替格瑞洛對急性心肌梗死小鼠心肌的保護作用及機制研究*

宋占春，陳 亮，何廉旗，張 迪，任智超，張 建

(遼寧省撫順市中心醫(yī)院：1.心內(nèi)科；2.普通外科 113006)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一種突發(fā)嚴重的缺血性心臟病，嚴重威脅著人類生命健康。心肌梗死部位炎癥細胞的浸潤與活化在AMI過程中發(fā)揮重要作用，尤其以巨噬細胞浸潤為主[1]。替格瑞洛(ticagrelor)是一種新型血小板抑制劑，通過和P2Y12受體結合，抑制血小板活性，防止冠心病患者發(fā)生血栓事件，但目前對替格瑞洛的其他藥理功能仍知之甚少[2-3]。據(jù)報道，替格瑞洛可抑制巨噬細胞中NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎癥小體的激活，進而抑制炎癥反應的發(fā)展[4]。在AMI中，通過抑制巨噬細胞浸潤和NLRP3炎癥小體激活可明顯改善心肌功能，發(fā)揮對AMI的治療作用[5-6]。研究表明，P2Y12受體被抑制可促進血管平滑肌細胞自噬，進而改善動脈粥樣硬化進程[7]。而在AMI中，促進心肌細胞自噬可緩解疾病進程[8]。推測替格瑞洛可能通過影響NLRP3炎癥小體激活和細胞自噬作用調(diào)節(jié)巨噬細胞浸潤在AMI中發(fā)揮保護作用。因此，本實驗對替格瑞洛在小鼠AMI模型中的作用開展研究，以期為臨床開發(fā)治療AMI的有效藥物提供新的方向和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8周齡雄性C57BL/6小鼠30只(遼寧長生生物技術股份有限公司)，體重22～22 g；替格瑞洛(T125095)；小鼠肌鈣蛋白(cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ)ELISA檢測試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β、IL-18 ELISA試劑盒[聯(lián)科集團(中國)有限公司]；CD68抗體、P62抗體、pro-IL-1β(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；NLRP3抗體、半胱天冬酶-1(caspase-1)抗體、cleaved IL-1β抗體、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)抗體、Beclin-1抗體、p62抗體、β-actin抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠AMI模型建立及藥物干預

將8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為5組：假手術組(sham組)、AMI組、替格瑞洛治療組、替格瑞洛預處理組、替格瑞洛預處理+治療組。除sham組外，其余各組小鼠均采用左前降支冠狀動脈結扎的方法建立AMI模型。小鼠術前禁食禁水12 h后，麻醉，剃胸毛，消毒。切開皮膚，用鈍器剝離肌肉，切開心包，露出心臟。結扎冠狀動脈左前降支，觀察到結扎端蒼白，表明結扎成功。替格瑞洛治療組建模成功后每天同一時間給予替格瑞洛(27 mg/kg)，灌胃7 d；替格瑞洛預處理組于建模前7 d每天同一時間給予替格瑞洛(27 mg/kg)，灌胃7 d；替格瑞洛預處理+治療組于建模前7 d至建模后7 d持續(xù)每天同一時間給予替格瑞洛(27 mg/kg)灌胃。sham組和AMI組為對照組，給予與實驗組等量生理鹽水灌胃。到達時間點后取小鼠血清、心肌組織，并統(tǒng)計心臟質(zhì)量和小鼠體重。

1.2.2超聲心動圖檢測

采用美國GE Voluson E8四維彩超儀對各組小鼠進行超聲心動圖檢測，計算心臟功能相關指標，包括左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、短軸縮短率(FS)、射血分數(shù)(EF)。

1.2.3ELISA檢測cTnⅠ水平、CK-MB和LDH活性

將各組小鼠全血室溫放置2 h后，1 000×g離心20 min，獲得血清標本。參考ELISA試劑盒說明書，檢測血清cTnⅠ水平、CK-MB和LDH活性。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色

