鑒定到21 種與原花青素B1直接相關(guān)的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化顯示：原花青素B1經(jīng)過(guò)腸道菌群的代謝相當(dāng)快速，基本在6 h 時(shí)消耗殆盡；相應(yīng)地，代謝產(chǎn)物兒茶素和5-（3'，4'-二羥基苯基）-γ-戊內(nèi)酯在2～4 h 之間大量產(chǎn)生，此外，苯丙酸和苯甲酸等在6 h達(dá)到峰值，在4～18 h 之間持續(xù)產(chǎn)生。對(duì)原花青素B1的代謝路徑的解析表明：原花青素B1可能通過(guò)3 種路徑進(jìn)行代謝，分別是：經(jīng)歷黃烷鍵斷裂，下部結(jié)構(gòu)形成兒茶素，兒茶素進(jìn)一步發(fā)生C 環(huán)開環(huán)，形成兒茶素開環(huán)產(chǎn)物；原花青素B1下部結(jié)構(gòu)單元經(jīng)歷A 環(huán)裂解形成苯基-γ-戊內(nèi)酯；原花青素B1上部結(jié)構(gòu)單元裂解直接形成酚酸類化合物。本研究可為揭示結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的黃烷-3-醇類膳食多酚的體內(nèi)代謝以及對(duì)體內(nèi)各種代謝綜合征的調(diào)控提供代謝方面的理論依據(jù)。

致謝：

武漢中糧肉食品有限公司以及陳鵬老師和其同事在論文寫作過(guò)程中給予了非常大的幫助，在此，表示由衷的感謝。