小鼠腎小管上皮細(xì)胞來源外泌體改善膿毒癥腎臟損傷炎癥反應(yīng)的研究

徐志育 朱永 田佳 李娜 宋海

微生物感染及免疫失衡與化膿性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其內(nèi)在機(jī)制尚未明確[1-2]。相關(guān)研究表明，免疫細(xì)胞的持續(xù)組織浸潤可觸發(fā)細(xì)胞分泌囊泡的生物合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞外囊泡包括外泌體(EXO)分泌增加[3]。EXO是一種直徑約為50～100 nm的囊泡。近年來，隨著EXO介導(dǎo)組織修復(fù)作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)有些EXO可進(jìn)入細(xì)胞并通過刺激中性粒細(xì)胞從而抑制細(xì)胞炎癥[4-5]。然而，仍缺乏有關(guān)腎臟中EXO對(duì)膿毒癥影響的研究證據(jù)。因此，本研究將探討腎小管上皮細(xì)胞(mRTEC)來源外泌體(mRTEC-EXO)對(duì)膿毒癥小鼠腎臟的炎癥損傷和中性粒細(xì)胞浸潤的影響。

材料與方法

1.材料：EXO分離試劑(美國Invitrogen 4478359)、杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、脂多糖(LPS)均購于美國Sigma公司。胚胎腎(EK)細(xì)胞和mRTEC均購于美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)。兔抗-分化抗原簇(CD)9、CD63、鈣聯(lián)接蛋白(CANX)、髓過氧化物酶(MPO)的蛋白抗體均購于美國Abcam公司。

2.方法

(1)制備mRTEC-EXO：mRTEC用DMEM常規(guī)培養(yǎng)。收集傳代第4代mRTEC的培養(yǎng)上清液，轉(zhuǎn)移至高速離心管中，在4 ℃、2 000 g下離心30 min后取上清液1，轉(zhuǎn)移至新的高速離心管中，加入EXO分離試劑(上清液1∶分離試劑=2∶1)，于渦旋儀(美賽默飛世爾公司)上充分混合后，置于4 ℃冰箱中孵育過夜。次日在4 ℃、10 000 g下離心60 min，棄上清液，將其懸浮在4 ℃的100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中作為EXO懸浮液，并保存在-80 ℃冰箱中，即為mRTEC-EXO。

(2)mRTEC-EXO的表征：按照透射電鏡平臺(tái)工作協(xié)議和指示使用透射電子顯微鏡觀察EXO的形態(tài)并拍照。采用動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)測(cè)量EXO的粒徑和電勢(shì)。

(3)EK細(xì)胞與mRTEC-EXO共培養(yǎng)：室溫下將EK細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%PBS和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，濕度為95%，CO2濃度為5%。將mRTEC-EXO用細(xì)胞膜紅色熒光探針(DiL)染色30 min，用PBS洗滌，于10 000 g持續(xù)離心60 min后，將其與培養(yǎng)的1×104/ml的EK細(xì)胞共孵育1、2和4 h后用細(xì)胞核染色劑4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色10 min，用PBS清洗后并通過共聚焦顯微鏡觀測(cè)EXO是否被EK細(xì)胞攝取。

(4)動(dòng)物分組：84只SPF C57BL/6小鼠購于海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)心[使用許可證號(hào)：SYXK(瓊)2021-0013]，自由飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為對(duì)照組[腹腔注射生理鹽水(NS)180 mg/kg]、LPS組(腹腔注射LPS 15 mg/kg)、LPS+mRTEC-EXO組(腹腔注射LPS 15 mg/kg同時(shí)尾靜脈注射mRTEC-EXO 8 mg/kg)，每組28只。NS注射后或LPS干預(yù)12 h后，隨機(jī)處死各組小鼠均12只并收集新鮮腎臟組織，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。每組剩余的16只小鼠進(jìn)行正常飲食、飲水飼養(yǎng)，繼續(xù)觀察至150 h，記錄每組小鼠存活情況。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得我院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

(5)小鼠腎臟炎癥情況和中性粒細(xì)胞浸潤情況：使用10%的福爾馬林固定小鼠腎臟組織，經(jīng)石蠟包埋，并行常規(guī)切片，厚度為5 μm，對(duì)切片使用HE及免疫組化染色，觀察腎小管、腎小球形態(tài)變化和腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤程度。用MPO表達(dá)水平評(píng)估中性粒細(xì)胞的浸潤程度。

