基于Hedgehog信號(hào)通路探討血清NGF、BGLAP及PGS在顱腦損傷后加速骨折愈合的作用機(jī)制*

李 暉，李海冰，劉欣哲，張 華

(1.河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院骨科 054099；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，石家莊 050000)

早在1960年，臨床醫(yī)生就觀察到伴有顱腦損傷的肢體骨折患者骨折處骨痂形成更快、體積更大，且后續(xù)眾多基礎(chǔ)研究和臨床研究均證實(shí)顱腦損傷對(duì)肢體骨折愈合具有加速作用，這可能與顱腦損傷后血清和腦脊液中釋放的多種激素、細(xì)胞因子或相關(guān)神經(jīng)因子對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)[1-3]。顱腦損傷可能會(huì)激活某些原本在胚胎時(shí)期調(diào)控骨發(fā)生的關(guān)鍵元件，誘導(dǎo)組織分化，促進(jìn)骨形成。骨折愈合主要依靠骨形成作用，而骨形成是由多種因素調(diào)節(jié)的復(fù)雜而有序的過程。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多條與骨代謝密切相關(guān)的信號(hào)通路，但顱腦損傷后骨折愈合的具體機(jī)制尚不明確。Hedgehog信號(hào)通路不僅參與胚胎發(fā)育，還與成骨細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)，近年來(lái)眾多研究表明其參與骨形成的調(diào)控作用[4-6]，但是目前研究多為體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，臨床研究鮮有報(bào)道。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最具有代表性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在大腦中分布廣泛和高度表達(dá)，在顱腦損傷后，NGF可被釋放至外周，可能參與顱腦損傷后骨折愈合[7]。前列腺素(prostaglandins，PGS)是花生四烯酸的環(huán)氧產(chǎn)物，可以由體內(nèi)多種細(xì)胞通過自分泌和旁分泌方式釋放，其表達(dá)水平受中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控和機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)影響，且參與骨代謝[8]。顱腦損傷會(huì)激活機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，影響中樞神經(jīng)相關(guān)調(diào)控，顱內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子外泄入外周血液循環(huán)系統(tǒng)，NGF和PGS可能參與顱腦損傷后骨折愈合。而骨鈣素(bone gla protein，BGLAP)是骨形成標(biāo)志物，是反映骨折愈合的最直接標(biāo)志物。本研究擬通過臨床研究，觀察顱腦損傷后骨折加速愈合過程中NGF、PGS、BGLAP及Hedgehog信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，并探討之間是否存在聯(lián)系，以期為顱腦損傷后加速骨折愈合的機(jī)制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2020年1月在河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院就診的138例因車禍導(dǎo)致的新鮮閉合性股骨干骨折患者為研究對(duì)象，其中男84例，女54例，年齡20～72歲，平均(32.66±5.35)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲；(2)新鮮閉合性股骨干骨折；(3)臨床資料完整；(4)研究組通過磁共振成像(MRI)確定為創(chuàng)傷性腦損傷；(5)與家屬談話，已獲得知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)特重型顱腦損傷[格拉斯哥昏迷(GCS)評(píng)分<6分]；(2)合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病；(3)合并糖尿病；(4)合并自身免疫性疾?。?5)合并惡性腫瘤。根據(jù)是否合并顱腦損傷分為研究組(60例)和對(duì)照組(78例)。研究組為顱腦損傷合并股骨干骨折患者，男35例，女25例；年齡20～70歲，平均(33.47±6.68)歲；骨折分型A1 18例，A2 27例，A3 15例；顱腦損傷輕度19例，中度33例，重度8例。對(duì)照組為單純股骨干骨折患者，男49例，女29例；年齡22～72歲，平均(31.68±7.12)歲；骨折分型A1 25例，A2 44例，A3 19例。兩組性別、年齡、骨折分型等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，本研究已獲得河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1治療方法

研究組患者先行開顱血腫清除，然后根據(jù)具體情況進(jìn)行額、顳極切除或去骨瓣減壓術(shù)，在顱腦情況穩(wěn)定后轉(zhuǎn)入河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院骨科進(jìn)行骨折治療。兩組患者均根據(jù)具體情況進(jìn)行切開復(fù)位內(nèi)固定手術(shù)或帶鎖髓內(nèi)固定手術(shù)，術(shù)后進(jìn)行常規(guī)康復(fù)訓(xùn)練。

1.2.2觀察指標(biāo)

