CAR-T治療急性髓系白血病的研究進展

吳卓琳 梅恒 胡豫

急性髓系白血病(AML)是一種以髓系造血干/祖細胞異常增殖和分化障礙為主要特征的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是成人急性白血病中最常見、病死率最高的一種[1]。即使接受了標(biāo)準(zhǔn)的聯(lián)合化療療程，年齡<60歲的AML患者5年生存率為40%～55%，而年齡≥60歲的患者5年生存率僅有10%～15%[2]。目前造血干細胞移植(HSCT)仍是唯一可能使患者獲得長期緩解甚至治愈的治療手段[3]。然而HSCT并不適用于老年及身體狀況較差的患者，因此迫切需要探索新的治療方法。靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)治療為B淋巴細胞系惡性腫瘤患者帶來了新的希望，已有8款商品化產(chǎn)品在國內(nèi)外上市，均取得顯著臨床療效。而針對AML的CAR-T治療還處于起步階段，臨床試驗階段的數(shù)據(jù)十分有限。

一、AML CAR-T在研靶點及其研究進展

理想的CAR-T靶點應(yīng)高表達于腫瘤細胞，而低表達或不表達于正常的組織細胞，在保證CAR-T能高效識別腫瘤細胞的前提下，又能將脫靶毒性降到最低[2]。而AML是一組具有復(fù)雜突變背景的疾病，其高度異質(zhì)性一直限制著針對AML的靶向治療發(fā)展。目前較常見的用于AML CAR-T治療的靶點主要有CD33、CD123、CLL1、LeY等，這些靶點的CAR-T均已進入臨床試驗階段。

1.CD33 CAR-T：CD33是一種表達于髓系細胞的唾液酸結(jié)合免疫球蛋白，在近90%的AML細胞中均有CD33表達[4]，同時在中性粒細胞、NK細胞、B細胞及Kupffer細胞等中也有表達。Kenderian等[5]構(gòu)建了靶向CD33的CAR-T，其在體外及小鼠模型中均展現(xiàn)出良好的殺傷效果，延長了急性髓系白血病小鼠的生存期。但同時，CD33 CAR-T在2種移植了人源性免疫系統(tǒng)的小鼠模型中均顯示出血液毒性，導(dǎo)致外周血中髓系細胞、單核細胞及骨髓中CD34+CD38+髓系祖細胞、CD34+CD38-造血干細胞減少。Kim等[6]敲除了人類CD34+造血祖細胞的CD33基因，這種CD33-的造血祖細胞仍能保有正常的造血功能，而又能夠抵抗CD33 CAR-T的殺傷作用。移植了CD33-的造血祖細胞小鼠在回輸CD33 CAR-T后AML細胞得到清除，而移植的造血祖細胞不受影響。因此，他們認(rèn)為移植敲除CD33的造血祖細胞可用于規(guī)避CD33 CAR-T治療所導(dǎo)致的血液毒性，同時不損害其腫瘤殺傷作用。中國人民解放軍總醫(yī)院報道了1例接受CD33 CAR-T回輸?shù)膹?fù)發(fā)難治性AML患者[7]，其在接受回輸后第2周達到部分緩解(PR)，但在回輸后第9周出現(xiàn)迅速的疾病進展，患者放棄治療，于回輸后第13周去世。該患者在回輸CD33 CAR-T后出現(xiàn)輕度的細胞因子釋放綜合癥(CRS)和兩次全血細胞計數(shù)下降。CD33 CAR-T在臨床前研究中顯示出良好效果，但仍需大量臨床病例來進一步驗證有效性及安全性。

