多靶點CAR-T治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究進展

馮友琴 張棋琦 胡永仙 黃河

嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)治療復發(fā)難治性血液系統(tǒng)惡性腫瘤療效顯著，成為近年來腫瘤治療領域最重大的突破之一。據(jù)報道CD19 CAR-T治療復發(fā)難治性急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)及復發(fā)難治性B細胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的完全緩解率(CRR)分別是60%～90%[1-3]和40%～50%[4-5]；B細胞成熟抗原(BCMA)CAR-T治療復發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤(RRMM)的CRR為39%～80%[6-8]；G蛋白偶聯(lián)受體C5家族亞型D蛋白(GPRC5D)CAR-T(OriCAR-017)治療RRMM的CRR/嚴格意義的CRR(sCRR)為60%(NCT05016778)；CD7 CAR-T治療復發(fā)難治性T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)或淋巴母細胞淋巴瘤(LBL)的CRR可達87.5%～94.0%[9]。盡管單靶點CAR-T療效顯著，但仍有部分復發(fā)難治性血液病患者存在治療無效或治療后復發(fā)。據(jù)文獻報道，復發(fā)難治性B-ALL患者在使用CD19 CAR-T治療后的復發(fā)率約為17%～57%，其中CD19陰性復發(fā)率為7%～25%[1,10]。

CAR-T治療后復發(fā)是目前臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)，其涉及機制主要包括抗原依賴性因素(抗原逃逸、抗原脫落或抗CAR抗體)及T細胞驅動性因素(CAR-T耗竭、免疫抑制性腫瘤微環(huán)境)[11]。在血液系統(tǒng)腫瘤研究領域，靶抗原的缺失是最具特征的耐藥機制，靶抗原陰性克隆的復發(fā)具有多種潛在機制，如移碼/錯義突變或可變剪接、預先存在的抗原陰性亞克隆選擇性擴增、表位遮蔽和譜系轉換/轉分化等[12]。另有研究表明CAR-T還可通過胞啃作用將腫瘤細胞表面的靶抗原轉移到自身表面，降低腫瘤細胞上靶點的密度，并引起CAR-T之間相互攻擊，最終導致T細胞的耗竭與活性降低[13]。與單靶點CAR-T相比，多靶點CAR-T可降低抗原丟失的可能性，并可增加其抗腫瘤活性[13-14]。目前雙靶點CAR-T研發(fā)及臨床轉化日漸增多，從報道的綜合臨床數(shù)據(jù)可看出，雙靶點CAR-T展現(xiàn)出極富前景的應用價值。本綜述總結了目前應用多靶點CAR-T治療復發(fā)難治性血液系統(tǒng)惡性腫瘤臨床轉化研究的最新進展。

一、多靶點CAR-T結構

用于構建多靶點CAR-T的CAR結構主要包括：雞尾酒/序貫CAR、共轉導型CAR、并聯(lián)型CAR、二價串聯(lián)型CAR、二價環(huán)形CAR。

1.雞尾酒/序貫CAR(圖1A)：分別用兩種不同病毒載體轉導的T細胞可產生兩種單獨的CAR-T產品，然后將兩種單獨的CAR-T以1∶1的比例混合在一起，同時或序貫輸注[15-16]。該方式可靈活調整組合和劑量，但生產成本高，從臨床實踐觀察，兩個CAR-T共同或序貫回輸，可能以某一靶點CAR起主要作用。

2.共轉導型CAR(圖1B)：用兩個病毒載體同時共轉導，每個載體編碼一個單獨的CAR結構。其最終的混合產物中包含兩個單獨的單靶點CAR-T和一個雙靶點CAR-T[16]。但細胞產品中會存在沒有轉上CAR的T細胞，質控比較困難。

3.并聯(lián)型CAR(圖1C)：即雙順反子CAR，帶有不同單鏈抗體片段(scFv)的CAR分子轉入同一個T細胞，其中每個CAR靶向不同的抗原結合域，且具有各自獨立的信號傳導途徑[16-18]。但CAR分子較大易導致病毒包裝或轉導效率出現(xiàn)問題，且兩個胞內信號更易導致CAR-T耗竭。