術(shù)后4、8、12周進(jìn)行X線片檢查，觀察骨折愈合情況并測(cè)量骨痂面積，骨痂面積=2π×(R2-r2)×L，其中R代表骨痂半徑，r代表股骨干半徑，L代表骨痂長(zhǎng)度，記錄并比較兩組愈合時(shí)間。分別于術(shù)后1 d及術(shù)后1、4、8、12周抽取患者外周靜脈血5 mL于促凝管中，室溫放置30 min，3 500 r/min離心取上清液，采用ELISA檢測(cè)血清NGF、BGALP、PGS、印度豪豬蛋白(Indian hedgehog，Ihh)和鋅指轉(zhuǎn)錄因子1(Gli family zinc finger protein 1，Gli1)水平，試劑盒由上海江萊生物科技有限公司提供，所有操作嚴(yán)格參照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 骨痂和愈合時(shí)間比較

研究組愈合時(shí)間為(11.69±1.47)周，對(duì)照組愈合時(shí)間為(14.02±1.83)周，兩組愈合時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組術(shù)后4、8、12周骨痂面積比較，研究組均大于對(duì)照組，經(jīng)組間、時(shí)間點(diǎn)和組間·時(shí)間點(diǎn)交互效應(yīng)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組術(shù)后不同時(shí)間骨痂面積比較

2.2 Hedgehog通路相關(guān)蛋白比較

術(shù)后1 d至術(shù)后12周研究組Ihh、Gli1表達(dá)水平均高于對(duì)照組，組間、時(shí)間點(diǎn)和組間·時(shí)間點(diǎn)交互效應(yīng)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、3。

表2 兩組術(shù)后不同時(shí)間血清Ihh水平比較

表3 兩組術(shù)后不同時(shí)間血清Gli1水平比較

2.3 NGF、PGS、BGLAP水平比較

術(shù)后1 d至術(shù)后12周研究組血清NGF、PGS、BGLAP水平均高于對(duì)照組，組間、時(shí)間點(diǎn)和組間·時(shí)間點(diǎn)交互效應(yīng)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4～6。

表4 兩組術(shù)后不同時(shí)間血清NGF水平比較

表5 兩組術(shù)后不同時(shí)間血清PGS水平比較

表6 兩組術(shù)后不同時(shí)間血清BGLAP水平比較

2.4 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析表明，血清NGF、BGLAP、PGS水平與骨痂面積均呈正相關(guān)(P<0.05)；血清Ihh、Gli1水平與血清NGF、BGLAP、PGS水平及骨痂面積也均呈正相關(guān)(P<0.05)，見表7。

表7 血清NGF、PGS、BGLAP水平與骨痂面積、Ihh、Gli1水平的相關(guān)性分析(n=138)

3 討 論

目前，臨床仍有不少比例的復(fù)雜骨折或粉碎性骨折患者因高能量創(chuàng)傷、感染或治療不當(dāng)?shù)榷喾N原因?qū)е麻L(zhǎng)骨骨缺損、骨不連或骨不愈合，對(duì)于這類患者臨床尚無(wú)特效治療方法，主要以手術(shù)治療為主。但手術(shù)治療不僅給患者帶來(lái)巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且常常仍難以達(dá)到理想效果，這仍然是臨床骨科的難題之一。顱腦損傷與骨折愈合之間的聯(lián)系被報(bào)道已久，臨床已經(jīng)證實(shí)顱腦損傷患者的長(zhǎng)骨骨折表現(xiàn)出更快的愈合速度，這為難愈性骨折和骨缺損的治療帶來(lái)了新思路。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后肢體骨折出現(xiàn)異常增生可能與其體內(nèi)的顱腦損傷后多條通路途徑激活和相關(guān)因子調(diào)節(jié)有關(guān)[9]，已有體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)聚焦于探究顱腦損傷后骨折加速愈合的機(jī)制，但目前尚不完全清楚。Hedgehog信號(hào)通路是近年來(lái)新提出的骨折愈合通路，本研究擬通過臨床研究探討Hedgehog信號(hào)通路是否與顱腦損傷后骨折加速愈合相關(guān)，并分析相關(guān)促愈合因子的相關(guān)性。

