碳量子點(diǎn)及新型半胱氨酸分子印跡傳感器的制備*

張育珍，張 博，余 雙，白春花，秦 蓓

（西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710000）

半胱氨酸（L-cysteine，L-Cys）是一種含巰基的氨基酸，其主要功能是參與代謝、蛋白質(zhì)合成和排毒[1,2]。研究表明，L-Cys水平升高會引發(fā)神經(jīng)毒性疾病，而L-Cys缺乏會導(dǎo)致脫發(fā)、肌肉和脂肪減少、嗜睡、浮腫、虛弱和肝損傷等疾病[3-7]。因此，建立高選擇性、高靈敏度檢測L-Cys在生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)方面具有重要意義。目前，L-Cys檢測方法包括高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳及光學(xué)檢測[8]。然而，這些方法需要復(fù)雜的樣品前處理過程，而且谷胱甘肽和高半胱氨酸與L-Cys具有相似的結(jié)構(gòu)，從而難以檢測內(nèi)源性L-Cys[2]。因此，為了解決上述問題必須開發(fā)方便、廉價且具有高靈敏度、高選擇性的方法來檢測L-Cys。

熒光碳量子點(diǎn)（carbon dots，CDs）是碳族中的一種新型零維納米材料[9]。由于其獨(dú)特的光學(xué)性能、良好的水溶性及生物相容性，被廣泛認(rèn)為是一種優(yōu)于其他熒光基團(tuán)的材料[10]。然而，CDs通常對大多數(shù)分析物沒有選擇性，因此，有必要探索合適方法來提高CDs的特異性[11]。目前，基于CDs與分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers,MIPs）相結(jié)合的傳感器因其低毒、高選擇性和高靈敏度受到科研工作者廣泛關(guān)注[12]。Ghani等[13]基于CDs和MIPs開發(fā)了一種選擇性測定啶蟲脒的熒光法，其檢測限可達(dá)到0.11nmol·L-1。據(jù)報(bào)道，以量子點(diǎn)為熒光材料，利用MIPs高選擇性檢測L-Cys僅有2篇。Chao[14]等人通過烯丙基硫醇封端的CdTe量子點(diǎn)與MIPs嫁接，用于檢測血清中L-Cys，檢測限可達(dá)到0.85μM。Cai等人[15]提出了一種基于化學(xué)劑量法的熒光檢測方法，結(jié)合分子印跡技術(shù)與熒光劑量法測定L-Cys。然而，目前報(bào)道L-Cys熒光檢測方法制備工藝復(fù)雜、毒性較大，不利于其進(jìn)一步發(fā)展。

本研究擬采用水熱法制備CDs，通過反相微乳法以CDs為熒光傳感單元、L-Cys為模板分子、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）為功能單體、硅酸四乙酯（TEOS）為交聯(lián)劑、NH3·H2O為引發(fā)劑，制備新型半胱氨酸分子印跡（L-Cys@CDs@MIPs）。隨后對CDs和L-Cys@CDs@MIPs進(jìn)行透射電鏡（TEM）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）等表征，并利用目標(biāo)化合物對L-Cys@CDs@MIPs的猝滅效果進(jìn)行考察，以期建立檢測痕量L-Cys的方法。本研究將有助于復(fù)雜基質(zhì)中痕量L-Cys檢測，將為與L-Cys相關(guān)疾病的預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度計(jì)（株式會社日立制作所）；Carry60型紫外可見分光光度計(jì)（安捷倫科技有限公司），IR-Affinity-1型傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，日本島津），LAB-1C-50型真空冷凍干燥機(jī)（上海甄明科學(xué)儀器有限公司）。

L-半胱氨酸（25g，≥98%）、檸檬酸（500g，99.0～102.0%）、正己醇（100mL，98%）、硅酸四乙酯（TEOS，500mL，98%）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，25mL，98%），購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；曲拉通X-100（CP國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；環(huán)己烷（AR利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；無水乙二胺、丙酮、無水甲醇、冰乙酸、NH3·H2O、縮二脲、硫脲、尿素，均為分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

