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    穩(wěn)定劑對不同藥物納米混懸劑性質(zhì)的影響

    2022-10-21 05:45:16呂亞男王琳琳綦玉潔王愛萍
    關(guān)鍵詞:懸劑離子型穩(wěn)定劑

    呂亞男,王琳琳,綦玉潔,王愛萍,

    (1.煙臺大學(xué)藥學(xué)院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學(xué)),新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺,264005;2.山東綠葉制藥有限公司長效和靶向制劑國家重點實驗室,山東 煙臺 264003)

    隨著組合化學(xué)及高通量篩選技術(shù)的廣泛應(yīng)用,越來越多的活性化合物被發(fā)現(xiàn),但40%以上的化合物因水溶性差而生物利用度較低[1]。納米混懸劑(Nanosuspension,NS)是由藥物顆粒和穩(wěn)定劑組成的納米膠體分散體系,具有載藥量高、副作用小、放大方便等優(yōu)點[2]。

    在納米混懸劑的制備及儲存過程中藥物容易發(fā)生沉降、聚集、晶體生長和晶型轉(zhuǎn)變等現(xiàn)象,這導(dǎo)致了納米混懸劑的不穩(wěn)定[3]。解決穩(wěn)定性問題常用方法是加入穩(wěn)定劑[4],穩(wěn)定劑一般分為非離子型表面活性劑、離子型表面活性劑、聚合物穩(wěn)定劑和其他穩(wěn)定劑[2],離子型表面活性劑通過靜電斥力穩(wěn)定混懸劑[3],而聚合物和非離子表面活性劑通過空間斥力提高混懸液的穩(wěn)定性[5]。穩(wěn)定劑的選擇是制備納米混懸劑的關(guān)鍵,藥物的疏水性、化學(xué)結(jié)構(gòu)、酸堿性以及穩(wěn)定劑的分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)、表面張力、粘度、親水親油值等均可能影響納米混懸劑的穩(wěn)定性[6]。

    本研究采用介質(zhì)研磨的方法制備納米混懸劑,以不同疏水性的弱酸性藥物美洛昔康(MLX)和弱堿性藥物多奈哌齊(DPZ)作為模型藥物,分別與不同類型(非離子型表面活性劑、離子型表面活性劑、親水性聚合物)的穩(wěn)定劑進行組合制備納米混懸劑。探索不同性質(zhì)的藥物及穩(wěn)定劑對納米混懸劑粒徑、電位、形態(tài)、晶型、體外釋放及穩(wěn)定性等的影響,為納米混懸劑中穩(wěn)定劑的選擇提供參考。

    1 實驗部分

    1.1 儀器

    DYNO-MILL RL型球磨機(瑞士WEB公司);Hei-TORQUE Precision 400型頂置攪拌器(德國Heidolph公司);1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);3000型激光粒度儀(英國Mastersizer公司);Zetasizer Ultra型納米粒度電位儀(英國Mastersizer公司);Phenom XL型臺式掃描電子顯微鏡(荷蘭 Phenom公司);G20型透射電子顯微鏡(美國FEI公司);D2 PHASER型X射線衍射儀(德國Bruker公司);SW22型恒溫振蕩水浴搖床(德國Julabo公司);LUMiSizer 651型分散體系分析儀(德國LUM公司);FreeZone型凍干機(美國Labconco公司)。

    1.2 試藥與試劑

    美洛昔康(MLX,江蘇飛馬藥業(yè)有限公司);多奈哌齊(DPZ,上海畢得醫(yī)藥有限公司);吐溫80(Tween 80,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);泊洛沙姆188(P188,德國BASF SE公司);十二烷基硫酸鈉(SDS,湖南爾康制藥股份有限公司);脫氧膽酸鈉(NaDC,上海麥克林生化科技有限公司);聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);羥丙甲基纖維素(HPMC,上海麥克林生化科技有限公司);乙酸銨(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);三乙胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);冰醋酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);甲醇(色譜純,德國Merck KGaA公司)。

    1.3 HPLC色譜條件

    MLX:采用Aglient-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,以甲醇-0.2 mol/L乙酸銨水溶液(60:40)為流動相,進樣量10 μL,柱溫37 ℃,流速1 mL/min,檢測波長360 nm。

    DPZ:采用Aglient-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,以甲醇-水(含1%三乙胺,0.5%冰醋酸)(65∶35)為流動相,進樣量20 μL,柱溫36 ℃,流速1 mL/min,檢測波長316 nm。

    1.4 納米混懸劑的制備

    采用介質(zhì)研磨法制備納米混懸劑,將藥物在400 r/min下分散在質(zhì)量分數(shù)為1%的穩(wěn)定劑水溶液中,攪拌30 min得質(zhì)量分數(shù)為1%的藥物初混懸液。采用0.4 mm的研磨珠,設(shè)定球磨機轉(zhuǎn)速為1500 r/min,研磨一定時間得粒徑為500 nm的混懸劑,研磨2 h得最終納米混懸劑。