4.二價環(huán)形或串聯(lián)型CAR(圖1D、1E)：將一個二價病毒載體引入T細胞而產生雙結構域。根據(jù)scFv的輕鏈可變結構域(VL)和重鏈可變結構域(VH)排列順序的不同，可分為兩種結構：串聯(lián)和環(huán)形CAR。兩種結構的胞內均只有一個共同的信號傳導途徑[18-19]。串聯(lián)結構是由一個scFv的VL-VH直接連接另一個scFv的VL-VH，而環(huán)狀結構則由一個scFv的VL-VH夾在另一個scFv的VH-VL中間形成。該類型CAR-T胞外結構復雜，質粒構建難度大。

二、多靶點CAR-T臨床研究進展

截至目前，多靶點CAR-T治療復發(fā)難治性血液病的臨床研究已取得重大進展。同時靶向CD19/CD20、CD19/CD22、CD19/BCMA或BCMA/CS1的雙靶點CAR-T在通過臨床前研究證實具有強大的抗腫瘤活性后已進入臨床試驗階段。本部分舉例綜述在不同血液系統(tǒng)腫瘤中多靶點CAR-T臨床試驗的安全性與療效。見表1。

1.復發(fā)難治性惡性B細胞血液系統(tǒng)腫瘤：多項CD19/CD20及CD19/CD22雙靶點CAR-T臨床試驗公布的結果表明,二者治療復發(fā)難治性B-NHL、復發(fā)難治性B-ALL均具有較高的緩解率且不良反應可控，同時也是目前開展最多的雙靶點CAR-T治療臨床試驗。韓衛(wèi)東教授團隊在2017年5月發(fā)起了一項開放標簽、單臂Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(NCT03097770)，以評估CD19/CD20雙靶點CAR-T(TanCAR7-T)治療B-NHL的療效及安全性[19]。截至2021年3月，研究共入組87例患者，總緩解率(ORR)達78%，CRR可達70%。9例患者發(fā)生3～4級CRS，僅2例患者發(fā)生3級神經系統(tǒng)反應(癲癇)且不良反應可控。中位隨訪27.7個月，仍有60%的患者維持持續(xù)緩解。

早在2020年4月韓衛(wèi)東教授團隊率先證實了CD19/CD22的雙特異性CAR-T治療B-ALL的安全性和有效性[20]。我中心團隊近期開展了一項開放標簽、劑量遞增的Ⅰ期臨床試驗(NCT04227015)，以評估CRISPR/Cas9基因編輯的通用型CD19/CD22雙靶點CAR-T(CTA101)治療復發(fā)難治性急性淋巴細胞白血病(ALL)的療效和安全性。截至2020年8月，研究共入組6例患者，輸注后的CRR為83.3%，中位隨訪4.3個月，獲得CR或CR伴不完全血液學緩解(CRi)的5例患者中有3例微小殘留病灶(MRD)持續(xù)陰性[21]。

2.復發(fā)難治性惡性漿細胞血液系統(tǒng)腫瘤：Ide-cel是第一個被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準用于治療RRMM的BCMA CAR-T產品，其療效顯著、不良反應可控[6]。但單靶點BCMA CAR-T治療后仍有約45%患者出現(xiàn)腫瘤復發(fā)[22]，其中4%～33%CAR-T治療后復發(fā)的患者出現(xiàn)BCMA抗原的丟失或下調[6,23]。同時研究發(fā)現(xiàn)其他漿細胞標志物和潛在的免疫治療靶標，如CD38和CS1(SLAMF7)在疾病進展過程中仍穩(wěn)定表達[24]。這些現(xiàn)象均表明靶向多種漿細胞抗原的CAR-T療法可能是避免抗原逃逸的一種可行方法。