對心肌組織切片進行常規(guī)HE染色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片。于顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.2.5心肌組織炎癥指標檢測

取小鼠心肌組織，冰浴勻漿后，1 000×g離心10 min，取上清液進行檢測。按照ELISA試劑盒說明書，檢測小鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-18表達水平。

1.2.6免疫熒光染色

將心肌組織脫水包埋切片。使用山羊血清室溫封閉15 min，加入一抗(1∶100稀釋)4 ℃孵育過夜。次日，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，滴加熒光二抗(1∶200稀釋)室溫孵育60 min，PBS清洗后，晾干，蓋玻片封片。于熒光顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.2.7Western blot檢測蛋白水平

取小鼠心肌組織，冰上研磨后，于細胞裂解液靜置30 min，12 000 r/min，4 ℃，離心20 min，上清液為蛋白質(zhì)抽提物。采用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量，40 μg蛋白上樣，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h后，放入一抗，4 ℃孵育過夜。次日，辣根過氧化物酶標記IgG(IgG-HRP)二抗室溫孵育45 min后，電化學發(fā)光法(ECL)底物發(fā)光，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標條帶光密度值。

1.2.8透射電鏡觀察

將心肌組織于電鏡固定液固定后，依次進行室溫脫水、滲透包埋、聚合、超薄切片。于2%醋酸鈾飽和乙醇溶液避光染色8 min，70%乙醇及超純水各清洗3次，2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min；超純水清洗后，室溫干燥過夜。于透射電子顯微鏡下觀察染色效果，鏡下采集圖像分析。

1.2.9統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 替格瑞洛對AMI小鼠模型心臟功能的影響

與sham組相比，造模成功后AMI組小鼠心臟LVIDd、LVIDs均明顯增加(P<0.01)，F(xiàn)S、EF均明顯降低(P<0.01)。與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預處理組和替格瑞洛預處理+治療組上述指標均出現(xiàn)不同程度恢復(P<0.05或P<0.01)，其中，替格瑞洛預處理+治療組恢復效果優(yōu)于替格瑞洛治療組和替格瑞洛預處理組(P<0.01)，見表1。

表1 小鼠超聲心電圖各參數(shù)結果比較

與sham組相比，AMI組小鼠血清cTnⅠ水平、CK-MB和LDH活性及心臟質(zhì)量/體重比值均明顯增加(P<0.01)。與AMI組相比，替格瑞洛預處理組和替格瑞洛預處理+治療組上述指標均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，替格瑞洛治療組除心臟質(zhì)量/體重比值，其余各項指標均明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 小鼠血清cTn I水平、CK-MB和LDH活性及心臟質(zhì)量/體重比值比較

2.2 替格瑞洛對AMI小鼠模型心肌組織病理變化的影響

HE染色可見AMI組小鼠心肌組織肌纖維結構排列紊亂，大量炎癥細胞浸潤。與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預處理組和替格瑞洛預處理+治療組小鼠心肌組織炎癥細胞減少，結構排列更整齊，其中替格瑞洛預處理+治療組變化最明顯，見圖1A～E。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色結果顯示，與sham組相比，AMI組小鼠心肌組織梗死面積明顯增大；與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預處理組和替格瑞洛預處理+治療組小鼠心肌組織梗死面積均出現(xiàn)不同程度的減小，其中，替格瑞洛預處理組和替格瑞洛預處理+治療組小鼠梗死面積減少更明顯，見圖1F。

A：sham組小鼠心肌組織HE染色(200×)；B：AMI組小鼠心肌組織HE染色(200×)；C：替格瑞洛治療組小鼠心肌組織HE染色(200×)；D：替格瑞洛預處理組小鼠心肌組織HE染色(200×)；E組：替格瑞洛預處理+治療組小鼠心肌組織染色(200×)；F：小鼠心肌組織TTC染色。