(6)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：采用Western blot檢測(cè)mRTEC-EXO中EXO陽性標(biāo)志物(CD9和CD63)、EXO陰性標(biāo)志物(Calnexin)及3組小鼠腎臟組織中MPO、丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β的表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.EXO的表征：透射電子顯微鏡下mRTEC-EXO呈現(xiàn)圓形膜結(jié)構(gòu)，mRTEC-EXO是直徑為91.8～115.4 nm的微囊泡(圖1A、B)，粒徑分布的峰尺寸為104.8 nm。EXO的Zeta電勢(shì)為(-23.09±2.90)mV。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，mRTEC-EXO表面標(biāo)記物CD9和CD63呈高表達(dá)，而陰性標(biāo)志物Calnexin呈低表達(dá)(圖2)。

2.EK細(xì)胞對(duì)mRTEC-EXO的攝取情況：mRTEC-EXO DiL染色后呈綠色(圖3A)，EK細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后其細(xì)胞核呈藍(lán)色(圖3B)。EK細(xì)胞和mRTEC-EXO共培養(yǎng)后，采用共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，EK細(xì)胞可主動(dòng)攝取mRTEC-EXO(圖3C)。

圖1 透射電子顯微鏡下的mRTEC-EXO(×10 000)

圖2 Western blot檢測(cè)小鼠腎臟組織中CD9、CD63及Calnexin的表達(dá)水平

圖3 EK細(xì)胞對(duì)mRTEC-EXO的攝取情況(A:mRTEC-EXO,DiL染色;B:EK細(xì)胞核，DAPI染色；C：mRTEC-EXO被EK細(xì)胞攝取，合并DiL與DAPI染色；×400)

3.3組小鼠生存率比較：對(duì)照組小鼠的生存率為100%，LPS組小鼠給藥后150 h內(nèi)生存率為25.0%，基本集中在72 h內(nèi)死亡。LPS+mRTEC-EXO組小鼠給藥后60 h內(nèi)無死亡，生存率為62.5%。對(duì)照組小鼠生存率均高于LPS組和LPS+mRTEC-EXO組，LPS+mRTEC-EXO組生存率高于LPS組(P<0.05)。

4.3組小鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β、MDA表達(dá)水平比較：3組小鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β、MDA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，LPS組和LPS+mRTEC-EXO組小鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β和MDA表達(dá)水平均明顯升高；與LPS組比較，LPS+mRTEC-EXO組TNF-α、L-1β和MDA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β、MDA表達(dá)水平比較

5.3組小鼠炎癥情況比較：與對(duì)照組比較，LPS組及LPS+mRTEC-EXO組小鼠腎臟組織炎性細(xì)胞浸潤特征明顯增加；與LPS組比較，LPS+mRTEC-EXO組小鼠腎臟組織炎性細(xì)胞浸潤特征明顯降低。見圖4。

圖4 3組小鼠腎臟組織病理檢查結(jié)果(A：對(duì)照組；B:LPS組；C:LPS+mRTEC-EXO組；HE染色，×200)

圖5 Western blot檢測(cè)3組小鼠腎臟組織中MPO的表達(dá)水平

6.3組小鼠腎臟組織中MPO表達(dá)水平比較：3組小鼠腎臟組織中MPO表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，LPS組小鼠腎臟組織中MPO表達(dá)水平均明顯升高，與LPS組比較，LPS+mRTEC-EXO組小鼠腎臟組織中MPO表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見表2、圖5、圖6。

圖6 3組小鼠腎臟組織MPO表達(dá)(A：對(duì)照組；B LPS組；C：LPS+mRTEC-EXO組；免疫組化染色，×200)

表2 3組小鼠腎臟組織中MPO表達(dá)水平比較

討 論

既往研究表明，LPS腹腔注射1周內(nèi)小鼠生存率由100%降低至0%～25%，其中死亡多集中在72 h以內(nèi)[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS組小鼠的150 h生存率降至25.0%。而在LPS基礎(chǔ)上靜脈注射mRTEC-EXO后可明顯改善小鼠生存率，且LPS+mRTEC-EXO組和LPS組小鼠的生存率與對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明mRTEC-EXO具有提高LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠生存率的作用。