基于該現(xiàn)象胡豫教授團隊設計了BCMA/CD38雙靶點CAR-T，在體內外實驗中評估其治療的有效性和安全性后，發(fā)起一項BCMA/CD38 CAR-T治療RRMM臨床試驗(ChiCTR1800018143)。該研究共入組23例患者，中位隨訪9個月，12例(52%)患者達sCR，另有4例(17%)獲得非常好的部分緩解(VGPR)及4例(17%)出現(xiàn)部分緩解(PR)。87%的患者出現(xiàn)CRS，≥3級CRS僅22%，未發(fā)生任何級別神經不良反應。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)BM38 CAR-T在9個月、12個月時可分別在77.8%、62.2%的患者體內檢測得到，表明其在體內持久性較好[17]。

2022年第27界歐洲血液學年會(EHA)公布了GC012F的臨床試驗數(shù)據(jù)，這是一款可由亙喜生物FasTCAR平臺開發(fā)的靶向BCMA/CD19雙靶點自體CAR-T。該研究共入組28例復發(fā)難治性B-NHL患者，中位隨訪6.3個月，不同劑量水平(DL)的ORR分別為100.0%(DL1)、80.0%(DL2)及93.8%(DL3)，75%患者獲得sCR。3級以上CRS只有7.1%，且所有患者均未發(fā)生任何級別神經不良反應(NCT04236011；NCT04182581)。此外第27屆EHA還公布了BCMA/CS1雙靶點CAR-T臨床試驗結果，共入組13例RRMM患者，其ORR和CRR分別為76.9%和30.8%。31%的患者發(fā)生CRS，未見神經不良反應(NCT04662099)。

圖1 多靶點CAR-T結構(A:雞尾酒/序貫CAR；B：共轉導型CAR；C:并聯(lián)型CAR;D:二價環(huán)形CAR；E：二價串聯(lián)型CAR)

表1 多靶點CAR-T治療的臨床試驗

3.多靶點CAR-T治療其他復發(fā)難治性惡性血液系統(tǒng)腫瘤：相比B細胞血液系統(tǒng)惡性腫瘤，雙靶點CAR-T治療復發(fā)難治性急性髓系、T細胞性血液系統(tǒng)惡性腫瘤面臨更多挑戰(zhàn)。

CAR-T治療復發(fā)難治性急性髓系白血病(AML)的主要障礙在于AML細胞異質性較大、缺少高度特異性靶點。AML細胞上各種表面抗原如CD123、CD34、CD33等，同時也在正常的造血干細胞、髓系和(或)淋巴祖細胞上表達[25]，針對這些靶點的CAR-T治療相關不良反應較大。此外有研究發(fā)現(xiàn)AML細胞可分泌抑制T細胞增殖的免疫抑制因子，影響CAR-T在體內的擴增[26]。CAR-T治療T-ALL或T細胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)面臨的亟需解決的問題主要有CAR-T的自相殘殺、患者T細胞缺乏、T細胞性再生障礙性貧血及制備的自體CAR-T易被惡性T細胞污染等問題[27]。CAR-T治療急性髓系、T細胞血液系統(tǒng)腫瘤有待尋找合適的靶點及改進制備工藝。

國內一款靶向CLL1/CD33的CAR-T在治療復發(fā)難治性AML中顯示出積極療效。西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院劉芳教授團隊率先證實CLL1/CD33雙靶點CAR-T在小鼠體內具有強大的抗腫瘤活性，隨后于2020年EHA上公布了該雙靶點CAR-T的Ⅰ期臨床研究數(shù)據(jù)，入組的9例復發(fā)難治性AML患者中7例達到CR，88.8%患者發(fā)生CRS但不良反應可控(NCT03795779)。其余針對復發(fā)難治性AML治療的雙靶點如CD123/CLL1(NCT03631576)、CD123/CD33(NCT04156256)也已顯示出初步的療效和安全性，相關數(shù)據(jù)尚未證實發(fā)布。