1.2 CDs的制備

將4.0g檸檬酸溶于40mL去離子水中，隨后加入2.0mL無水乙二胺，充分混勻后，轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，并在200℃反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束后，用0.45μm微孔濾膜除去大顆粒物，即得CDs水溶液。隨后，利用透析袋除去未反應(yīng)化合物并除雜，最終得到亮黃色透明溶液，即得純凈CDs水溶液，經(jīng)冷凍干燥得到CDs粉末。

1.3 新型半胱氨酸分子印跡傳感器的制備

在50mL試劑瓶中依次加入環(huán)己烷8mL、正己醇1.5mL與曲拉通X-1002mL，磁力攪拌30min。隨后，加入5mg·mL-1CDs溶液1mL、1.2mmol TEOS和NH3·H2O 100μL的并攪拌2h。然后，向上述溶液中，加入室溫下預(yù)聚合2h的0.2mmol L-Cys、0.6mmol APTES溶液，磁力攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束后，加入10mL丙酮終止反應(yīng)，并離心收集聚合物，接著用甲醇∶乙酸（9∶1，v/v）溶液除去模板分子L-Cys，隨后用甲醇洗至無乙酸味，于烘箱中45℃干燥。L-Cys@CDs@MIPs納米材料合成步驟見圖1。

圖1 新型L-Cys@CDs@MIPs制備過程Fig.1 Schematic representation of L-Cys@CDs@MIPs synthesis process

在不添加模板分子L-Cys的情況下，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟制備非印跡聚合物CDs@NIPs作為對照。

1.4 新型半胱氨酸分子印跡傳感器熒光測定

制備的復(fù)合材料熒光光譜均在F-4600熒光光譜儀上進(jìn)行，并在340nm的激發(fā)波長下記錄熒光強(qiáng)度，在390～600nm的波長范圍內(nèi)測定發(fā)射波長。將L-Cys@CDs@MIPs分散在去離子水中，然后將不同濃度的L-Cys溶液加入熒光比色管中，用熒光光譜儀測定熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 CDs的制備

2.1.1 前驅(qū)體種類的考察 以檸檬酸、尿素，檸檬酸、硫脲，檸檬酸、縮二脲，檸檬酸、天冬氨酸，檸檬酸、無水乙二胺為前驅(qū)體制備CDs。隨后，在相同條件下檢測其熒光強(qiáng)度。

從表1可知，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，檸檬酸與無水乙二胺為前驅(qū)體，熒光強(qiáng)度最大，因此，選擇檸檬酸和無水乙二胺為前驅(qū)體制備CDs。

表1 前驅(qū)體種類考察Tab.1 Investigation on the types of precursors

2.1.2 前驅(qū)體濃度考察 利用不同濃度前驅(qū)體檸檬酸和無水乙二胺制備CDs。

由表2可知，隨著檸檬酸與無水乙二胺濃度減小，熒光強(qiáng)度也隨之減少，當(dāng)檸檬酸與無水乙二胺分別為2.0g和1.0mL時，熒光強(qiáng)度為3221，故選擇上述濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 前驅(qū)體濃度考察Tab.2 Investigation on the concentration of precursors

2.1.3 CDs電鏡表征 采用超分辨透射電鏡圖（TEM）對制備CDs的形貌和粒徑分布進(jìn)行了表征。圖2為CDs的TEM圖。

圖2 CDs透射電鏡圖Fig.2 TEM of CDs

從圖2中可知，CDs呈球形、尺寸均勻、大小均一。

2.1.4 CDs紅外表征 采用傅里葉變換紅外（FI-IR）光譜及KBr壓片法對CDs進(jìn)行紅外表征。

從圖3可知，在3404cm-1處為C-OH伸縮振動峰，在2923cm-1處的吸收峰為C-H伸縮振動峰，在1699cm-1處的吸收峰是由C=O伸縮振動引起的，1564cm-1處 為N-H的 彎 曲 振 動 峰，1400cm-1處為-OH伸縮振動峰，1166cm-1處為C-NH-C的伸縮振動。因此，表明CDs已經(jīng)制備成功且CDs表面含有羥基、羰基以及氨基基團(tuán)[16]。