2.3 替格瑞洛對AMI小鼠模型心肌組織炎癥因子的影響

ELISA檢測結果顯示，與sham組相比，AMI組小鼠心肌組織炎癥因子IL-18、IL-1β和TNF-α表達水平明顯升高(P<0.01)。與AMI組比較，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預處理組和替格瑞洛預處理+治療組上述指標表達水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，其中，替格瑞洛預處理+治療組變化最明顯，替格瑞洛預處理組次之，見圖2。

A：IL-18水平；B：IL-1β水平；C：TNF-α水平；a：P<0.01，與sham組相比；b：P<0.05，c：P<0.01，與AMI組相比；d：P<0.05，e：P<0.01，與替格瑞洛治療組相比；f:P<0.01，與替格瑞洛預處理組相比。

2.4 替格瑞洛對AMI小鼠模型心肌組織巨噬細胞的影響

免疫熒光結果顯示，與sham組相比，AMI組小鼠心肌組織CD68陽性細胞數(shù)目明顯增多。與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預處理組和替格瑞洛預處理+治療組CD68陽性細胞數(shù)目明顯減少，其中替格瑞洛預處理+治療組變化最明顯，見圖3。

圖3 各組小鼠心肌組織CD68表達情況(IF，400×)

2.5 替格瑞洛對AMI小鼠模型心肌組織NLRP3炎癥小體通路相關蛋白的影響

Western blot結果顯示，與sham組相比，AMI組小鼠心肌組織NLRP3、cleaved caspase-1、pro-IL-1β和cleaved IL-1β表達水平明顯增加(P<0.01)。與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預處理組和替格瑞洛預處理+治療組上述蛋白表達水平均呈不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，其中替格瑞洛預處理+治療組變化最明顯，替格瑞洛預處理組次之，見圖4。

A：蛋白條帶圖；B：蛋白相對表達水平柱狀圖；a：P<0.01，與sham組相比；b：P<0.05，c：P<0.01，與AMI組相比；d：P<0.01，與替格瑞洛治療組相比；e：P<0.01，與替格瑞洛預處理組相比。

2.6 替格瑞洛對AMI小鼠模型心臟組織自噬的影響

免疫熒光結果顯示，與sham組相比，AMI組p62陽性細胞數(shù)目明顯增多；與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預處理組和替格瑞洛預處理+治療組p62陽性細胞數(shù)目明顯減少，其中替格瑞洛預處理+治療組變化最明顯，見圖5。

圖5 各組小鼠心肌組織p62表達情況(IF，400×)

Western blot檢測結果顯示，與sham組相比，AMI組p62表達水平明顯增加(P<0.01)，而LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表達水平有所增加，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預處理組和替格瑞洛預處理+治療組LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表達水平均明顯增加(P<0.01)，而p62表達水平明顯降低(P<0.01)，其中替格瑞洛預處理+治療組變化最明顯，替格瑞洛預處理組次之，見圖6。

A：蛋白條帶圖；B：蛋白相對表達水平柱狀圖；a：P<0.01，與sham組相比；b：P<0.01，與AMI組相比；c：P<0.05，d：P<0.01，與替格瑞洛治療組相比；e：P<0.05，f：P<0.01，與替格瑞洛預處理組相比。

電鏡結果顯示，與AMI組比較，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預處理組和替格瑞洛預處理+治療組小鼠心肌細胞自噬小體數(shù)量均呈不同程度的增加，見圖7。

圖7 各組小鼠心肌細胞自噬小體數(shù)量的變化情況(電鏡，40 000×)