三、多靶點CAR-T臨床前研究進展

雖然多靶點CAR-T治療復發(fā)難治性血液病取得了較大進展，但同樣面臨著相應的臨床挑戰(zhàn)，如脫靶效應、制備困難等。越來越多的研究者致力于新型多靶點CAR-T的研發(fā)，包括BAFF CAR-T治療RRMM、CRISPR/Cas9基因敲除CD5/CD7 CAR-T治療T-ALL及三靶點CAR-T治療復發(fā)難治性血液病等。同時越來越多的研究通過優(yōu)化多靶點CAR-T的結構設計以減少不良反應的發(fā)生。

1.BAFF CAR-T/APRIL CAR-T：B細胞激活因子(BAFF，BlyS)和增殖誘導配體(APRIL)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的兩個同源成員，BAFF可與表達在成熟B細胞上的3個受體BAFF-R、BCMA和穿膜蛋白活化物(TACI)結合，ARPIL可與BCMA、TACI結合，啟動下游信號轉導以促進惡性漿細胞的增殖與存活[28]。以BAFF或APRIL作為CAR-T胞外識別結構域，相當于可同時靶向腫瘤的多個抗原，在治療多種B細胞腫瘤時可起協(xié)同作用。BAFF CAR-T尚處于臨床前研究階段，Wong及其研究團隊[29]設計了基于BAFF配體的CAR構建體，利用非病毒TcBuster轉座子系統(tǒng)將BAFF CAR整合到T細胞中，體內外實驗均證實BAFF CAR-T具有顯著的抗腫瘤能力。我中心開展的APRIL CAR-T治療RRMM研究已轉化臨床(NCT04657861)，相關數(shù)據(jù)尚未正式公布。

2.雙特異性及分離型(Biss)CAR-T：2020年He等[30]構建出BissCAR，主要由P2A(linker)連接納米抗體Nb157、CD3ζ和anti-TIM3-scFv、CD28、4-1BB。P2A自剪切后BissCAR最終會分裂成兩個CAR。Nb157是由作者開發(fā)的序列腫瘤選擇抗體和抗原檢索(STAR)技術篩選出來的納米抗體，能特異性識別在AML細胞上高表達的CD13。為了成功靶向耐藥AML干細胞而不“誤殺”正常骨髓造血干細胞，研究者選擇了T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(TIM3,在骨髓造血干細胞低表達或不表達)作為另一種共刺激信號的靶抗原。實驗證實BissCAR-T未攻擊K562-TIM3(CD13-TIM3+)系細胞，對NB4(CD13+TIM3-)系細胞僅表現(xiàn)出很低的殺傷作用，而對NB4-TIM3(CD13+TIM3+)系細胞卻表現(xiàn)出最大的細胞毒性[30]。同時靶向CD13和TIM3的BissCAR-T可根除AML細胞，且對正常造血干細胞影響較小，具有更高的臨床安全性。

3.synNotch “AND-gate” CAR-T：2017年Morsut等[31]在《Cell》上發(fā)布了一項研究，首次設計了一種基于Notch的組裝式受體即synNotch受體。隨后該團隊利用這一平臺設計了synNotch “AND-gate” CAR系統(tǒng)，其識別抗原A的人工受體synNotch基因，包含了抗原A的識別片段及啟動抗原B識別CAR基因轉錄的轉錄因子。裝載synNotch系統(tǒng)的CAR-T只能識別和殺傷同時表達抗原A和B的腫瘤細胞[32]。該策略為CAR-T的精準識別和治療提供了新模式。

4.抑制型CAR-T：當某種抗原在腫瘤細胞和正常細胞上同時表達時，CAR-T治療可能會引起脫靶效應，產生相應的不良反應。早在2013年就有研究者開發(fā)了一種抑制型CAR-T(iCAR)，在CAR-T中同時表達CAR和iCAR。iCAR是經過改造的抑制性受體[如程序性死亡受體1(PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)],能夠識別正常組織呈遞的抗原。這種CAR-T作用于正常細胞時活性會被抑制，從而精確靶向腫瘤細胞，發(fā)揮殺傷的作用[33]。此外，有些抗原在正常細胞中表達而在腫瘤細胞中不表達，利用這一特性，synNotch “OFF-gate” CAR-T在作用于正常細胞時可實現(xiàn)將synNotch通路激活的基因變成促凋亡相關基因，從而使T細胞發(fā)生凋亡，避免細胞治療中交叉反應而導致的不良反應[34]。抑制型CAR-T及synNotch “OFF-gate” CAR-T均為解決脫靶效應提供了新的策略。