    將納米混懸劑置于室溫下保存待用,另取少量混懸劑進行水洗離心去除輔料后冷凍干燥,凍干粉用于形態(tài)、晶型的檢測。

    1.5 納米混懸劑的表征

    1.5.1 粒度與Zeta電位 取適量混懸劑樣品稀釋至遮光率為6%左右,于激光粒度分析儀中測定粒度;取適量混懸劑樣品稀釋為0.01 mg/mL的溶液,于納米粒度電位儀中測量Zeta電位。

    1.5.2 形態(tài) 取適量的混懸劑凍干粉于導(dǎo)電膠樣品板上,噴金后于掃描電子顯微鏡(SEM)上觀察其形態(tài);取適量混懸劑離心后取其上清液,磷鎢酸染色后于透射電子顯微鏡上觀察輔料形態(tài)。

    1.5.3 晶型 取適量已凍干的混懸劑樣品置于樣品板中,置于X射線衍射儀(XRD)中分析,以0.02步長和5 °/min的掃描速度為檢測條件,記錄5 °~40 °下的衍射圖。

    1.5.4 體外釋放度 取0.5 mL粒徑為500 nm的納米混懸劑置于透析袋中(14 kU),以40 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液為釋放介質(zhì),設(shè)定恒溫振蕩器的轉(zhuǎn)速為50 r/min,溫度為37.5 ℃。在0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h取樣1 mL,補加1 mL同等溫度下的釋放介質(zhì),按照“1.3”項下的HPLC條件測定并計算MLX及DPZ的累計釋放量。

    1.6 穩(wěn)定性

    1.6.1 短期穩(wěn)定性 將制備好的混懸劑25 ℃下儲存,于0、7、14、30 d測定粒度的變化情況,考察制劑的短期穩(wěn)定性。

    1.6.2 加速沉降穩(wěn)定性 采用LUM分散體系分析儀,取適量混懸劑樣品加入樣品管中,設(shè)定轉(zhuǎn)速為2000 r/min,溫度為25 ℃,時間為2.5 h,考察在離心加速條件下納米混懸劑的沉降速度。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 藥物及穩(wěn)定劑的理化性質(zhì)

    選用弱酸性藥物MLX和弱堿性藥物DPZ作為模型藥物,其中MLX在水中溶解度為266 μg/mL,DPZ在水中溶解度為2.93 μg/mL,兩者均為難溶性藥物,但MLX在水中溶解度高于DPZ。

    常用的穩(wěn)定劑一般分為非離子型表面活性劑、離子型表面活性劑和聚合物穩(wěn)定劑,本研究選用兩種HLB值不同的非離子表面活性劑Tween 80和P188,兩種不同類型的陰離子型表面活性劑SDS和NaDC,以及半合成及合成高分子親水性聚合物穩(wěn)定劑HPMC和PVP,考察不同類型穩(wěn)定劑對不同性質(zhì)藥物納米混懸劑的影響。

    2.2 不同穩(wěn)定劑對納米混懸劑粒度及電位的影響

    MLX-NS及DPZ-NS的d50隨研磨時間的變化結(jié)果見圖1,研磨2 h粒徑及Zeta電位結(jié)果見表1。以非離子表面活性劑Tween 80為穩(wěn)定劑制備的MLX-NS和DPZ-NSd50為250及380 nm,研磨效果較好,而以P188為穩(wěn)定劑制備的DPZ-NS呈絮狀,顆粒產(chǎn)生聚集。這可能與Tween 80和P188的疏水性相關(guān),Tween 80的HLB值為15,而P188的HLB值為29,親水性較強,穩(wěn)定劑的疏水性越高對藥物顆粒的親和性越好[6]。以離子型表面活性劑SDS為穩(wěn)定劑制備DPZ-NS的d50為600 nm,粒徑較大,這可能是由于SDS的十二烷基鏈的高溶解度和疏水性不足,導(dǎo)致其側(cè)鏈在溶解度較差的DPZ顆粒表面上的親和力不足[7]。以NaDC為穩(wěn)定劑制備的兩種混懸劑粒徑下降趨勢最快,但隨著研磨時間延長,MLX-NS粒度先減小后又增長,且呈粘稠狀,而DPZ-NS中則未觀察到此現(xiàn)象,這可能由于弱酸性的MLX使混懸劑的pH值降低,使NaDC膠束聚集并形成棒狀或球狀聚集體,從而引起溶液的粘度增加[8-9]。因此,研究對NaDC為穩(wěn)定劑的MLX-NS進行離心,得到粘稠狀的上清液進行TEM檢測,結(jié)果如圖2所示,上清液中存在棒狀或球狀膠束聚集體,與文獻報道一致。以親水性聚合物PVP為穩(wěn)定劑制備的DPZ-NS粒度先減小后又增大,這可能是由于DPZ疏水性強,研磨過程中隨著粒度下降,穩(wěn)定劑不足以穩(wěn)定增大的比表面積而導(dǎo)致混懸劑粒度聚集增大[10];以親水性聚合物HPMC為穩(wěn)定劑研磨的兩種納米混懸劑的Span值偏大,可能由于高粘度HPMC對于研磨珠的動能產(chǎn)生一定阻礙效果,顆粒不能被充分研磨從而導(dǎo)致粒度分布不均勻[11]。