圖3 CDs紅外表征圖Fig.3 FT-IR spectra of CDs

2.1.5 CDs熒光性能 在不同激發(fā)波長下對CDs的熒光強(qiáng)度進(jìn)行考察，結(jié)果見圖4。

圖4 （a）CDs在300～400nm熒光發(fā)射光譜（b）CDs最佳激發(fā)和發(fā)射光譜（c）CDs的紫外吸收光譜Fig.4（a）Fluorescence emission spectra of CDs from 300nm to 400nm（b）Fluorescence excitation and emission spectra of CDs（c）Ultraviolet absorption spectrum of CDs

由圖4（a）可見，CDs熒光強(qiáng)度隨著激發(fā)波長從300nm到400nm的增加，熒光強(qiáng)度先增加后減弱，在激發(fā)波長為340nm時，CDs的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。隨后對CDs進(jìn)行紫外-可見吸收光譜考察，圖4（c）可知，由于雙鍵的π-π*躍遷，CDs在340nm左右出現(xiàn)了明顯的特征吸收峰，與CDs的激發(fā)波長一致，得到最佳激發(fā)波長。隨后在最佳激發(fā)波長下，判斷最佳發(fā)射波長。由圖4（b）可見，所制備CDs的最佳激發(fā)波長為340nm，所對應(yīng)的最佳發(fā)射波長為444nm，顯現(xiàn)出藍(lán)色熒光。

2.2 新型半胱氨酸分子印跡傳感器的制備

2.2.1 模板分子與功能單體比例考察MIPs具有預(yù)定的識別能力、選擇性高，而分子識別取決于模板和功能單體之間的分子間相互作用，因此，功能單體是影響聚合物吸附能力的關(guān)鍵因素[17]。本文將功能單體與交聯(lián)劑比例固定為1∶2，隨后選取6組摩爾比（1∶1.5，1∶2，1∶2.5，1∶3，1∶4，1∶5，）進(jìn)行評估考察，結(jié)果見圖5。

圖5 模板分子與功能單體比例考察Fig.5 Fluorescence intensity of different molar ratios of template-functional monomer

由圖5可知，當(dāng)L-Cys與APTES比例為1∶3時，F(xiàn)0-F差值最大，因此，選擇模板分子與功能單體比例為1∶3進(jìn)行下一步考察。

2.2.2 功能單體和交聯(lián)劑不同比例的考察 交聯(lián)劑是分子印跡材料合成過程中重要因素，交聯(lián)劑使用量的多少會決定制備納米粒子空間網(wǎng)絡(luò)疏松緊密程度。本文選擇模板分子與功能單體比例為1∶3，隨后考察功能單體與交聯(lián)劑的比例，選取3組摩爾比（3∶3，3∶6，3∶9）進(jìn)行評估考察，結(jié)果見圖6。

圖6 功能單體與交聯(lián)劑比例考察Fig.6 Fluorescence intensity of different molar ratios of functional monomer-cross-linker

由圖6可知，當(dāng)APTES與TEOS比例為3∶6時，F(xiàn)0-F差值最大，因此，選擇功能單體：交聯(lián)劑比例為3∶6進(jìn)行考察。

2.2.3 新型半胱氨酸分子印跡傳感器紅外表征 采用傅里葉變換紅外（FI-IR）光譜及KBr壓片法對LCys@CDs@MIPs進(jìn)行紅外表征，結(jié)果見圖7。

圖7 L-Cys@CDs@MIPs紅外表征圖Fig.7 FT-IR spectra of L-Cys@CDs@MIPs

由圖7可知，3406cm-1處為C-OH伸縮振動峰，3126cm-1處為C-H伸縮振動峰，1642cm-1處為C=O伸縮振動峰，1400cm-1處為-OH伸縮振動峰，1070cm-1處為Si-O-Si不對稱伸縮振動峰，表明分子印跡層已經(jīng)形成。

2.2.4 新型半胱氨酸分子印跡傳感器電鏡表征 采用超分辨透射電鏡圖（TEM）對L-Cys@CDs@MIPs的形貌進(jìn)行表征。圖8為不同尺寸L-Cys@CDs@MIPs的TEM圖。