既往研究已證實(shí)功能損傷的器官數(shù)量與膿毒癥的病死率之間密切相關(guān)[8]。本研究病理染色結(jié)果也顯示小鼠腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷和炎性細(xì)胞浸潤；而在LPS基礎(chǔ)上使用mRTEC-EXO改善了小鼠膿毒癥對(duì)腎臟組織的傷害作用，說明mRTEC-EXO可能在改善膿毒癥損傷中發(fā)揮積極作用。

為了探究mRTEC-EXO緩解腎臟組織傷害和炎癥浸潤的原因，我們驗(yàn)證腎細(xì)胞對(duì)EXO的吸收效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mRTEC分泌的EXO可被EK細(xì)胞良好攝取，表明腎臟組織可受腎小管細(xì)胞EXO影響從而減輕組織傷害。相關(guān)研究表明EXO水平升高與TNF-α和IL-6水平升高呈正相關(guān)，這表明EXO在膿毒癥的炎癥反應(yīng)中扮演重要角色[9]。TNF-α和IL-1β的釋放是早期膿毒癥的特征之一，其中TNF-α是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)釋放，對(duì)于引發(fā)內(nèi)毒素性休克具有重要意義；IL-1β作為炎癥早期的另一重要細(xì)胞因子，可促進(jìn)有毒代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而損傷組織、器官。已有研究顯示降低這些炎癥細(xì)胞因子的釋放對(duì)于緩解膿毒癥的進(jìn)展、降低膿毒癥患者及膿毒癥動(dòng)物模型的病死率具有重要意義[10]。本研究中mRTEC-EXO抑制了LPS誘導(dǎo)后的TNF-α和IL-1β水平升高。研究證實(shí)，LPS增加了膿毒癥小鼠血清的EXO，但當(dāng)使用EXO治療后，LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β、IL-6釋放明顯減少，表明EXO治療不僅減少了膿毒癥引起小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，還延長了生存率[9]。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，可反映細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的程度及細(xì)胞的損傷程度[11]，本研究結(jié)果同樣顯示LPS聯(lián)合mRTEC-EXO顯著增加了小鼠的生存期，并降低了MDA的水平。上述結(jié)果表明，mRTEC-EXO可能通過減弱細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化進(jìn)而減緩細(xì)胞損傷。

在膿毒癥發(fā)展過程中，多種重要臟器過度招募浸潤中性粒細(xì)胞是導(dǎo)致膿毒癥致死的重要原因之一[12]。MPO是一種由中性粒細(xì)胞在炎癥過程中因吞噬作用而分泌的酶，既往研究中MPO常被用于反映中性粒細(xì)胞臟器浸潤程度的指標(biāo)[13]。本研究中LPS促進(jìn)了腎臟中MPO表達(dá)水平，而當(dāng)mRTEC-EXO聯(lián)合LPS時(shí)，MPO的表達(dá)水平明顯降低，表明mRTEC-EXO可抑制中性粒細(xì)胞大量浸潤從而抑制膿毒癥的進(jìn)展。

在膿毒癥的狀態(tài)下，細(xì)菌可釋放出大量的LPS，進(jìn)入血液后會(huì)迅速引起急性腎損傷。因此，本研究使用LPS誘發(fā)膿毒癥，為確保膿毒癥引起的遠(yuǎn)端器官(如腎臟)損傷的臨床研究價(jià)值，在LPS誘導(dǎo)條件下一旦使用mRTEC-EXO處理小鼠，其病情惡化明顯好轉(zhuǎn)。因此推測(cè)mRTEC-EXO中攜帶的大量功能性蛋白或核酸是減緩小鼠腎臟炎癥損傷加快的關(guān)鍵原因，因?yàn)橐延写罅垦芯孔C實(shí)EXO攜帶有功能性和抗病性遺傳信息[14-15]。因此，根據(jù)既往研究和本研究結(jié)果，我們認(rèn)為對(duì)膿毒癥小鼠持續(xù)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞EXO分泌的措施，可能是減輕膿毒癥晚期的免疫失調(diào)和遠(yuǎn)端腎臟損傷的有效策略。然而，仍需進(jìn)一步設(shè)計(jì)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究mRTEC-EXO抑制膿毒癥促進(jìn)炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞浸潤的機(jī)制。

綜上所述，膿毒癥小鼠體內(nèi)注射mRTEC-EXO可抑制腎臟炎癥損傷和中性粒細(xì)胞浸潤。因此，膿毒癥進(jìn)展過程中注射mRTEC-EXO可能是一種有效的治療策略。