5.CRISPR/Cas9基因編輯CAR-T：正如上述提及，CAR-T療法對于復發(fā)難治性T細胞血液系統(tǒng)腫瘤效果欠佳。針對CAR-T自殺傷這一問題，近期有研究在雙特異性CAR的慢病毒轉導之前進行基于CRISPR/Cas9的CD5和CD7基因敲除，功能實驗證實基因敲除對細胞無明顯影響。且隨后的體內外實驗證實相較于并聯(lián)型CAR-T，串聯(lián)型CD5/CD7 CAR-T具有更高的殺傷活性，且能夠更有效地防止腫瘤逃逸[35]?；贑RISPR/Cas9基因編輯的CD5/CD7雙靶點CAR-T研究結果為T細胞血液系統(tǒng)腫瘤的免疫治療提供了新的方向。

6.三靶點CAR-T：在雙靶點CAR-T療法取得積極成果的同時，三靶點CAR-T的臨床前研究也取得相應進展。在一項新的研究中，Lentigen研究人員開發(fā)出三特異性duoCAR-T ，由靶向CD19和CD20的串聯(lián)CAR通過P2A自裂解肽連接到另一種靶向CD22的CAR上組成，且證實最有效的duoCAR結構包含ICOS、OX40或CD27共刺激域，而不是CD28或4-1BB。體內外實驗證實duoCAR-T擁有較高的抗腫瘤效力和持久性，同時克服了腫瘤異質性和腫瘤抗原逃逸的臨床挑戰(zhàn)[36]。三靶點CAR-T療法無疑是在雙靶點CAR-T的基礎上進一步降低了因抗原逃逸或丟失導致的復發(fā)風險，深度消除腫瘤細胞。但目前該技術還處于臨床前研發(fā)階段，仍需大量研究以評估其臨床前毒性、產品開發(fā)工藝與質控、適應證人群、給藥劑量等問題。

四、總結與展望

雖然CAR-T治療在復發(fā)難治性血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了卓越的療效，但CAR-T治療后復發(fā)的問題依然嚴峻。與單靶點CAR-T相比，多靶點CAR-T主要的優(yōu)勢在于可減少腫瘤細胞的抗原逃逸。雙靶點CAR-T治療的療效已在部分臨床試驗中得到了驗證，同時各個臨床試驗報道的嚴重CRS和ICANS等不良反應的發(fā)生率也較低。多靶點CAR-T可能成為未來細胞免疫治療領域研究的趨勢。

盡管如此，多靶點CAR-T治療仍面臨著前所未有的挑戰(zhàn)。首當其沖的是靶點的選擇與驗證。B細胞血液系統(tǒng)腫瘤潛在免疫治療靶點眾多，如何優(yōu)化靶點選擇以更好提高療效，還需更多基礎研究與臨床研究相結合。對于髓系血液系統(tǒng)腫瘤中雙靶點的合理選擇，如靶向CD33/TIM3或CLL1/TIM3仍待進一步探究。另一個亟需解決的問題是多靶點結構的優(yōu)化。正如上述提到串聯(lián)型雙靶點CAR-T的療效優(yōu)于并聯(lián)型，但串聯(lián)型CAR-T開發(fā)難度較大，linker的選擇也是需要關注的問題。最后就是新型CAR-T的技術優(yōu)化與產品開發(fā)。自體CAR-T面臨較多缺陷，如難以采集足夠多的外周血T細胞、自體CAR-T不能大規(guī)模生產及從采集到制備耗時較長等問題，通用型多靶點CAR-T和誘導多能干細胞(iPSCs)來源的多靶點CAR-T為細胞治療領域開辟了新的治療方向。