    圖1 不同穩(wěn)定劑制備的納米混懸劑在研磨過程中粒徑變化(n=3)

    表1 不同穩(wěn)定劑制備的納米混懸劑的粒度分布及Zeta電位

    圖2 上清液中的NaDC聚集體的透射電鏡圖

    由表1可知,以非離子型表面活性劑Tween80制備的MLX-NS及DPZ-NS的Zeta電位均高于20 mV,而以P188制備的DPZ-NS的電位為-16.1 mV,不利于混懸液穩(wěn)定[12],與DPZ-NS的研磨粒度結(jié)果相符,顆粒產(chǎn)生聚集;離子型表面活性劑制備的混懸劑Zeta電位最高,SDS及NaDC為陰離子型穩(wěn)定劑自身Zeta電位值偏高;以親水性聚合物制備的混懸劑Zeta電位最小,這是由于聚合物對顆粒表面形成吸附層,增加了從顆粒表面到切邊面的距離所致。

    2.3 不同穩(wěn)定劑對納米混懸劑形態(tài)的影響

    對以不同穩(wěn)定劑制備的d50接近500 nm的混懸劑水洗凍干后的SEM檢測結(jié)果如圖3所示。采用介質(zhì)研磨法制備的MLX-NS及DPZ-NS的形態(tài)無明顯差異,多為類球形顆粒,表明不同種類穩(wěn)定劑對于MLX-NS及DPZ-NS在研磨過程中的形態(tài)無顯著影響。

    圖3 不同穩(wěn)定劑制備的納米混懸劑掃描電鏡圖

    2.4 不同穩(wěn)定劑對納米混懸劑晶型的影響

    在研磨過程中由于高能量機械力對藥物的作用,藥物晶體可能會發(fā)生轉(zhuǎn)晶現(xiàn)象。晶型不同會影響納米混懸劑的溶解度和溶出速率,從而影響制劑在體內(nèi)的釋藥行為,此外不穩(wěn)定的晶型在制備和儲存過程中傾向于向更穩(wěn)定的晶型轉(zhuǎn)化[13]。因此,對不同穩(wěn)定劑下的MLX-NS與DPZ-NS晶型進行XRD檢測,結(jié)果如圖4所示。MLX-NS與DPZ-NS納米混懸劑的衍射峰與原料藥相比角度相同但強度有所減小,這說明兩種納米混懸劑的晶型未發(fā)生改變,其中衍射峰強度的減小可能是由于粒度差異造成的各向異性。

    圖4 不同穩(wěn)定劑制備的納米混懸劑的XRD圖

    2.5 不同穩(wěn)定劑對納米混懸劑體外釋放的影響

    體外釋放結(jié)果(圖5)顯示,MLX-NS的體外釋放速度明顯快于DPZ-NS,在72 h內(nèi)均能完全釋放,但DPZ-NS未釋放完全,這是由于MLX在pH 7.4釋放介質(zhì)中的溶解度大于DPZ所致。

    由圖5(a)和(d)可知,以非離子型表面活性劑P188為穩(wěn)定劑制備的混懸劑釋放均快于以Tween 80制備的混懸劑,推測原因是P188的親水性強于Tween 80,其親水性表面導(dǎo)致釋放介質(zhì)更快滲透到顆粒中,從而使釋放加快[14]。由圖5(b)和(e)可知,以離子型表面活性劑SDS為穩(wěn)定劑制備的混懸劑釋放快于以NaDC制備的混懸劑,可能是SDS對兩種藥物具有強潤濕效果從而加速藥物的溶解。由圖5(c)和(f)可知,以親水性聚合物PVP和HPMC為穩(wěn)定劑制備的MLX-NS體外釋放無差異,而以PVP及HPMC為穩(wěn)定劑制備DPZ-NS的混懸劑釋放曲線相差較大,分析原因可能為HPMC粘度較高對藥物的釋放產(chǎn)生阻滯效果[15],使藥物的釋放速度慢于以PVP為穩(wěn)定劑的MLX-NS及DPZ-NS,但MLX與HPMC可形成氫鍵促進了MLX的釋放[16]。