圖8 L-Cys@CDs@MIPs透射電鏡圖Fig.8 TEM of L-Cys@CDs@MIPs

從圖8可知，L-Cys@CDs@MIPs具有粗糙的表面，且發(fā)生聚合，尺寸比CDs大很多，進(jìn)一步表明聚合物已經(jīng)制備成功。

2.3 新型半胱氨酸分子印跡傳感器熒光性能

2.3.1 新型半胱氨酸分子印跡傳感器光學(xué)性質(zhì)考察 通過掃描L-Cys@CDs@MIPs不同激發(fā)（300～400nm）波長下的發(fā)射光譜，研究L-Cys@CDs@MIPs的熒光特性，結(jié)果見圖9。

圖9 （a）L-Cys@CDs@MIPs在300-400nm熒光光譜；（b）L-Cys@CDs@MIPs最佳激發(fā)和發(fā)射光譜；（c）L-Cys@CDs@MIPs紫外吸收光譜；（d）熒光光譜Fig.9（a）Fluorescence emission spectra of L-Cys@CDs@MIPs from 300nm to 400nm；（b）Fluorescence excitation and emission spectra of L-Cys@CDs@MIPs；（c）Ultraviolet absorption spectrum of L-Cys@CDs@MIPs；（d）Fluorescence emission spectra

由圖9（a）和（b）表明，最大激發(fā)波長為340nm，而相應(yīng)的最大發(fā)射波長約為440nm。因此，在340nm的激發(fā)波長和440nm的發(fā)射波長下對L-Cys@CDs@MIPs進(jìn)行了下一步的熒光測量。由圖9（c）可知，L-Cys@CDs@MIPs在340nm左右出現(xiàn)了明顯的特征吸收峰，與其激發(fā)波長一致，進(jìn)一步證明該復(fù)合材料最佳激發(fā)波長為340nm。隨后，對L-Cys@CDs@MIPs和L-Cys@CDs@NIPs復(fù)合材料進(jìn)行熒光測定，由圖9（d）可知，L-Cys@CDs@NIPs比L-Cys@CDs@MIPs（加L-Cys）顯示出更強(qiáng)的熒光信號，并且LCys@CDs@MIPs（未加L-Cys）的熒光強(qiáng)度為L-Cys@CDs@NIPs的86%。這些結(jié)果表明，制備的復(fù)合材料具有良好的熒光性能，并且成功地從聚合物中去除了L-Cys。

2.3.2 新型半胱氨酸分子印跡傳感器熒光測定 圖10（a）為不同濃度L-Cys猝滅L-Cys@CDs@MIPs的熒光光譜圖。從圖10a中可看出，L-Cys可以明顯的猝滅LCys@CDs@MIPs熒光強(qiáng)度，且當(dāng)L-Cys濃度為100μM時，猝滅效果最明顯。圖（b）是熒光猝滅效果F0-F與不同濃度L-Cys的線性關(guān)系圖，從圖10b中可知，其線性關(guān)系為F0-F=2.292C+153.544，R2為0.992。

圖10 （a）L-Cys猝滅L-Cys@CDs@MIPs熒光光譜圖（b）F0-F與L-Cys線性關(guān)系Fig.10（a）Fluorescence emission spectra L-Cys@CDs@MIPs in the presence of different concentrations of L-Cys（from 1 to 100μM）（b）The relationship between F0-F and the concentrations of L-Cys

3 結(jié)論

本研究以檸檬酸和無水乙二胺為前驅(qū)體，通過簡單的水熱法一步合成了具有優(yōu)異熒光特性的CDs，隨后對CDs進(jìn)行TEM表征。結(jié)果表明，制備的CDs大小均一、尺寸均勻。對其FT-IR表征，進(jìn)一步證明CDs已成功制備，而且其表面富含羰基、羧基和氨基等官能團(tuán)，使得CDs表現(xiàn)出良好的水溶性。利用反相微乳法，以低成本、操作簡單方便理念，制備新型L-Cys@CDs@MIPs，并利用目標(biāo)化合物對新型L-Cys@CDs@MIPs猝滅效果進(jìn)行考察，結(jié)果表明，當(dāng)模板分子、功能單體與交聯(lián)劑比例為1∶3∶6時，L-Cys對新型L-Cys@CDs@MIPs的猝滅效果最好。本研究以期建立檢測復(fù)雜基質(zhì)中痕量L-Cys的方法，后續(xù)將繼續(xù)優(yōu)化其最優(yōu)檢測條件，為與L-Cys相關(guān)疾病的預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。