3 討 論

AMI是冠心病常見的急重病，嚴重危害患者生命健康[9]。P2Y12受體拮抗劑替格瑞洛是AMI中抗血栓治療的一線用藥[10]。CHEN等[11]發(fā)現(xiàn)，替格瑞洛通過抑制NLRP3炎癥小體途徑而不依賴P2Y12受體在糖尿病心肌病小鼠中發(fā)揮抗炎作用。NLRP3炎癥小體途徑是機體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，當該途徑被激活時，NLRP3與其他蛋白相互作用精細調(diào)節(jié)caspase-1激活，而活化的caspase-1(cleaved caspase-1)通過剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，產(chǎn)生具有致炎活性的IL-1β和IL-18，進而激活其他免疫細胞，誘導更多的趨化因子和炎癥因子的合成，放大炎癥反應[12]。自噬是體內(nèi)重要的細胞內(nèi)過程，用于回收和去除受損蛋白質(zhì)和細胞器，以及破壞細胞內(nèi)病原體[13]。研究表明，自噬可通過多種機制調(diào)節(jié)NLRP3小體途徑的激活，是炎癥小體的主要調(diào)節(jié)因子[14-16]。因此，自噬功能障礙可導致炎癥小體過度激活，包括NLRP3。研究證實，心肌細胞炎癥反應和細胞自噬在AMI發(fā)病機制中占重要地位[17-20]。

為了探究替格瑞洛在AMI中潛在的作用，本研究采用結扎左前降支冠狀動脈的方法建立AMI小鼠模型，分別在造模前后不同時間給予替格瑞洛治療。結果發(fā)現(xiàn)，替格瑞洛可保護心肌免受損傷，使LVIDd、LVIDs明顯降低，F(xiàn)S、EF明顯增加，血清cTnⅠ水平降低，CK-MB和LDH活性降低，心臟的臟器系數(shù)(心臟質(zhì)量/體重)降低，心肌組織炎癥細胞浸潤明顯減少，心臟梗死面積明顯減小。同時，本研究發(fā)現(xiàn)替格瑞洛可明顯降低心肌組織中促炎細胞因子IL-18、IL-1β和TNF-α表達，抑制CD68蛋白(巨噬細胞蛋白標志物)表達，表明替格瑞洛可能通過抑制促炎細胞因子釋放和巨噬細胞浸潤在AMI中發(fā)揮抗炎作用。進一步對NLRP3途徑相關蛋白進行檢測發(fā)現(xiàn)，替格瑞洛可明顯降低NLRP3、cleaved caspase-1、pro-IL-1β和cleaved IL-1β表達，表明替格瑞洛可通過抑制NLRP3炎癥小體途徑的激活進而抑制心肌組織炎癥反應。同時，為探究替格瑞洛是否干預AMI模型中心肌細胞自噬水平，本研究通過免疫熒光實驗檢測發(fā)現(xiàn)AMI模型小鼠心肌組織中有大量的p62分布，而應用替格瑞洛干預后發(fā)現(xiàn)，替格瑞洛抑制p62在心肌組織的分布，同時Western blot定量結果也顯示了替格瑞洛可促進LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1表達，抑制p62表達。最后，通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)替格瑞洛干預后自噬小體明顯增多，結果均表明替格瑞洛可通過促進AMI模型心肌細胞自噬而發(fā)揮保護作用。此外，在上述全部實驗結果中，替格瑞洛預處理+治療組干預AMI效果最好，替格瑞洛預處理組次之，表明替格瑞洛對AMI的防治意義重大。

綜上所述，本研究初步驗證了替格瑞洛具有抗炎、促進自噬、改善梗死心臟功能和形態(tài)的作用，為AMI疾病的預防和治療提供了理論基礎和治療見解。本研究的不足之處在于：(1)未進行細胞水平實驗探究替格瑞洛作用于心肌細胞的具體分子機制；(2)未設立NLRP3激動劑組及自噬抑制劑組進行挽救實驗，進一步探究替格瑞洛的防治效果；(3)未闡明NLRP3炎癥小體途徑和細胞自噬之間的crosstalk機制。今后可在此基礎上進一步深入實驗，以探索和闡明替格瑞洛對AMI的保護作用機制。