2.CD123 CAR-T：CD123是IL-3受體的α亞基，是一種Ⅰ型單跨膜蛋白，主要表達于髓系細胞，在70%～80%的患者中呈陽性[8]，且其表達陽性與AML治療失敗風(fēng)險增加相關(guān)[9]。Mardiros等[10]構(gòu)建了靶向CD123的CAR-T，在體外實驗及基于小鼠模型的體內(nèi)實驗中均顯示出良好療效。美國希望之城國家醫(yī)療中心開展了一項靶向CD123的CAR-T治療AML的臨床研究[11]，在低劑量組(50×106個細胞)的2例患者中，1例回輸后達到形態(tài)學(xué)上無白血病狀態(tài)，持續(xù)時間為2個月，該患者在復(fù)發(fā)后接受二次回輸，原始細胞比例從 77.9% 降至 0.9%。而在高劑量組(200×106個細胞)的4例患者中，2例達到完全緩解(CR)，另2例達到PR。大多數(shù)患者發(fā)生2級及以下CRS，且未發(fā)生劑量限制性不良反應(yīng)及治療相關(guān)的骨髓抑制。

3.C型凝集素樣分子1(CLL1)CAR-T：CLL1是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，在大部分的AML患者中均有表達，而在正常的造血干細胞和其他正常組織中不表達，僅在單核細胞、粒細胞上表達[12]，是一個較為理想的靶點。Wang等[13]構(gòu)建了靶向CLL1的CAR-T，在體外及小鼠模型中驗證了其可有效殺傷AML細胞系和原代細胞，同時對造血干細胞無不良影響。目前已有多項靶向CLL1的CAR-T治療臨床試驗正在招募中。Jin等[14]報道了天津市第一中心醫(yī)院開展的靶向CLL1的CAR-T在治療成人復(fù)發(fā)難治性AML的首次臨床試驗結(jié)果。在該研究中，共有10例患者接受回輸，其中7例在回輸后達到CR或CR伴血液學(xué)不完全緩解(CRi)，總體緩解率達70%；另有2例未達到臨床緩解，在接受HSCT后獲得CR；中位隨訪173天，末次隨訪時，仍有6例患者存活，顯示出良好的治療效果。然而，所有患者均發(fā)生了嚴(yán)重的全血細胞減少，其中2例患者雖然達到CRi，但最終死于長期粒細胞缺乏導(dǎo)致的嚴(yán)重感染。可能原因為CLL1在正常的血細胞(主要是粒細胞和單核細胞)表面表達導(dǎo)致的脫靶毒性，而接受橋接移植的6例患者均未發(fā)生嚴(yán)重感染。因此，他們認(rèn)為HSCT也許可作為一種CAR-T治療后長期粒細胞缺乏的挽救措施。

4.Lewis Y(LeY)CAR-T：LeY是一種雙巖藻糖基化的寡糖，高表達于AML細胞而低表達于正常組織，是較為理想的靶點。在一項納入4例AML患者的Ⅰ期臨床試驗中，2例回輸LeY CAR-T時保持病情穩(wěn)定，1例骨髓及外周血原始細胞比例顯著下降，1例獲得短暫細胞遺傳學(xué)緩解，4例最終在回輸后28天～23個月內(nèi)全部復(fù)發(fā)[15]。盡管在該研究中觀察到有限的療效，但4例患者均未發(fā)生明顯不良反應(yīng)。LeY CAR-T的有效性及安全性仍需大量臨床數(shù)據(jù)來驗證。

5.FMS樣酪氨酸激酶3(FLT-3)CAR-T：FLT-3是一種酪氨酸激酶受體,其近膜結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(ITD)和細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域激活環(huán)突變(TKD)是AML患者中常見的突變[16]。該突變可導(dǎo)致FLT-3激酶持續(xù)激活，觸發(fā)多條下游信號通路，促進AML疾病進展，與預(yù)后不良相關(guān)[17]。FLT-3高表達于70%～100%的AML細胞中[18]，雖然其突變存在于約30%的AML患者中，但胞外部分常保持完整，因此開發(fā)針對FLT3細胞免疫療法具有巨大潛力[19]。FLT-3 CAR-T在體外及小鼠模型中展現(xiàn)出良好的治療效果[16-17]，但目前尚無公布的臨床試驗數(shù)據(jù)。