    圖5 不同穩(wěn)定劑制備的納米混懸劑的的體外釋放曲線(n=3)

    2.6 不同穩(wěn)定劑對納米混懸劑穩(wěn)定性的影響

    2.6.1 儲存穩(wěn)定性 對不同穩(wěn)定劑制備的MLX-NS及DPZ-NS室溫放置測定其粒徑變化,結(jié)果如圖6所示。以非離子型表面活性劑Tween 80為穩(wěn)定劑制備的兩種納米混懸劑穩(wěn)定性較好,分析原因為穩(wěn)定劑疏水端吸附在藥物上親水尾段延伸到水中,當(dāng)吸附在顆粒表面的疏水層相互接近時,由于空間限制使得高分子鏈體系自由能增加而產(chǎn)生排斥作用以穩(wěn)定體系[3];以P188為穩(wěn)定劑制備的DPZ-NS由于P188對疏水性較強的DPZ親和力較弱,顆粒產(chǎn)生聚集不穩(wěn)定。在放置過程中,以離子型表面活性劑SDS和NaDC為穩(wěn)定劑制備的兩種混懸劑粒徑均增長穩(wěn)定性較差,可能是離子型表面活性劑的鏈長相對較短,研磨過程中可以迅速占據(jù)藥物產(chǎn)生的新表面,在降低粒徑的過程中提供了一種防止聚集的保護作用,但是在放置過程中缺乏維持粒子穩(wěn)定的作用[2]。以親水性聚合物PVP為穩(wěn)定劑制備的DPZ-NS放置過程中粒度增長較大,分析原因為缺乏吸附在疏水藥物表面的熱力學(xué)驅(qū)動力導(dǎo)致[17];以HPMC制備的DPZ-NS粒徑增長明顯,這是由于DPZ沒有極性基團,不能與HPMC形成分子間氫鍵來附著在藥物顆粒表面從而抑制晶體生長[18]。

    圖6 不同穩(wěn)定劑制備的納米混懸劑的粒徑穩(wěn)定性變化(n=3)

    2.6.2 加速沉降穩(wěn)定性 采用LUM分散體系分析儀考察納米混懸劑的加速沉降穩(wěn)定性,混懸劑在離心作用下獲得比常規(guī)放置更快的加速分離過程,只需數(shù)分鐘或數(shù)小時就可完成納米混懸劑的快速穩(wěn)定性評價。本研究旨在考察穩(wěn)定劑對加速沉降穩(wěn)定性的影響,為避免粒度對沉降過程產(chǎn)生影響,選擇粒度約為500 nm的不同穩(wěn)定劑制備的納米混懸劑進行加速沉降研究,結(jié)果如圖7所示。

    圖7 不同穩(wěn)定劑制備的納米混懸劑的顆粒沉降速度(n=3)

    結(jié)果表明,以非離子表面活性劑P188制備的DPZ-NS沉降速度較快,由于藥物顆粒產(chǎn)生聚集形成大顆粒,與放置穩(wěn)定性結(jié)果相符合。以離子型表面活性劑SDS制備的納米混懸劑的顆粒沉降速度均快于NaDC,可能由于NaDC分子量較大,分子結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜,對顆粒沉降具有一定的阻礙作用。以親水性聚合物HPMC制備的混懸劑沉降速度小,可能是HPMC為高粘度的聚合物對沉降過程產(chǎn)生阻礙。LUM分散體系分析儀僅通過模擬重力場下的沉降過程來預(yù)測產(chǎn)品的穩(wěn)定性,具有一定的指導(dǎo)意義,但由于納米混懸劑處于復(fù)雜體系中,因此需根據(jù)長期穩(wěn)定性結(jié)果綜合判斷。

    3 結(jié) 論

    本研究采用介質(zhì)研磨法制備了納米混懸劑,將3種不同類型(非離子型表面活性劑、離子型表面活性劑、親水性聚合物)的6種穩(wěn)定劑應(yīng)用于兩種不同理化性質(zhì)的藥物(美洛昔康和多奈哌齊),并對納米混懸劑進行體外評價。結(jié)果顯示非離子表面活性劑的選擇受到藥物疏水程度的影響,低HLB值的非離子表面活性劑對藥物的親和性較高,而高HLB值的非離子表面活性劑不適合疏水性較強的藥物多奈哌齊;離子型穩(wěn)定劑不能使混懸劑保持長時間的穩(wěn)定效果,藥物的酸堿性對pH敏感的離子表面活性劑產(chǎn)生影響;親水性聚合物PVP直接吸附到藥物表面穩(wěn)定顆粒,HPMC更適合具有極性基團的藥物美洛昔康。研究表明藥物及穩(wěn)定劑的理化性質(zhì)對形成穩(wěn)定的納米混懸劑具有顯著影響,為納米混懸劑中穩(wěn)定劑的選擇提供依據(jù)。

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