Hedgehog信號(hào)通路參與包括骨代謝和骨形成在內(nèi)的人體多種代謝調(diào)控。Hedgehog基因于1980年在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，因該基因突變會(huì)導(dǎo)致果蠅呈刺猬狀而被命名，包括音速豪豬蛋白(sonic hedgehog，Shh)、沙漠豪豬蛋白(desert hedgehog，Dhh)和Ihh 3種亞型。在人體中，這3種蛋白分別在發(fā)育的不同時(shí)期被分泌，Shh主要在胚胎時(shí)期參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，Dhh主要負(fù)責(zé)調(diào)控外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，Ihh主要負(fù)責(zé)骨代謝。Ihh通過與其特異性受體跨膜蛋白受體(patched，PTC)結(jié)合來(lái)激活G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，進(jìn)一步發(fā)生級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，激活下游轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白(Gli)的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮促進(jìn)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的功能[10-11]。本研究中術(shù)后4周開始，研究組骨痂面積明顯大于對(duì)照組，這種差距隨著時(shí)間的推移愈加明顯，且研究組愈合時(shí)間較對(duì)照組明顯縮短，說(shuō)明顱腦損傷會(huì)加速股骨干骨折愈合。同時(shí)跟蹤Ihh和Gli1兩種蛋白，發(fā)現(xiàn)研究組術(shù)后蛋白水平均明顯高于對(duì)照組，且研究組在術(shù)后4周Ihh和Gli1均已經(jīng)達(dá)到峰值并一直保持在較高水平，而對(duì)照組在術(shù)后8周Ihh才到達(dá)峰值，且Ihh和Gli1一直保持在較低水平。這提示顱腦損傷后Hedgehog信號(hào)通路呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，這可能是其加速骨折愈合的原因。

顱腦損傷后腦脊液泄露到外周循環(huán)，目前普遍認(rèn)為外泄的腦源性因子具有骨誘導(dǎo)性，可能參與骨形成作用。NGF是大腦中代表性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在兔創(chuàng)傷性腦損傷合并脛骨骨折模型中被發(fā)現(xiàn)能刺激骨形成[12]，在骨折大鼠中同樣發(fā)現(xiàn)注射外源性NGF能加速骨折愈合[13]，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NGF培養(yǎng)能刺激成骨細(xì)胞分化[14]。王斌等[15]在大鼠骨折模型中采用NGF聯(lián)合血小板衍生因子進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)NGF能通過促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管生成從而達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的作用。本研究中研究組血清NGF水平均明顯高于對(duì)照組，同時(shí)檢測(cè)骨形成標(biāo)志物BGLAP發(fā)現(xiàn)，研究組血清BGLAP水平也明顯高于對(duì)照組，且其變化趨勢(shì)與NGF一致，這表明研究組骨形成速度高于對(duì)照組，提示顱腦損傷導(dǎo)致的NGF水平提高可能是促進(jìn)骨折愈合的關(guān)鍵。這可能是因?yàn)轱B腦損傷后NGF可以透過血腦屏障進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)骨折處，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，加速骨形成作用。

除了NGF，PGS近年來(lái)也被發(fā)現(xiàn)能加速骨形成和骨改建。研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后血清花生四烯酸水平明顯提高，花生四烯酸是PGS的前體，可通過生成PGS來(lái)上調(diào)BGLAP表達(dá)來(lái)，促進(jìn)骨細(xì)胞增殖，加速骨礦化，被認(rèn)為是腦損傷和骨折愈合之間的橋梁[16]。PGS具有刺激骨形成作用，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明其能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[17]；體內(nèi)試驗(yàn)也表明PGS能增加骨基質(zhì)形成，提高骨組織鈣化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，提高骨愈合速度[18]。本研究中，研究組術(shù)后血清PGS水平明顯高于對(duì)照組，這可能是由于顱腦損傷后機(jī)體中樞神經(jīng)上調(diào)PGS表達(dá)，也可能是顱腦損傷引起的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致PGS升高。雖然其具體機(jī)制尚不清楚，但作者發(fā)現(xiàn)PGS的變化趨勢(shì)與Ihh、Gli1、NGF和BGLAP基本一致，研究組不僅表現(xiàn)出更高的表達(dá)水平，并在更早的時(shí)間達(dá)到峰值，提示這可能與其促進(jìn)骨愈合相關(guān)。本研究進(jìn)一步進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血清NGF、BGLAP、PGS水平與骨痂面積呈正相關(guān)(P<0.05)，血清Ihh、Gli1水平與血清NGF、BGLAP、PGS水平及骨痂面積也呈正相關(guān)(P<0.05)。

綜上所述，本研究經(jīng)過臨床研究發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后兩種促進(jìn)骨形成的因子NGF和PGS，骨形成標(biāo)志物BGLAP，Hedgehog通路相關(guān)蛋白Ihh和Gli1表達(dá)水平均升高，且其相互之間均存在正相關(guān)關(guān)系，提示Hedgehog通路上調(diào)可能會(huì)通過級(jí)聯(lián)放大影響下游NGF和PGS水平，進(jìn)一步促進(jìn)骨形成，加速骨愈合，但其具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。