6.葉酸受體β(FRβ)CAR-T：FRβ約在70%的AML患者中表達，而在正常的造血干細胞中幾乎不表達，是一種十分有潛力的靶點。Lynn等[20]構(gòu)建了靶向FRβ的CAR-T，并驗證了其在體外及小鼠模型中的有效性，而且對CD34+造血干細胞無明顯的不良影響。此外，全反式維甲酸(ATRA)被證明可以上調(diào)FRβ的表達[21]，從而提高CAR-T對腫瘤細胞的識別，增強殺傷作用。

除上述靶點外，還有許多其他的在研靶點如B7-H3[22]、CD44v6[23]等已發(fā)表臨床前實驗結(jié)果，并開展臨床試驗，但尚無臨床數(shù)據(jù)釋出。截至2022年9月，在ClinicalTrials網(wǎng)站上能檢索到的AML CAR-T臨床試驗約70項(表1)。

二、AML CAR-T面臨的困境

阻礙CAR-T治療在AML患者中廣泛應(yīng)用的一個主要原因是缺乏表達于大多數(shù)患者腫瘤細胞表面，而不表達于正常組織細胞表面的靶點[24]。如常用于AML CAR-T治療的靶點CD33、CD123、CLL1等，在近80%的AML患者中均有表達，但在正常的粒細胞、單核細胞和(或)造血祖細胞上也有一定表達，可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的骨髓抑制，發(fā)生致命的出血及感染等不良反應(yīng)[8]。AML細胞的高度異質(zhì)性也使得CAR-T治療AML的療效受到限制，或因腫瘤免疫逃逸而復(fù)發(fā)。

此外，AML細胞可通過多種機制誘導(dǎo)抑制性免疫微環(huán)境[25]。首先，其可表達程序性死亡配體(PD-L)1/PD-L2等抑制性配體，或通過其代謝產(chǎn)物，促進調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、髓系來源抑制性細胞(MDSC)等免疫抑制細胞增殖，阻礙免疫效應(yīng)細胞增殖和殺傷[26]。AML細胞也可下調(diào)其主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ和(或)MHC Ⅱ表達，從而損害其抗原呈遞過程，導(dǎo)致免疫逃逸[27-28]。起源于單核細胞的AML細胞(M4及M5分型)還能通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生活性氧(ROS)，觸發(fā)多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(PARP)-1依賴性細胞凋亡殺死T細胞和NK細胞[29]。AML細胞可分泌可溶性因子抑制T細胞增殖，可能導(dǎo)致單個核細胞采集失敗，無法制備自體來源的CAR-T[30]。

表1 正在招募或即將招募的AML CAR-T臨床試驗

三、解決措施及相關(guān)進展

1.尋找新靶點：為了尋找更合適的靶點，Perna等[31]開發(fā)了一個算法，并結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)，篩選出4個在AML細胞上大量表達，但在正常造血干(祖)細胞及組織細胞僅有少量表達的靶點，分別為ADGRE2、CD70、CCR1以及LILRB2。其中靶向ADGRE2(NCT05463640)和CD70(NCT04662294)的CAR-T已有Ⅰ期臨床試驗在ClinicalTrials網(wǎng)站進行登記，其有效性及安全性有待進一步評估。

2.雙靶點CAR-T：由于AML細胞的高度異質(zhì)性，使用雙靶點CAR-T有助于減少抗原丟失及腫瘤免疫逃逸，從而提高療效，減少復(fù)發(fā)，改善預(yù)后。除AML細胞，白血病干細胞也是推動AML進展、耐藥和復(fù)發(fā)十分關(guān)鍵的一群細胞[24]，其可能是AML細胞重要的來源。因此，針對白血病干細胞的靶向治療對改善患者預(yù)后至關(guān)重要。因此有學(xué)者提出，構(gòu)建同時靶向AML細胞及白血病造血干細胞的雙靶點CAR-T，可有效避免由于免疫逃逸導(dǎo)致的疾病復(fù)發(fā)[32]。

3.新型CAR結(jié)構(gòu):脫靶效應(yīng)所導(dǎo)致的不良反應(yīng)限制了CAR-T的臨床應(yīng)用，Sommer等[33]設(shè)計了一種插入“自殺基因”的CAR-T，使其在細胞膜上表達CD20，從而可利用利妥昔單抗等藥物，誘導(dǎo)CAR-T凋亡。Richards等[34]研發(fā)出“Not-Gated”結(jié)構(gòu)，使CAR-T同時帶有一個激活性CAR(aCAR)結(jié)構(gòu)和一個抑制性CAR(iCAR)結(jié)構(gòu)，若iCAR識別到正常組織表達的靶點，可活化胞內(nèi)抑制性信號，抑制T細胞激活及殺傷，從而減少CAR-T對正常組織脫靶不良反應(yīng)。Roybal等[35]研發(fā)出"synNotch"結(jié)構(gòu)，T細胞在識別到腫瘤抗原A后可激活CAR結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄翻譯，并在識別到腫瘤抗原B后發(fā)揮其靶向腫瘤細胞的殺傷作用。因此，只有在同時識別到兩種腫瘤相關(guān)抗原的情況下，CAR-T才能發(fā)揮其殺傷作用，從而提高特異性。

4.“可生物降解”CAR-T：Cummins等[36]使用電穿孔技術(shù)將抗CD123 CAR的mRNA遞送至T細胞內(nèi)，構(gòu)建“可生物降解”的CAR-T，再回輸至人體內(nèi)，從而使其安全性得到有效控制，降低其不良反應(yīng)。在該研究中，接受回輸?shù)?例患者未發(fā)生與治療相關(guān)的死亡，也未發(fā)生任何臨床上顯著的血管、神經(jīng)或血液不良反應(yīng)。然而回輸后CAR-T未出現(xiàn)預(yù)期的體內(nèi)擴增。此外，在任何時間點，骨髓中均未檢測到CAR-T。骨髓中表達CD123的細胞沒有減少，所有患者在回輸后第28天前疾病進展。因此，該試驗因缺乏療效而提前終止。Rurik等[37]則直接向小鼠模型注射靶向T細胞遞送mRNA的脂質(zhì)納米顆粒，在體內(nèi)構(gòu)建CAR-T從而治療心肌纖維化。該方法相對于前者的優(yōu)點在于可根據(jù)患者病情需要多次注射藥物，且無需等待CAR-T在體外制備的過程，是一種具有前景且值得探索的方法。

5.調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境：針對AML細胞造成的抑制性免疫微環(huán)境，可聯(lián)用程序性死亡受體1(PD-1)抑制劑對免疫微環(huán)境進行調(diào)節(jié)，或采用第四代“裝甲型”CAR-T，使CAR-T分泌免疫激活因子如IL-12、IL-18等[38-39]。

四、小結(jié)

CAR-T治療自面世以來，為許多罹患B淋巴細胞系血液系統(tǒng)惡性腫瘤的患者帶來新的希望。CD33、CD123及CLL1是目前研究較多的應(yīng)用于AML治療的靶點，除此以外還有許多已發(fā)表了臨床前試驗結(jié)果的新靶點CAR-T，目前也已經(jīng)進入臨床試驗階段，但仍需更多臨床數(shù)據(jù)來驗證其有效性及安全性。特異性靶點的缺乏、致命的脫靶毒性及抑制性的免疫微環(huán)境均是AML CAR-T廣泛應(yīng)用的阻礙。針對以上難題，學(xué)者們也作出許多努力，如對CAR結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化、尋找新靶點、應(yīng)用雙靶點CAR-T等，這將為CAR-T治療在AML的應(yīng)用開辟新的道路，為復(fù)發(fā)難治性AML患者提供更多治療選擇。